PL208060B1 - Nowe mikroorganizmy Rhodococcus sp., ekstrakty enzymów wyodrębniane z tych mikroorganizmów, hydrataza nitrylowa wytwarzana przez te mikroorganizmy oraz mikrobiologiczny sposób wytwarzania amidów, jak również zastosowania tych mikroorganizmów - Google Patents
Nowe mikroorganizmy Rhodococcus sp., ekstrakty enzymów wyodrębniane z tych mikroorganizmów, hydrataza nitrylowa wytwarzana przez te mikroorganizmy oraz mikrobiologiczny sposób wytwarzania amidów, jak również zastosowania tych mikroorganizmówInfo
- Publication number
- PL208060B1 PL208060B1 PL365921A PL36592102A PL208060B1 PL 208060 B1 PL208060 B1 PL 208060B1 PL 365921 A PL365921 A PL 365921A PL 36592102 A PL36592102 A PL 36592102A PL 208060 B1 PL208060 B1 PL 208060B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- rhodococcus
- nitrile hydratase
- activity
- acetonitrile
- cyanopyridine
- Prior art date
Links
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 title claims abstract description 12
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 title 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 172
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 60
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 125000000882 C2-C6 alkenyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 108010024026 Nitrile hydratase Proteins 0.000 claims description 116
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 claims description 76
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 3-pyridinecarbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CN=C1 GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 28
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 28
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 21
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 19
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 11
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 abstract description 3
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 124
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 17
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 13
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 12
- 241001522168 Amycolatopsis sp. Species 0.000 description 10
- -1 for example Chemical class 0.000 description 10
- KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N butyronitrile Chemical compound CCCC#N KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- WFKAJVHLWXSISD-UHFFFAOYSA-N isobutyramide Chemical compound CC(C)C(N)=O WFKAJVHLWXSISD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N propionitrile Chemical compound CCC#N FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N Methylacrylonitrile Chemical compound CC(=C)C#N GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- NKKMVIVFRUYPLQ-NSCUHMNNSA-N crotononitrile Chemical compound C\C=C\C#N NKKMVIVFRUYPLQ-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001869 cobalt compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- NHWQMJMIYICNBP-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzonitrile Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C#N NHWQMJMIYICNBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFNVQNRYTPFDDP-UHFFFAOYSA-N 2-cyanopyridine Chemical compound N#CC1=CC=CC=N1 FFNVQNRYTPFDDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N butanamide Chemical compound CCCC(N)=O DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 3
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 3
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950001902 dimevamide Drugs 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229940047889 isobutyramide Drugs 0.000 description 3
- LRDFRRGEGBBSRN-UHFFFAOYSA-N isobutyronitrile Chemical compound CC(C)C#N LRDFRRGEGBBSRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- IPWFJLQDVFKJDU-UHFFFAOYSA-N pentanamide Chemical compound CCCCC(N)=O IPWFJLQDVFKJDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- GPHQHTOMRSGBNZ-UHFFFAOYSA-N pyridine-4-carbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=NC=C1 GPHQHTOMRSGBNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBKOPFQCLSPTPV-YVMONPNESA-N (nz)-n-(pyridin-3-ylmethylidene)hydroxylamine Chemical compound O\N=C/C1=CC=CN=C1 YBKOPFQCLSPTPV-YVMONPNESA-N 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- WBUOVKBZJOIOAE-UHFFFAOYSA-N 3-chlorobenzonitrile Chemical compound ClC1=CC=CC(C#N)=C1 WBUOVKBZJOIOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GJNGXPDXRVXSEH-UHFFFAOYSA-N 4-chlorobenzonitrile Chemical compound ClC1=CC=C(C#N)C=C1 GJNGXPDXRVXSEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000187643 Amycolatopsis Species 0.000 description 2
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940127463 Enzyme Inducers Drugs 0.000 description 2
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTFJSAGADRTKCI-UHFFFAOYSA-N N-(pyridin-2-ylmethylidene)hydroxylamine Chemical compound ON=CC1=CC=CC=N1 MTFJSAGADRTKCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N Pentanenitrile Chemical compound CCCCC#N RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N adiponitrile Chemical compound N#CCCCCC#N BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N epsilon-caprolactam Chemical compound O=C1CCCCCN1 JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- QHDRKFYEGYYIIK-UHFFFAOYSA-N isovaleronitrile Chemical compound CC(C)CC#N QHDRKFYEGYYIIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940080818 propionamide Drugs 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N tuberculostearic acid Chemical compound CCCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UVKXJAUUKPDDNW-NSCUHMNNSA-N (e)-pent-3-enenitrile Chemical compound C\C=C\CC#N UVKXJAUUKPDDNW-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFMPMSCZPVNPEM-UHFFFAOYSA-N 2-bromobenzonitrile Chemical compound BrC1=CC=CC=C1C#N AFMPMSCZPVNPEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDHXJNRAJRCGMX-UHFFFAOYSA-N 2-fluorobenzonitrile Chemical compound FC1=CC=CC=C1C#N GDHXJNRAJRCGMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- YBKOPFQCLSPTPV-VMPITWQZSA-N 3-pyridine aldoxime Chemical compound O\N=C\C1=CC=CN=C1 YBKOPFQCLSPTPV-VMPITWQZSA-N 0.000 description 1
- 239000005725 8-Hydroxyquinoline Substances 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- CFEYBLWMNFZOPB-UHFFFAOYSA-N Allylacetonitrile Natural products C=CCCC#N CFEYBLWMNFZOPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical group N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N D-Cycloserine Chemical compound N[C@@H]1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N D-Cycloserine Natural products NC1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFYLBLSSPQTTHT-UHFFFAOYSA-N N-(pyridin-4-ylmethylidene)hydroxylamine Chemical compound ON=CC1=CC=NC=C1 OFYLBLSSPQTTHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L Tiron Chemical compound [Na+].[Na+].OC1=CC(S([O-])(=O)=O)=CC(S([O-])(=O)=O)=C1O ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- MFGSTSNUMVXOHJ-UHFFFAOYSA-M [I+].CC([O-])=O Chemical compound [I+].CC([O-])=O MFGSTSNUMVXOHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003869 acetamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010025442 aldoxime dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 150000008431 aliphatic amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ZRIUUUJAJJNDSS-UHFFFAOYSA-N ammonium phosphates Chemical class [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]P([O-])([O-])=O ZRIUUUJAJJNDSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical class [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L cobalt(2+) sulfate Chemical class [Co+2].[O-]S([O-])(=O)=O KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAHREYKOYSIQPH-UHFFFAOYSA-L cobalt(II) acetate Chemical class [Co+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O QAHREYKOYSIQPH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- DGJMPUGMZIKDRO-UHFFFAOYSA-N cyanoacetamide Chemical compound NC(=O)CC#N DGJMPUGMZIKDRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229940116901 diethyldithiocarbamate Drugs 0.000 description 1
- LMBWSYZSUOEYSN-UHFFFAOYSA-N diethyldithiocarbamic acid Chemical compound CCN(CC)C(S)=S LMBWSYZSUOEYSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- VFQXVTODMYMSMJ-UHFFFAOYSA-N isonicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=NC=C1 VFQXVTODMYMSMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- CUONGYYJJVDODC-UHFFFAOYSA-N malononitrile Chemical compound N#CCC#N CUONGYYJJVDODC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229960003540 oxyquinoline Drugs 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- IBBMAWULFFBRKK-UHFFFAOYSA-N picolinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=N1 IBBMAWULFFBRKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- PBEXQBWLOXMXCU-UHFFFAOYSA-N pyridine-3-carbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CN=C1.N#CC1=CC=CN=C1 PBEXQBWLOXMXCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STWNGMSGPBZFMX-UHFFFAOYSA-N pyridine-3-carboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1.NC(=O)C1=CC=CN=C1 STWNGMSGPBZFMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000001054 red pigment Substances 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- LDHQCZJRKDOVOX-UHFFFAOYSA-N trans-crotonic acid Natural products CC=CC(O)=O LDHQCZJRKDOVOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 229940046001 vitamin b complex Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy nowych mikroorganizmów Rhodococcus sp., ekstraktów enzymów wyodrębnianych z tych mikroorganizmów, hydratazy nitrylowej wytwarzanej przez te mikroorganizmy oraz mikrobiologicznego sposobu wytwarzania amidów z wykorzystaniem powyższych mikroorganizmów lub ekstraktów enzymów bądź enzymu, jak również zastosowania tych mikroorganizmów.
Znanych jest już wiele biotechnologicznych sposobów wytwarzania amidów takich jak, przykładowo nikotynamid (amid kwasu nikotynowego) - witamina w grupie witaminy B complex, która jest istotna dla zwierząt i ludzi.
Przykładowo, EP-A 0 307 926 opisuje przemianę 3-cyjanopirydyny do nikotynamidu z wykorzystaniem Rhodococcus rhodochrous J1. Sposób ten ma tę wadę, że Rhodococcus rhodochrous J1 jest zabarwiony na czerwono, w konsekwencji czego także produkt ma zmienioną barwę. Ponadto, wspomniany mikroorganizm ma wysoką wartość KM względem wyjściowej 3-cyjanopirydyny, niską tolerancję względem temperatury i niską tolerancję względem 3-cyjanopirydyny.
WO 99/05306 dla przykładu, opisuje sposób wytwarzania nikotynamidu, w którym związkiem wyjściowym jest odpowiedni nitryl, za pomocą mikroorganizmów rodzajów Rhodococcus, Amycolatopsis i Actinomadura. Sposób ten ma tę wadę, że stosowane mikroorganizmy rodzaju Amycolatopsis są inaktywowane w podwyższonych temperaturach. Ponadto, wspomniane mikroorganizmy wykazują niską tolerancję względem 3-cyjanopirydyny i nikotynamidu. Opisane mikroorganizmy rodzaju Rhodococcus mają wysoką wartość KM względem 3-cyjanopirydyny i niską trwałość temperaturową. Z tych względów, sposób ten nie jest ekonomiczny w warunkach przemysłowych.
Celem niniejszego wynalazku było zapewnienie mikroorganizmów, które są względnie trwałe, mają stosunkowo niską wartość KM, przykładowo, względem wyjściowej 3-cyjanopirydyny, mogą, zatem być stosowane w bardziej ekonomicznym sposobie wytwarzania amidów, w którym odpowiedni amid może być wyodrębniony z bardzo dobrą wydajnością, przy wysokiej czystości.
Cel ten osiągnięto dzięki opracowaniu rozwiązania według wynalazku.
Wynalazek dotyczy mikroorganizmów ze szczepu oznaczonego jako Rhodococcus sp. FZ4, zdeponowanego pod numerem DSM 13597.
Mikroorganizmy według wynalazku są zdolne do tolerowania acetonitrylu w stężeniu co najmniej 3 M. Są one także zdolne do przereagowania 3-cyjanopirydyny z wytworzeniem nikotynoamidu.
W mikroorganizmach według wynalazku występują kwasy mykolowe o długości łańcucha C48.
Wynalazek obejmuje także ekstrakty enzymów, otrzymywalne z wyżej określonych mikroorganizmów.
W szczególności wynalazek dotyczy hydratazy nitrylowej, otrzymywanej z wyżej określonych mikroorganizmów.
Hydrataza nitrylowa według wynalazku ma
a) wartość KM 2,84 ± 1,00 mM dla acetonitrylu jako substratu oraz 80,5 ± 15,0 mM dla 3-cyjanopirydyny jako substratu;
b) optimum pH 6,5 ± 1,0;
c) masę cząsteczkową 465 ± 50 oznaczaną metodą HPLC i obejmuje α-podjednostkę oraz β-podjednostkę.
Sposób wytwarzania amidów o wzorze ogólnym 3, w którym R1 oznacza C1-6-alkil, C2-6-alkenyl lub grupę o wzorze ogólnym 4, w którym X oznacza atom azotu lub -CH=, każdy z podstawników R2 i R3 oznacza niezależnie atom wodoru, atom chlorowca, C1-6-alkil lub C2-6-alkenyl, według wynalazku polega na tym, że nitryl o wzorze ogólnym 2, w którym R1 ma wyżej określone znaczenie, poddaje się przekształceniu stosując wyżej określony mikroorganizm, ekstrakt enzymu lub enzym.
W sposobie według wynalazku jako nitryl stosuje się 3-cyjanopirydynę lub acetonitryl.
Zgodnie z wynalazkiem reakcję prowadzi się w temperaturze od 5 do 50°C i przy pH od 5 do 10.
Wynalazek dotyczy także zastosowania wyżej określonych mikroorganizmów do usuwania odpadów acetonitrylu.
Mikroorganizmy według wynalazku można otrzymać przez odpowiedni wybór, przykładowo z próbek gleby, szlamu lub ścieków, z pomocą powszechnie dostępnych technik mikrobiologicznych. Wspomniane mikroorganizmy zostały dogodnie wyodrębnione przez namnażanie z pirydynaldoksymem o wzorze ogólnym 1 lub z nitrylami jako źródłem węgla, w obecności jonów kobaltu i przykładowo ekstraktu drożdży i/lub soli amonowych. Następnie z otrzymanych hodowli wyodrębnia się te miPL 208 060 B1 kroorganizmy, które są zdolne do tolerowania stężenia acetonitrylu co najmniej 3 M oraz do przekształcenia nitrylu, takiego jak przykładowo 3-cyjanopirydyna i acetonitryl, w odpowiedni amid.
Pirydynaldoksymami, które można zastosować są pirydyn-2-, pirydyn-3- lub pirydyn-4-aldoksym.
W toku wyodrębniania, odpowiednimi nitrylami s ą w szczególności także te, które są przewidziane do stosowania jako substraty w późniejszej biotransformacji, przykładowo acetonitryl (nitryl kwasu octowego), propionitryl, butyronitryl, nitryl kwasu krotonowego, nitryl kwasu adypinowego i nitryl kwasu malonowego.
Korzystne źródła jonów kobaltu to tak zwane związki kobaltu tworzące jony kobaltu, przykładowo sole Co2+ lub Co3+ takie jak chlorki kobaltu, siarczany kobaltu i octany kobaltu. Korzystnym związkiem kobaltu jest sól Co2+, taka jak przykładowo CoCl2. Jednak, namnażanie można także prowadzić w kombinacji z metalicznym kobaltem lub z innymi związkami kobaltu. Zazwyczaj, kobalt lub związki kobaltu są stosowane w pożywce do namnażania w ilości od 1 do 30 mg/L, korzystnie od 1 do 20 mg/L.
Przykładami soli amonowych, które można zastosować są fosforany amonu, takie jak (NH4)2HPO4 lub (NH4)H2PO4.
Mikroorganizmy są hodowane w odpowiednich pożywkach przed faktyczną biotransformacją. Przykładami odpowiednich pożywek do hodowli są pożywki opisane w tablicach 3 i 5.
Namnażanie jest zazwyczaj prowadzone w temperaturze od 20 do 40°C i przy pH między 5 i 8, korzystnie w temperaturze od 25 do 35°C i przy pH między 6 i 7,5.
Korzystnie, podczas namnażania indukowane są aktywne enzymy, tj. hydratazy nitrylowe, przez dodanie induktora enzymu.
Jako induktory enzymu, można zastosować nasycone lub nienasycone alifatyczne nitryle lub odpowiednie amidy. Alifatyczne nitryle, które można zastosować to wszelkie C2-7-alkanonitryle, takie jak przykładowo butyronitryl, izobutyronitryl, waleronitryl lub izowaleronitryl, lub C3-7-alkenonitryl, taki jak przykładowo metakrylonitryl lub krotononitryl. Alifatyczne amidy, które można użyć to dowolne C2-7-alkanamidy, takie jak przykładowo butyramid, izobutyramid, waleramid lub propionamid, lub C3-7-alkenamidy, takie jak przykładowo metakrylamid lub krotonamid. Korzystnymi induktorami enzymów są metakrylamid, butyramid, izobutyramid, waleramid, metakrylonitryl, krotonamid, butyronitryl i izobutyronitryl. Szczególne pierwszeń stwo jest dane stosowaniu metakrylonitrylu jako induktora enzymu.
Mikroorganizmy według wynalazku tolerują stężenie acetonitrylu co najmniej 3 M. Oznacza to, że aktywność enzymu jest trwała po inkubowaniu przez 1 h w 3 M roztworze acetonitrylu, w 0,1 M buforze fosforanu potasu przy pH 7,0 i w 20°C, tj., że następuje utrata nie więcej niż 10% aktywności. Korzystne mikroorganizmy tolerują stężenie acetonitrylu co najmniej 6 M przez 1 h w wyżej wymienionych warunkach, z utratą nie więcej niż 50% aktywności. Szczególnie korzystne mikroorganizmy tolerują stężenie acetonitrylu co najmniej 9 M przez 1 h we wspomnianych warunkach, z utratą nie więcej niż 70% aktywności.
W bardzo szczególnie korzystnych mikroorganizmach, aktywność enzymu jest trwała nawet po szeregu minutach inkubowania w 15 M i 19 M acetonitrylu (co odpowiada czystemu acetonitrylowi). Utrata aktywności enzymu po 10 min inkubowania z zastosowaniem 15 M acetonitrylu jest mniejsza niż 10%.
Mikroorganizmy według wynalazku wykazują wysoką trwałość termiczną, to znaczy wyższą trwałość w wysokich temperaturach niż mikroorganizmy znane dotychczas. Utrata aktywności enzymatycznej mikroorganizmów według wynalazku jest korzystnie nie większa niż 10% po inkubowaniu w 0,1 M buforze fosforanu potasu, pH 7,0 w 60°C przez 1 h, a utrata aktywności enzymatycznej po inkubowaniu we wspomnianych warunkach przez 2 h jest nie większa niż 40%.
Termin „aktywność enzymatyczna oznacza tu aktywność hydratazy nitrylowej, w szczególności aktywność hydratazy nitrylowej względem 3-cyjanopirydyny jako substratu.
Dalszymi właściwościami mikroorganizmów według wynalazku są wysoka tolerancja względem korzystnie stosowanego związku wyjściowego - 3-cyjanopirydyny i względem wytworzonego zeń produktu - nikotynamidu oraz niższa wartość KM względem 3-cyjanopirydyny. Inną, szczególnie doniosłą właściwością jest to, że mogą one akumulować acetamid w stężeniu wyższym niż stężenie nasyconego roztworu acetamidu w 30°C (około 220-230 g acetamidu w 100 mL wody).
Korzystne mikroorganizmy należą do rodzaju Rhodococcus. Szczególnie korzystne mikroorganizmy to szczep Rhodococcus sp. FZ4 oraz ich funkcjonalne odmiany równoważne czynnościowo oraz mutanty. Termin „równoważne czynnościowo odmiany i mutanty oznacza takie odmiany i mutan4
PL 208 060 B1 ty, które tolerują stężenia acetonitrylu co najmniej 3 M. W szczególności pierwszeństwo jest dane „pigmentowo-negatywnym szczepom Rhodococcus, tj. szczepom pozbawionym czerwonego koloru, który może powodować zmianę zabarwienia żądanego produktu. Szczepy takie można, gdy jest to pożądane, łatwo uzyskać z mikroorganizmów wytwarzających pigmenty przez mutagenezę za pomocą promieniowania UV lub mutagennych związków chemicznych.
Szczep Rhodococcus sp. FZ4 zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig pod numerem depozytu DSM 13597 dnia 11 lipca 2000, zgodnie z Układem Budapeszteńskim. Niemożliwe było zaklasyfikowanie tego mikroorganizmu na podstawie jego danych identyfikacyjnych do jakiegokolwiek z uprzednio znanych gatunków Rhodococcus, a zatem został on sklasyfikowany jako nowy gatunek.
Równoważne czynnościowo odmiany i mutanty szczepu Rhodococcus sp. FZ4 można wytworzyć bądź przez mutację spontaniczną lub przykładowo przez napromieniowanie UV lub mutagenne związki chemiczne. Korzystne odmiany i mutanty szczepu Rhodococcus sp. FZ4 są „pigmentowo-negatywne, tj. nie mają czerwonego koloru, który może prowadzić do zmiany zabarwienia żądanego produktu.
Ekstrakt enzymu można otrzymać przykładowo przez rozrywanie komórek mikroorganizmów, przykładowo za pomocą ultradźwięków, prasy francuskiej lub metodą lizozymową.
Enzymy według wynalazku wykazujące aktywność hydratazy nitrylowej można otrzymać z wyżej opisanych mikroorganizmów według wynalazku. Są one korzystnie otrzymywane z mikroorganizmu Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597).
Enzymy te mają, w szczególności, następujące właściwości:
a) wartość Km 2,84 ± 1,00 mM względem wyjściowego acetonitrylu i 80,5 ± 15,0 mM względem wyjściowej 3-cyjanopirydyny, w każ dym przypadku w 0,05 M buforze fosforanu potasu, pH 7,0 w 20°C;
b) optymalne pH 6,5 ± 1,0 w 20°C w 0,05 M buforze fosforanu potasu.
W szczególności, enzymy te mają
c) naturalną masę cząsteczkową 465 ± 50, oznaczoną metodą HPLC.
Faktyczną biotransformację można prowadzić stosując wyżej opisane mikroorganizmy, ekstrakt enzymu ze wspomnianych mikroorganizmów lub wyodrębniony enzym. Pierwszeństwo daje się prowadzeniu biotransformacji z wykorzystaniem mikroorganizmu Rhodococcus sp. FZ4.
1
Substratami, które można stosować do biotransformacji są nitryle o wzorze ogólnym 2: R1-CN, w którym podstawnik R1 oznacza C1-6-alkil, C2-6-alkenyl lub grupę o wzorze ogólnym 4, w którym 23
X oznacza atom azotu lub -CH=, a każ dy z podstawników R2 i R3 oznacza niezależ nie atom wodoru, atom chlorowca, C1-6-alkil lub C2-6-alkenyl.
Jako „C1-6-alkil można wykorzystać metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, tert-butyl, izobutyl, pentyl i jego izomery, i heksyl i jego izomery. Przykładowy C2-6-alkenyl, nadający się do wykorzystania to: winyl, allil, 1-propen-1-yl i 1-propen-2-yl.
Atomami chlorowca, które mogą być użyte są F, Cl, Br lub I.
Korzystnymi przykładami nitryli o wzorze ogólnym 2 są: acetonitryl, butyronitryl, akrylonitryl, propionitryl, krotononitryl, 2-cyjanopirydyna, 3-cyjanopirydyna, 4-cyjanopirydyna, benzonitryl, fluorobenzonitryl, chlorobenzonitryl i bromobenzonitryl. Najbardziej korzystnymi substratami są acetonitryl i 3-cyjanopirydyna.
Biotransformację korzystnie prowadzi się przy jednorazowym (rzutowym) lub ciągłym dodawaniu substratu. Jak wiadomo biegłym w sztuce, stosowane stężenie substratu zależy od rozpuszczalności stosowanego substratu.
Korzystny sposób realizacji obejmuje wykorzystania komórek spoczywające (nie rosnące).
Pożywkami, które można użyć do biotransformacji są pożywki znane ze stanu techniki, przykładowo niskomolowe bufory fosforanowe, bufor HEPES, bufor cytrynianowy i bufor boranowy. Termin „niskomolowy bufor fosforanowy oznacza korzystnie 0,01 do 0,5 M bufor fosforanowy, szczególnie korzystnie 0,05 do 0,25 M bufor fosforanowy.
Korzystnie, biotransformację prowadzi się w temperaturze od 5 do 50°C, szczególnie korzystnie w temperaturze od 20 do 40°C. Korzystne pH jest między 5 i 10, szczególnie korzystne między 6 i 7,5.
Po przekształceniu nitrylu o wzorze ogólnym 2, można następnie wyodrębnić odpowiedni amid o wzorze ogólnym 3, w którym R1 ma wyż ej okreś lone znaczenie, ewentualnie po usunię ciu komórek, stosując typowe sposoby obróbki, takie jak przykładowo krystalizację lub suszenie rozpyłowe.
PL 208 060 B1
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania wyżej opisanych mikroorganizmów, w szczególności rodzaju Rhodococcus, do utylizacji odpadów acetonitrylu.
Acetonitryl jest rozpuszczalnikiem, który jest stosowany przykładowo w HPLC i który, ostatecznie, trzeba zagospodarowywać jako odpad. Do celów usuwania odpadów acetonitrylu zgodnie z wynalazkiem, acetonitryl może być obecny w stężeniu do maksymalnie 19 M, które odpowiada czystemu acetonitrylowi. Korzystnie, stosuje się roztwór lub zawiesinę od 0,25 to 15,0 M, korzystnie od 1 do 10 M acetonitrylu.
Korzystnie, aby usunąć odpady acetonitrylu, stosuje się powyższe mikroorganizmy w temperaturze od 5 do 50°C, korzystniej - w temperaturze od 20 do 40°C. pH korzystnie wynosi między 5 i 10, korzystnie między 6 i 8.
Czas trwania procesu przekształcenia acetonitrylu do acetamidu celem utylizacji odpadów zależy od stężenia acetonitrylu i wynosi przykładowo około 2 h w wypadku wytwarzania roztworu//zawiesiny 9,5 M acetamidu przy pH 7,0 i w temperaturze około 20°C.
Identyfikacja szczepu FZ4 (DSM 13597):
A) Markery chemotaksonomiczne:
1. diagnostyczny aminokwas peptydoglikanu: kwas mezo-diaminopimelowy
2. kwasy mikolowe: są obecne kwasy mikolowe o długości łańcucha od C40 do C48
3. schematy (szablony) kwasów tłuszczowych: są obecne liniowe, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe oraz duży udział kwasu tuberkulostearynowego. Na podstawie schematów kwasów tłuszczowych, szczep FZ4 zidentyfikowano jako należący do rodzaju Rhodococcus.
B) Markery konwencjonalne:
Makroskopowy wygląd i morfologia komórek szczepu FZ4 były podobne do Rhodococcus rhodochrous. Kolonie szczepu FZ4 były łososiowo-czerwone (RAL 3022), a młode hodowle rozwinęły rozgałęzione strzępki grzybni, które rozwinęły się w pałeczki i ziarniaki.
Dzięki markerom chemotaksonomicznym i konwencjonalnym, szczep FZ4 zidentyfikowano jako należący do gatunku Rhodococcus rhodochrous, lecz mający niski współczynnik korelacji.
C) Analiza pierwszych 500 zasad 16s rDNA
Sekwencja pierwszych 500 zasad 16S rDNA ujawniła podobieństwo jedynie w 97,7% do typowego przykładu szczepu gatunków Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 i 99,1% do innego szczepu odniesienia Rhodococcus rhodochrous. Ponieważ podobieństwo sekwencji pierwszych 500 zasad 16S rDNA szczepu FZ4 do szczepu Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 było poniżej 99,5%, było niemożliwe zidentyfikowanie szczepu FZ4 jako członu gatunków Rhodococcus rhodochrous.
Tak więc szczep FZ4 zidentyfikowano jako nowy gatunek w rodzaju Rhodococcus.
Krótki opis rysunków: Rhodococcus sp
Fig. 1 przedstawia biotransformację acetonitrylu do acetamidu stosując komórki spoczywające
FZ4.
Fig. 2 przedstawia optymalne temperatury aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w komórkach spoczywających.
Fig. 3 przedstawia termiczną stabilność aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w komórkach spoczywają cych.
Fig. 4 przedstawia optymalne pH dla aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w komórkach spoczywają cych.
Fig. 5 przedstawia stabilność aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w komórkach spoczywających względem pH.
Fig. 6 przedstawia tolerancję względem 3-cyjanopirydyny aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w komórkach spoczywających.
Fig. 7 przedstawia tolerancję względem nikotynamidu aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w komórkach spoczywających.
Fig. 8 przedstawia wpływ stężenia acetonitrylu na aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w komórkach spoczywających w procesie biotransformacji acetonitrylu do acetamidu.
Fig. 9 przedstawia wpływ stężenia acetonitrylu na aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w komórkach spoczywających.
Fig. 10 przedstawia aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w komórkach spoczywających jako funkcję stężenia 3-cyjanopirydyny.
PL 208 060 B1
Fig. 11 przedstawia wykres logarytmiczny mas cząsteczkowych hydratazy nitrylowej i białek referencyjnych w funkcji odpowiedniego czasu retencji HPLC.
Fig. 12 przedstawia wykres logarytmiczny mas cząsteczkowych podjednostek hydratazy nitrylowej i białek referencyjnych w funkcji odpowiedniej wartości SDA Page RF.
Fig. 13 przedstawia aktywność oczyszczonej hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w funkcji stężenia 3-cyjanopirydyny.
Fig. 14 przedstawia aktywność oczyszczonej hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w funkcji stężenia acetonitrylu.
Fig. 15 przedstawia trwałość termiczną oczyszczonej hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4.
Fig. 16 przedstawia optymalne pH oczyszczonej hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4.
Fig. 17 przedstawia trwałość względem pH oczyszczonej hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4.
P r z y k ł a d 1. Oznaczenie aktywności hydratazy nitrylowej
Aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono przez inkubowanie mieszaniny reakcyjnej obejmującej 3-cyjanopirydynę (1,0 M; 1,0 mL), bufor fosforanu potasu (0,1 M, pH 7,0; 0,5 mL) i zawiesinę komórek (0,5 mL) przy ciągłym mieszaniu całość w 20°C przez 5 min. Reakcję zatrzymano przez dodanie HCl (5 M; 0,1 mL). Po przesączeniu (filtr 0,2 um) mieszaniny reakcyjnej, oznaczono ilość wytworzonego nikotynamidu metodą HPLC (Waters Spherisorb 5 μ ODS2 (4,6 x 150 mm); KH2PO4/H3PO4 (10 mM; pH 2,8)/acetonitryl = 9:1 (v/v); 1 mL/min; 230 nm). Całkowitą aktywność wyrażono jako ilość umoli wytworzonego nikotynamidu/(min x mL) a aktywność właściwą wyrażono jako ilość umoli nikotynamidu wytworzonego/(min x mL x OD610 nm).
P r z y k ł a d 2. Wyodrębnienie szczepu Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597)
W Arch. Mikrobiol. 1998. 170, 85-90 opisano szczep Rhodococcus sp. YH3-3 (TPU 3453) metabolizujący 3-pirydynaldoksym przez 3-cyjanopirydynę i nikotynamid do kwasu nikotynowego. W tym wypadku, aktywność dehydratazy aldoksymu, a także aktywność hydratazy nitrylowej i aktywność amidazy szczepu Rhodococcus sp. YH3-3 (TPU 3453) była indukowana przez obydwa aldoksymy i nitryle.
Pożywkę wzbogaconą zgodnie z danymi z tablicy 1 szczepiono różnymi próbkami gleby, a następnie inkubowano w 37°C przez 7 do 10 dni. Tak otrzymane hodowle przeniesiono do tej samej pożywki i hodowano ponownie w 37°C jeszcze przez 7 do 10 dni. Tę procedurę powtórzono trzy razy. Następnie, hodowle rozcieńczono i posiano. Po inkubowaniu płytek w 37°C przez 5 dni, otrzymano indywidualne kolonie. Indywidualne kolonie zbadano na obecność aktywności hydratazy nitrylowej według przykładu 1. W ten sposób, wyodrębniono szczep Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597). Jest także możliwe stosowanie nitrylu (jak acetonitryl, propionitryl, butyronitryl, krotononitryl, adyponitryl i malononitryl) jako źródeł węgla zamiast 3-pirydynaldoksymu.
T a b l i c a 1: Pożywka wzbogacona
| Składniki | Stężenie [g/L] |
| 3-pirydynaldoksym | 3,0 lub 1,0 |
| (NH4)2HPO4 | 2,0 |
| KH2PO4 | 2,0 |
| NaCl | 1,0 |
| MgSO4 x 7 H2O | 0,2 |
| CoCI2 x 6 H2O | 0,01 |
| Ekstrakt drożdży | 0,2 |
całość dopełniono do 1 l wodą (pH 7,0).
P r z y k ł a d 3. Wpływ kofaktorów na aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 podczas namnażania
Pożywkę do hodowli wstępnej z tablicy 2 szczepiono szczepem Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597), a następnie inkubowano wstrząsając w 28°C przez 1 do 2 dni. Hodowlę wstępną przeniesiono do podstawowej pożywki z tablicy 3, która zawierała CoCl2 lub FeSO4 i hodowano wstrząsając w 28°C przez 2 do 3 dni. Aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono według przykładu 1. Wyniki zestawiono
PL 208 060 B1 w tablicy 4. Aktywność hydratazy nitrylowej obserwowano tylko w przypadku hodowania Rhodococcus sp. FZ4 w obecności kobaltu.
T a b l i c a 2: Poż ywka do hodowli wstępnej
| Składniki | Stężenie [g/L] |
| Pepton | 5,0 |
| Ekstrakt mięsa | 5,0 |
| NaCl | 2,0 |
| Ekstrakt drożdży | 0,5 |
całość dopełniono do 1 L wodą (pH 7,0).
T a b l i c a 3: Pożywka podstawowa
| Składniki | Stężenie [g/L] |
| Ekstrakt drożdży | 2,0 |
| Pepton | 0,2 |
| L-glutaminian, sól sodowa | 15,0 |
| MgSO4 x 7 H2O | 0,5 |
| CoCl2 x 6 H2O (lub FeSO4 x 7 H2O) | 0,004 |
| Krotonamid | 5,0 |
i całość dopełniono do 1 L wodą (pH 7,0).
T a b l i c a 4. Wpł yw kofaktorów na aktywność hydratazy nitrylowej podczas namnażania
| Kofaktor | Wzrost [OD610 nm] | Całkowita aktywność ^mol/(min x mL) | Aktywność właściwa ^mol/(min x ML x OD610 nm)] |
| FeSO4 | 2,86 | 0,989 | 0,346 |
| CoCI2 | 2,79 | 38,1 | 13,1 |
P r z y k ł a d 4. Wpływ induktorów na aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 podczas namnażania
Pożywkę do hodowli wstępnej z tablicy 2 szczepiono szczepem Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597), a następnie inkubowano wstrząsając w 28°C przez 1 do 2 dni. Hodowlę wstępną przeniesiono do pożywki hodowlanej z tablicy 5 zawierającej różne induktory i hodowano wstrząsając w 28°C przez 3 dni. Aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono według przykładu 1. Wyniki zestawiono w tablicy 6. Hydrataza nitrylowa Rhodococcus sp. FZ4 uległa ekspresji podczas namnażania jedynie w obecności induktora.
T a b l i c a 5: Poż ywka hodowlana
| Składniki | Stężenie [g/L] |
| Ekstrakt drożdży | 1,0 |
| Cytrynian sodu | 10,0 |
| Ekstrakt słodu | 15,0 |
| Induktor | 0,2% (w/v) |
| KH2PO4 | 2,0 |
| MgSO4 x 7 H2O | 0,5 |
| CoCI2 x 6 H2O | 0,015 |
i całość dopełniono do 1 L wodą (pH 7,0).
PL 208 060 B1
T a b l i c a 6: Wpływ induktorów na aktywność hydratazy nitrylowej
| Induktor | Wzrost [OD610 nm] | Aktywność całkowita ^mol/(min x mL)] | Aktywność właściwa ^mol/(min x mL x OD610 nm)] |
| Metakrylamid | 4,55 | 569 | 125 |
| Izobutyramid | 3,55 | 387 | 109 |
| Butyramid | 4,7 | 344 | 73,2 |
| Metakrylonitryl | 4,61 | 330 | 71,5 |
| Krotonamid | 9,32 | 558 | 59,9 |
| Butyronitryl | 5,26 | 307 | 58,4 |
| Waleramid | 5,61 | 322 | 57,5 |
| Izobutyronitryl | 5,24 | 273 | 52,1 |
| Krotononitryl | 8,24 | 407 | 49,4 |
| Propionamid | 5,17 | 149 | 28,7 |
| Waleronitryl | 3,70 | 120 | 32,4 |
| Izokaprononitryl | 4,72 | 134 | 28,5 |
| Izowaleronitryl | 3,22 | 74,7 | 23,2 |
| Kaprononitryl | 4,54 | 104 | 23,0 |
| Propionitryl | 4,72 | 95,8 | 20,3 |
| Akrylamid | 5,17 | 60,5 | 11,7 |
| 3-Pentenonitryl | 4,62 | 62 | 13,4 |
| ε-Kaprolaktam | 4,44 | 40,3 | 9,08 |
| Benzonitryl | 5,62 | 40,3 | 7,17 |
| Pikolinamid | 3,80 | 26,1 | 6,87 |
| - | 4,2 | 27,7 | 6,59 |
| Cyjanoacetamid | 4,75 | 30,9 | 6,50 |
| Acetamid | 4,37 | 21,6 | 4,98 |
| Acetonitryl | 4,46 | 18,4 | 4,13 |
| 3-Cyjanopirydyna | 5,54 | 12,3 | 2,21 |
| Izonikotynamid | 5,03 | 10,9 | 2,17 |
| Benzamid | 3,88 | 8,24 | 2,12 |
| Akrylonitryl | 3,27 | 5,91 | 1,81 |
| Nikotynamid | 3,55 | 4,94 | 1,39 |
| Mocznik | 6,16 | 5,66 | 0,918 |
P r z y k ł a d 5. Namnażanie Rhodococcus sp. FZ4 Pożywkę do hodowli wstępnej z tablicy 2 szczepiono szczepem Rhodococcus sp. FZ4, a następnie inkubowano wstrząsając w 28°C przez 1 do 2 dni. Hodowlę wstępną przeniesiono do pożywki hodowlanej z tablicy 5, zawierającej 6 g/L metakrylamidu jako induktora i hodowano wstrząsając w 28°C przez 3 dni. Po 48 h, podano dodatkowy metakrylamid (0,2% (v/v)).
W przykładach 6 do 13, użyto komórki spoczywające Rhodococcus sp. FZ4.
PL 208 060 B1
P r z y k ł a d 6. Specyficzność aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 względem substratu
Aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 względem różnych substratów oznaczono według przykładu 1, z tą różnicą, że odpowiedni substrat stosowano zamiast 3-cyjanopirydyny i że warunki HPLC były zmodyfikowane stosownie do użytego substratu. Tablica 7 podaje specyficzność aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 względem substratu w porównaniu ze specyficznoś cią aktywnoś ci hydratazy nitrylowej Rhodococcus rhodochrous J1 względem substratu.
T a b l i c a 7: Porównanie specyficzności aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 i Rhodococcus rhodochrous J1 względem podłoż a
| Rhodococcus sp. FZ4 | Rhodococcus rhodochrous J1 | |
| Podłoże | Aktywność względna [%] | Aktywność względna [%] |
| Acetonitryl | 646 | 0 (hydrataza nitrylowa A) 115 (hydrataza nitrylowa B) |
| Akrylonitryl | 498 | 478 |
| Butyronitryl | 466 | 26 |
| Propionitryl | 412 | 435 |
| 3-Cyjanopirydyna | 100 | 100 |
| 4-Cyjanopirydyna | 98,4 | 70 |
| Krotononitryl | 92,1 | 78 |
| Benzonitryl | 41,7 | 27 |
| 2-Cyjanopirydyna | 39,3 | 45 |
| m-Chlorobenzonitryl | 39,3 | 43 |
| p-Chlorobenzonitryl | 8,25 | 13 |
| Metakrylonitryl | 3,64 | 87 |
| o-Chlorobenzonitryl | 0 | 2,8 |
P r z y k ł a d 7. Optimum temperatury i trwał ość termiczna aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4
Aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono według przykładu 1 w różnych temperaturach w zakresie od 20 do 70°C. Optimum temperatury dla aktywności hydratazy nitrylowej wynosi 60°C (fig. 2).
Aby oznaczyć stabilność termiczną aktywności hydratazy nitrylowej, zawiesinę komórkową inkubowano w różnych temperaturach w zakresie od 40 do 70°C przez 15 min. Następnie aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono w 20°C według przykładu 1. Aktywność hydratazy nitrylowej po 15 min inkubowania w temperaturach w zakresie od 40 do 60°C odpowiadała pierwotnej aktywności hydratazy nitrylowej (fig. 3).
P r z y k ł a d 8. Optimum pH i trwałość względem pH aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4
Aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono według przykładu 1 stosując różne bufory (0,1 M) przy różnych wartościach pH w zakresie od 3 do 12. Optymalne pH dla aktywności hydratazy nitrylowej było między 6 i 7 (fig. 4).
Aby oznaczyć stabilność aktywności hydratazy nitrylowej względem pH, zawiesinę komórkową inkubowano przy różnych wartościach pH w zakresie od 4 do 10 w 20°C przez 24 h. Zawiesinę komórkową następnie odwirowano i usunięte komórki przemyto i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze fosforanu potasu (0,1 M; pH 7,0). Aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono według przykładu 1. Po inkubowaniu przy wartościach pH w zakresie od 5 do 10 przez 24 h, aktywność hydratazy nitrylowej odpowiadała w przybliżeniu pierwotnej aktywności (fig. 5).
PL 208 060 B1
P r z y k ł a d 9. Wpł yw stężenia 3-cyjanopirydyny na aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4
Zawiesinę komórek inkubowano przy różnych stężeniach 3-cyjanopirydyny w zakresie od 0 do 10% (w/v) w 20°C przez 60 min. Komórki usunięto, przemyto i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze fosforanu potasu (0,1 M; pH 7,0). Aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono według przykładu 1. Po inkubowaniu przy stężeniach 3-cyjanopirydyny w zakresie od 0 do 20%) (w/v) przez 60 min, aktywność hydratazy nitrylowej odpowiadała w przybliżeniu pierwotnej aktywności (fig. 6).
P r z y k ł a d 10. Wpływ stężenia nikotynamidu na aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4
Zawiesinę komórkową inkubowano przy różnych stężeniach nikotynamidu w zakresie od 0 do 20% (w/v) w 20°C przez 24 h. Komórki usunięto, przemyto i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze fosforanu potasu (0,1 M; pH 7,0). Aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono według przykładu 1. Po inkubowaniu przy stężeniach nikotynamidu w zakresie od 0 do 20% (w/v) przez 24 h, aktywność hydratazy nitrylowej odpowiadała w przybliżeniu pierwotnej aktywności (fig. 7).
P r z y k ł a d 11. Oznaczenie wartości KM dla 3-cyjanopirydyny względem hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4
Mieszaninę reakcyjną obejmującą 3-cyjanopirydynę (0,1-1,0 M; 1,0-1,8 mL), wodny roztwór NaCl (0,85% (w/v); 0,7 do 0,1 mL), bufor fosforanu potasu (0,1 M; pH 7,0; 0,3 mL) i zawiesinę komórkową (0,01 mL) inkubowano wstrząsając w 30°C przez 10 min. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wyniosła między 2.0 do 2,2 mL, zależnie od stężenia 3-cyjanopirydyny. Reakcję zatrzymano przez dodanie HCl (2 M; 0.1 mL). Po odwirowaniu mieszaniny reakcyjnej (12 000 obr/min: 5 min), wytworzoną ilość nikotynamidu oznaczono za pomocą HPLC według przykładu 1. Oznaczona wartość KM wyniosła 160 mM (fig. 10).
P r z y k ł a d 12. Porównanie aktywnoś ci hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 i aktywno ś ci hydratazy nitrylowej znanych mikroorganizmów Amycolatopsis sp. NA40,
Rhodococcus sp. GF270 i Rhodococcus rhodochrous J1
Wartości KM aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GF270 (DSM 12211; WO 99/05306), Amycolatopsis sp. NA40 (DSM 11617; WO 99/05306) i Rhodococcus rhodocrous J1 względem wyjściowej 3-cyjanopirydyny oznaczono według przykładu 11 stosując odpowiedni mikroorganizm.
Wartości KM szczepów Amycolatopsis sp. NA40 i Rhodococcus sp. FZ4 są niższe niż innych mikroorganizmów (tablica 8).
T a b l i c a 8: Porównanie wartości KM dla wyjściowej 3-cyjanopirydyny
| Km [Mm] | |||
| Rhodococcus sp. FZ4 | Rhodococcus sp . GF270 | Amycolatopsis sp. NA40 | Rhodococcus rhodochrous J1 |
| 160 | >200 | 41,7 | 200 |
Stabilność termiczną aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GF270, Amycolatopsis sp. NA40 i Rhodococcus rhodocrous J1 oznaczono według przykładu 7 stosując odpowiedni mikroorganizm i warunki inkubowania wskazane w tablicy 9. Aktywność hydratazy nitrylowej szczepu Rhodococcus sp. FZ4 wykazała najwyższą stabilność termiczną w porównaniu z aktywnoś cią hydratazy nitrylowej innych mikroorganizmów.
T a b l i c a 9: Porównanie trwałości termicznej aktywności hydratazy nitrylowej
| Aktywność względna [%] | ||||
| Warunki inkubowania | Rhodococcus sp. FZ4 | Rhodococcus sp. GF270 | Amycolatopsis sp. NA40 | Rhodococcus rhodochrous J1 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 15 min w | ||||
| 50°C | 100 | 100 | nda | 100 |
| 60°C | 93 | 95 | nda | 80 |
PL 208 060 B1 cd. tablicy 9
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 70°C | 2 | 5 | nda | 0 |
| 60 min w | ||||
| 20°C | 100 | 100 | 100 | nda |
| 30°C | 100 | 100 | 95 | nda |
| 40°C | 100 | 100 | 80 | nda |
| 50°C | 100 | 100 | 32 | nda |
| 60°C | 100 | 89 | 0 | nda |
| 70°C | 6 | 0 | 0 | nda |
| 60°C przez | ||||
| 0 min | 100 | 100 | nda | nda |
| 30 min | 100 | 67 - 0 | nda | nda |
| 60 min | 92 - 100 | 52 - 68 | nda | nda |
| 120 min | 72 - 87 | 29 - 47 | nda | nda |
nie oznaczono
Wpływ stężenia 3-cyjanopirydyny na aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GF270, Amycolatopsis sp. NA40 i Rhodococcus rhodocrous J1 oznaczono według przykładu 9 stosując odpowiedni mikroorganizm i stężenia 3-cyjanopirydyny wskazane w tablicy 10. Aktywności hydratazy nitrylowej szczepów Rhodococcus sp. FZ4 i Rhodococcus sp. GF270 wykazują najwyższą tolerancję względem 3-cyjanopirydyny.
T a b l i c a 10: Porównanie wpływu stężenia 3-cyjanopirydyny na aktywność hydratazy nitrylowej
| Aktywność względna [%] | ||||
| 3-Cyjanopirydyna [% (w/v)] | Rhodococcus sp. FZ4 | Rhodococcus sp. GF270 | Amycolatopsis sp. NA40 | Rhodococcus rhodochrous J1 |
| 0 | 100a | 100a | 100b | 100b |
| 2,5 | 100 | 100a | 74b | ndc |
| 5,0 | 100a | 100a | 56b | 86b |
| 7,5 | 100a | 100a | 47b | ndc |
| 10,0 | 100a | 100a | 16b | 63b |
a inkubowano przez 60 min. b inkubowano przez 15 min. c nie oznaczono
Wpływ stężenia nikotynamidu na aktywności hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GF270, Amycolatopsis sp. NA40 i Rhodococcus rhodocrous J1 oznaczono według przykładu 9 stosując odpowiedni mikroorganizm i stężenie nikotynamidu wskazane w tablicy 11. Aktywności hydratazy nitrylowej szczepów Rhodococcus sp. FZ4 i Rhodococcus sp. GF270 wykazują najwyższą tolerancję względem nikotynamidu (tablica 11).
T a b l i c a 10: Porównanie wpływu stężenia nikotynamidu na aktywności hydratazy nitrylowej
| Aktywność względna [%] | ||||
| Nikotynamid [% (w/v)] | Rhodococcus sp. FZ4 | Rhodococcus sp. GF270 | Amycolatopsis sp. NA40 | Rhodococcus rhodochrous J1 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 0 | 100 | 100 | 100 | nda |
PL 208 060 B1 cd. tablicy 10
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 10 | 100 | 100 | 55 | nda |
| 20 | 100 | 100 | 0 | nda |
| 30 | 100 | 100 | 0 | nda |
nie oznaczono
P r z y k ł a d 13. Biotransformacja 3-cyjanopirydyny do nikotynamidu stosując
Rhodococcus sp. FZ4
Roztwór 3-cyjanopirydyny dodano w 42 porcjach 42 x 0,52 g = 21,8 g; 0,21 mol) do wsadu obejmującego zawiesinę komórkową (13,7 mg suchej masy komórkowej, 4 mL) i bufor fosforanu potasu (0,1 M; pH 6,0; 16 mL). Następną porcję 3-cyjanopirydyny dodano do mieszaniny reakcyjnej, dopiero po ilościowym przeprowadzeniu 3-cyjanopirydyny w mieszaninie reakcyjnej do nikotynamidu. Mieszanina reakcyjna zestaliła się podczas przebiegu reakcji. Wytworzono ogółem 25,7 g nikotynamidu (wydajność ilościowa).
P r z y k ł a d 14. Biotransformacja cetonitrylu do acetamidu stosując
Rhodococcus sp. FZ4
Acetonitryl (5 mL; 95 mmol) dodano kroplami do mieszaniny reakcyjnej obejmującej bufor fosforanu potasu (0,1 M; pH 7,0; 4,5 mL) i zawiesinę komórek (4,88 mg suchej masy komórkowej; 0,5 mL) w 20°C przez 80 min. Reakcję następczą prowadzono wstrząsając w 20°C. Wytwarzanie acetamidu podczas reakcji monitorowano za pomocą HPLC (Waters Spherisorp 5 u ODS2 (4,6 x 150 mm); KH2PO4 (10 mM; pH 2,5)/acetonitryl = 99/1 (v/v); 1,0 mL/min; 210 nm). W ciągu 120 min wytworzono 6,14 g (wydajność ilościowa) acetamidu, który gromadził się w pożywce stosowanej w reakcji (fig. 1).
P r z y k ł a d 15. Wpływ stężenia acetonitrylu na aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4 w biotransformacji acetonitrylu do acetamidu
Mieszaninę reakcyjną obejmującą acetonitryl (0,2-19,0 M; 1,0-1,6 mL), wodny roztwór NaCl (0,85% (w/v): 0,6-0,0 mL), bufor fosforanu potasu (0,1 M; pH 7,0; 0,3 mL) i zawiesinę komórkową (0,1 mL) inkubowano wstrząsając w 20°C przez 10 min. Całkowita objętość reakcji wyniosła 2,0 mL. Reakcję zatrzymano przez dodanie MeOH. Mieszaninę reakcyjną odwirowano (12 000 obr/min, 5 min) i ilość wytworzonego acetamidu oznaczono metodą HPLC według przykładu 14.
Aktywność hydratazy nitrylowej była niemal stała w zakresie od 0,1 do 15 M acetonitrylu (fig. 8). P r z y k ł a d 16. Wpływ stężenia acetonitrylu na aktywność hydratazy nitrylowej
Rhodococcus sp. FZ4
Komórki inkubowano z acetonitrylem (0,0-15,0 M) w buforze fosforanu potasu (0,1 M, pH 7,0) w 20°C przez 1 h. Zawiesinę komórkową odwirowano (12 000 obr/min, 5 min) i komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w wodnym roztworze NaCl (0,85% (w/v)). Mieszaninę reakcyjną obejmującą tę zawiesinę komórkową (0,1 mL), 3-cyjanopirydynę (0,5 M, 1,0 mL), wodny roztwór NaCl (0,85% (w/v), 0,6 mL) i bufor fosforanu potasu (0,1 M, pH 7,0, 0,3 mL) inkubowano wstrząsając w 30°C przez 5 min. Reakcję zatrzymano przez dodanie MeOH. Mieszaninę reakcyjną odwirowano (12 000 obr/min, 5 min) i ilość wytworzonego acetamidu oznaczono metodą HPLC według przykładu 14.
Aktywność hydratazy nitrylowej była niemal stała po 1 h inkubowania z acetonitrylem w zakresie stężeń od 0 do 3 M. Po 1 h inkubowania z 6 M acetonitrylem, obserwowano wciąż 60% pierwotnej aktywności hydratazy nitrylowej. Po 1 h inkubowania 9 M z acetonitrylem, wciąż obserwowano około 35% pierwotnej aktywności hydratazy nitrylowej (fig. 9).
P r z y k ł a d 17. Tworzenie pigmentowo-negatywnych mutantów Rhodococcus sp. FZ4
Pożywkę Nutrient broth (50 mL) szczepiono szczepem Rhodococcus sp. FZ4, a następnie inkubowano wstrząsając w 28°C. aż osiągnięto OD610 nm 6,29. Następnie wstępną hodowlę (10 mL) przeniesiono do pożywki Nutrient broth (25 mL) i inkubowano wstrząsając w 28°C, aż osiągnięto OD610 nm 1,90. Tak otrzymaną hodowlę (10 mL) odwirowano (8 000 obr/min, 5 min). Roztwór sklarowany odrzucono, a wytrącone komórki przeprowadzono w stan zawiesiny w roztworze soli kuchennej, buforowanym fosforanem. Zawiesinę komórkową odwirowano (8 000 obr/min, 5 min). Roztwór sklarowany odrzucono, a wytrącone komórki przeprowadzono w stan zawiesiny w roztworze soli kuchennej, buforowanym fosforanem (5 mL). Zawiesinę komórkową przeniesiono na szklaną szalkę Petriego (średnica 90 mm). Komórki naświetlono stosując lampę UV (15 W, 254 nm) z odległości 25 cm przez 17 min. Komórki następnie inkubowano wstrząsając w podwójnie zatężonej pożywce Nutrient broth
PL 208 060 B1 w 28°C przez 4 dni. Tak otrzymaną hodowlę rozcień czono 100-krotnie i jej 100- μ l próbki posiano na płytce agarowej do zliczania kolonii i inkubowano w 28°C. Wyrosło prawie 150 pojedynczych kolonii na płytkę. Płatki wystawiono na światło dzienne, aby indukować tworzenie czerwonych pigmentów. Kolonie mutantów pigmentowo-negatywnych były łatwo odróżnialne od kolonii zabarwionych mutantów i czerwonych kolonii dzikiego typu.
P r z y k ł a d 18. Oczyszczanie hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4
Rhodococcus sp. FZ4 hodowano według przykładu 3 w 2L fermentatorze. Hodowlę odwirowano i wytrą cone komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w wodnym roztworze NaCl (0,85% (w/v)). Zawiesinę komórkową przeniesiono do buforu fosforanu potasu (0,1 M; pH 7,0) zawierającego kwas masłowy (44 mM) i potraktowano ultradźwiękami. Szczątki komórek usunięto przez odwirowanie. Roztwór sklarowany użyto do oczyszczania hydratazy nitrylowej według tablicy 12. Aktywność hydratazy nitrylowej oznaczono według przykładu 1, stosując jednak, odpowiednie ekstrakty zamiast zawiesiny komórkowej.
T a b l i c a 12: Oczyszczanie hydratazy nitrylowej Rhodococcus sp. FZ4
| Etap oczyszczania | Zawartość proteiny [mg] | Aktywność całkowita [pmol/min] | Aktywność właściwa [pmol/(min x mg)] |
| Ekstrakt bezkomórkowy | 335 | 5 881 | 17,6 |
| Wytrącanie (NH4)2SO4 | 198 | 6 087 | 28,4 |
| DEAE-Sephacel | 73,0 | 3 553 | 48,7 |
| Butyl-Toyopearl | 66,2 | 2 035 | 30,7 |
| Fenyl-Sepharose | 26,2 | 890 | 34,0 |
P r z y k ł a d 19. Oznaczenie masy cząsteczkowej oczyszczonej hydratazy nitrylowej Masę cząsteczkową oznaczono metodą HPLC (żel TSK G 300 SW (0,75 x 60 cm), bufor fosforanu potasu (0,1 M, pH 7,5) i chlorek potasu (0,2 M), 0,7 mL/min, 280 nm).
Masa cząsteczkowa hydratazy nitrylowej wyniosła 465 kDa (fig. 11).
Hydrataza nitrylowa składa się z α-podjednostki o masie cząsteczkowej 27,7 kDa i z β-podjednostki o masie cząsteczkowej 31,2 kDa (fig. 12).
P r z y k ł a d 20. Trwałość termiczna oczyszczonej hydratazy nitrylowej Roztwór obejmujący roztwór hydratazy nitrylowej (0,697 μmol/min, 0,025 mL) i bufor fosforanu potasu (0,1 M, pH 7,0; 0,475 mL) inkubowano w różnych temperaturach w zakresie od 20 do 70°C przez 60 min. Następnie roztwór ochłodzono do 20°C stosując kąpiel lodową i dodano 3-cyjanopirydynę (0,5 M; 0,500 mL). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 20°C przez 10 min. Reakcję zatrzymano przez dodanie MeOH. Ilość wytworzonego nikotynamidu oznaczono metodą HPLC jak w przykładzie 1. Po 60 min inkubowania w temperaturach powyżej 40°C, aktywność hydratazy nitrylowej obniżyła się znacząco. Po 60 min inkubowania w 50°C, aktywność hydratazy nitrylowej wyniosła jedynie około 25% pierwotnej aktywności (fig. 15).
P r z y k ł a d 21. Optymalne pH oczyszczonej hydratazy nitrylowej Mieszaninę reakcyjną obejmującą 3-cyjanopirydynę (0,5 M, 0,500 mL), roztwór hydratazy nitrylowej (0,697 μmol/min, 0,025 mL) i różne bufory w zakresie pH od 4 do 11 (0,1 M, 0,0475 mL) inkubowano w 20°C przez 10 min. Reakcję zatrzymano przez dodanie MeOH. Ilość wytworzonego nikotynamidu oznaczono metodą HPLC według przykładu 1. Optymalne pH dla hydratazy nitrylowej było w zakresie od 6,0 do 6,5 (fig. 16).
P r z y k ł a d 22. Stabilność oczyszczonej hydratazy nitrylowej względem pH Roztwór obejmujący roztwór hydratazy nitrylowej (8,36 μmol/min; 0,47 mL), różne bufory w zakresie pH od 4,0 do 11,0 (0,3 M; 0,10 mL) i wodę destylowaną (0,03 mL) inkubowano w 20°C przez 30 min. Mieszaninę reakcyjną obejmującą próbkę inkubowanego roztworu hydratazy nitrylowej (0,05 mL), 3-cyjanopirydynę (0,5 M, 0,5 mL) i odpowiedni bufor (0,1 M, 0,45 mL) inkubowano w 20°C przez 10 min. Reakcję zatrzymano przez dodanie MeOH. Ilość wytworzonego nikotynamidu oznaczono metodą HPLC według przykładu 1. Po 60 min inkubowania przy pH w zakresie od 6 do 8, aktywność hydratazy nitrylowej odpowiadała w przybliżeniu pierwotnej aktywności hydratazy nitrylowej (fig. 17).
PL 208 060 B1
P r z y k ł a d 23. Specyficzność oczyszczonej hydratazy nitrylowej względem substratu
Mieszaninę reakcyjną obejmującą roztwór hydratazy nitrylowej (0,695 μmol/min, 0,025 mL), różne substancje wyjściowe (0,500 mL) i bufor fosforanu potasu (0,1 M; pH 7,0; 0,475 mL) inkubowano w 20°C przez 5 do 10 min. Zastosowane stężenia substratu były w zakresie od 0,015 do 0,250 M. Reakcję zatrzymano przez dodanie MeOH. Ilość wytworzonego amidu oznaczono metodą HPLC. Wyniki zestawiono w tablicy 13. Spośród badanych substratów, aktywność hydratazy nitrylowej jest najwyższa względem acetonitrylu jako substancji wyjściowej.
T a b l i c a 13. Specyficzność oczyszczonej hydratazy nitrylowej względem substratu
| Substrat | Stężenie [M] | Aktywność względna [%] |
| Acetonitryl | 0,2 | 1008 |
| Akrylonitryl | 0,2 | 774 |
| Propionitryl | 0,2 | 693 |
| Butyronitryl | 0,2 | 578 |
| Krotononitryl | 0,2 | 114 |
| 3-Cyjanopirydyna | 0,25 | 100a |
| 4-Cyjanopirydyna | 0,125 | 92,8 |
| Benzonitryl | 0,015 | 75,6 |
| M-Chlorobenzonitryl | 0,015 | 66,5 |
| 2-Cyjanopirydyna | 0,125 | 36,7 |
| P-Chlorobenzonitryl | 0,015 | 8,31 |
| Metakrylamid | 0,2 | 1,39 |
| O-Chlorobenzonitryl | 0,015 | 0 |
Całkowita aktywność: 4164 μmol/(min x mL).
P r z y k ł a d 24. Wpływ potencjalnych inhibitorów na oczyszczoną hydratazę nitrylową Roztwór obejmujący roztwór hydratazy nitrylowej (0,695 μmol/min, 0,025 mL), bufor fosforanu potasu (0,1 M, pH 7,0, 0,475 mL), wodę destylowaną (0,150 mL) i różne potencjalne inhibitory (0,100 mL) inkubowano w 20°C przez 5 min. Następnie dodano 3-cyjanopirydynę (1,0M, 0,250 mL). Stężenie inhibitorów w mieszaninie reakcyjnej wyniosło 1,0 mM. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 20°C przez 10 min. Reakcję zatrzymano przez dodanie MeOH. Ilość wytworzonego nikotynamidu oznaczono metodą HPLC według przykładu 1. Wyniki zestawiono w tablicy 14. Spośród badanych potencjalnych inhibitorów najsilniejsze działanie inhibitujące wykazują hydroksyloamina i cyjanek potasu.
T a b l i c a 14: Wpływ potencjalnych inhibitorów na oczyszczoną hydratazę nitrylową
| Potencjalny inhibitor | Aktywność względna [%] |
| 1 | 2 |
| Kwas p-chlorortęciowobenzoesowyb | 187 |
| Tiron | 114 |
| Fluorek fenylometanosulfonylu | 110 |
| 1,10-Fenantrolina | 106 |
| Mocznik | 106 |
| Ditiotreitol | 103 |
| EDTAb | 100 |
| - | 100c |
| Cysteamina | 99,1 |
PL 208 060 B1 cd. tablicy 14
| 1 | 2 |
| 8-Hydroksychinolina | 97,8 |
| 2,2'-Bipirydyl | 97,8 |
| Octan jodu | 96,7 |
| N-Etylomaleinoimid | 95,3 |
| Azydek sodu | 93,5 |
| 5,5'-Ditiobis (kwas 2-nitrobenzoesowy)a | 93,4 |
| Dietyloditiokarbaminian | 93,3 |
| D-Cykloseryna | 86,3 |
| Fenylohydrazyna | 84,6 |
| 2-Merkaptoetanol | 76,3 |
| Hydroksyloamina | 1,34 |
| Cyjanek potasu | 0 |
a 0,1 mM.
b Kwas etylenodiaminoczterooctowy.
c całkowita aktywność: 3 776 μmol/(min x mL)
P r z y k ł a d 25. Wpływ jonów metali na aktywność oczyszczonej hydratazy nitrylowej Wpływ jonów metali na aktywność oczyszczonej hydratazy nitrylowej zbadano według przykładu 24, lecz przy dodaniu jonów metali zamiast potencjalnych inhibitorów. Stężenie jonów metali w mieszaninie reakcyjnej wyniosło 1,0 mM. Wyniki zestawiono w tablicy 15. Spośród badanych jonów metali, jedynie kationy srebra i dwuwartościowej rtęci wykazują działanie inhibitujące.
T a b l i c a 15: Wpływ jonów metali na aktywność oczyszczonej hydratazy nitrylowej
| Jony metali | Aktywność względna [%] |
| CuSO4 | 177 |
| MnCl2 | 123 |
| NiCl2 | 123 |
| ZnSO4 | 121 |
| FeSO4 | 113 |
| CaCl2 | 113 |
| CoCI2 | 110 |
| FeCla | 105 |
| - | 100a |
| AgNOs | 0 |
| HgCl2b | 0 |
P r z y k ł a d 26. Oznaczenie wartości KM dla 3-cyjanopirydyny względem oczyszczonej hydratazy nitrylowej
3-Cyjanopirydynę dodawano w różnych stężeniach (3,1-800 mM, 0,500 mL) do roztworu obejmującego roztwór hydratazy nitrylowej (0,0697 pmol/min, 0,025 mL) i bufor fosforanu potasu (0,1 M, pH 7,0; 0,475 mL). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 20°C przez 10 min. Reakcję zatrzymano przez dodanie metanolu i ilość wytworzonego nikotynamidu oznaczono metodą HPLC według przykładu 1.
Wartość KM dla 3-cyjanopirydyny wyniosła 80,5 mM (fig. 13).
PL 208 060 B1
P r z y k ł a d 27. Oznaczenie wartości KM dla acetonitrylu względem oczyszczonej hydratazy nitrylowej
Acetonitryl dodawano w różnych stężeniach (2,5-80 mM, 0,500 mL) do roztworu obejmującego roztwór hydratazy nitrylowej (0,0697 umol/min, 0,025 mL) i bufor fosforanu potasu (0,1 M, pH 7,0; 0,475 mL). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 20°C przez 10 min. Reakcję zatrzymano przez dodanie metanolu i ilość wytworzonego acetamidu oznaczono metodą HPLC według przykładu 14. Wartość KM dla acetonitrylu wyniosła 2,84 mM (fig. 14).
Claims (11)
- Zastrzeżenia patentowe1. Mikroorganizmy ze szczepu oznaczonego jako Rhodococcus sp. FZ4, zdeponowanego pod numerem DSM 13597.
- 2. Mikroorganizmy według zastrz. 1, znamienne tym, że są zdolne do tolerowania acetonitrylu w stężeniu co najmniej 3 M.
- 3. Mikroorganizmy według zastrz. 2, znamienne tym, że są zdolne do przereagowania 3-cyjanopirydyny z wytworzeniem nikotynoamidu.
- 4. Mikroorganizmy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że występują [w nich] kwasy mykolowe o długości łańcucha C48.
- 5. Ekstrakty enzymów, otrzymywalne z mikroorganizmów jak określono w zastrz. 1 do 4.
- 6. Hydrataza nitrylowa, otrzymywalna z mikroorganizmów jak określono w zastrz. 1 do 4.
- 7. Hydrataza nitrylowa, znamienna tym, że maa) wartość KM 2,84 ± 1,00 mM dla acetonitrylu jako substratu oraz 80,5 ± 15,0 mM dla 3-cyjanopirydyny jako substratu;b) optimum pH 6,5 ± 1,0;c) masę cząsteczkową 465 ± 50 oznaczaną metodą HPLC i obejmuje α-podjednostkę oraz β-podjednostkę.
- 8. Sposób wytwarzania amidów o wzorze ogólnym 3, w którym R1 oznacza C1-6-alkil, C2-6-alkenyl lub grupę o wzorze ogólnym 4, w którym X oznacza atom azotu lub -CH=, każdy z podstawników R2 i R3 oznacza niezależnie atom wodoru, atom chlorowca, C1-6-alkil lub C2-6-alkenyl, znamienny tym, że nitryl o wzorze ogólnym 2, w którym R1 ma wyżej określone znaczenie, poddaje się przekształceniu stosując mikroorganizm jak określono w zastrz. 1 do 4, ekstrakt enzymu jak określono w zastrz. 5 lub enzym jak określono w zastrz. 6 do 7.
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako nitryl stosuje się 3-cyjanopirydynę lub acetonitryl.
- 10. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w temperaturze od 5 do 50°C i przy pH od 5 do 10.
- 11. Zastosowanie mikroorganizmów jak określono w zastrz. 1 do 4, do usuwania odpadów acetonitrylu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01100493 | 2001-01-09 | ||
| US34237301P | 2001-12-27 | 2001-12-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL365921A1 PL365921A1 (pl) | 2005-01-10 |
| PL208060B1 true PL208060B1 (pl) | 2011-03-31 |
Family
ID=26076438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL365921A PL208060B1 (pl) | 2001-01-09 | 2002-01-08 | Nowe mikroorganizmy Rhodococcus sp., ekstrakty enzymów wyodrębniane z tych mikroorganizmów, hydrataza nitrylowa wytwarzana przez te mikroorganizmy oraz mikrobiologiczny sposób wytwarzania amidów, jak również zastosowania tych mikroorganizmów |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040142447A1 (pl) |
| EP (1) | EP1352050B1 (pl) |
| JP (1) | JP4307837B2 (pl) |
| KR (2) | KR100880143B1 (pl) |
| CN (1) | CN1316010C (pl) |
| AT (1) | ATE417919T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002228036A1 (pl) |
| CA (1) | CA2432060C (pl) |
| CZ (1) | CZ20031409A3 (pl) |
| DE (1) | DE50213120D1 (pl) |
| DK (1) | DK1352050T3 (pl) |
| EA (1) | EA008600B1 (pl) |
| ES (1) | ES2319875T3 (pl) |
| HU (1) | HU229283B1 (pl) |
| IL (2) | IL155996A0 (pl) |
| MX (1) | MX268424B (pl) |
| NO (1) | NO329719B1 (pl) |
| PL (1) | PL208060B1 (pl) |
| PT (1) | PT1352050E (pl) |
| SK (1) | SK288061B6 (pl) |
| WO (1) | WO2002055670A1 (pl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102004013824A1 (de) | 2004-03-20 | 2005-10-13 | Degussa Ag | Nitrilhydratasen aus Rhodococcus opacus |
| IT1400395B1 (it) | 2010-06-08 | 2013-05-31 | Procos Spa | Processo one-pot per la sintesi di dalfampridine. |
| CN102212566A (zh) * | 2011-04-11 | 2011-10-12 | 江苏大学 | 一种高纯度异丁酰胺生产方法 |
| ITUA20163572A1 (it) * | 2016-05-18 | 2017-11-18 | Columbia S R L | Metodo biotecnologico per la produzione di acrilammide e relativo nuovo ceppo batterico |
| EP3710592B1 (en) | 2017-11-14 | 2022-08-31 | Columbia S.r.l. | Microbiological process for the preparation of amides |
| CN114686538B (zh) * | 2020-12-30 | 2023-09-29 | 杭州唯铂莱生物科技有限公司 | 一种烟酰胺制备中烟酸含量的控制方法 |
| WO2024195728A1 (ja) * | 2023-03-17 | 2024-09-26 | 三菱ケミカル株式会社 | アミド化合物の製造方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4255344A (en) * | 1978-11-08 | 1981-03-10 | Mitsubishi Chemical Industries, Limited | 9-α-Hydroxy steroids |
| CA1133840A (en) * | 1980-09-08 | 1982-10-19 | James E. Zajic | De-emulsification agents of microbiological origin |
| DE3248167A1 (de) * | 1982-12-27 | 1984-06-28 | Wintershall Ag, 3100 Celle | Trehaloselipidtetraester |
| US5179014A (en) * | 1985-01-08 | 1993-01-12 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Process for the preparation of amides using microorganisms |
| MX169933B (es) * | 1987-09-18 | 1993-08-02 | Hideaki Yamada | Procedimiento para la produccion biologica de amidas |
| GB8910958D0 (en) * | 1989-05-12 | 1989-06-28 | Bruce Neil C | Assay |
| AU627648B2 (en) * | 1990-02-28 | 1992-08-27 | Teruhiko Beppu | Dna fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant |
| US5753472A (en) * | 1991-05-02 | 1998-05-19 | Nitto Chemical Industry Co. Ltd. | DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant |
| DE4313649C1 (de) * | 1993-04-21 | 1995-01-26 | Fzb Biotechnik Gmbh | Mikroorganismus und Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines Nitrilhydratase-/Amidase-Enzymkomplexes |
| RU2053300C1 (ru) * | 1993-12-17 | 1996-01-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы |
| CN1108372C (zh) * | 1997-07-22 | 2003-05-14 | 隆萨股份公司 | 酰胺的制备工艺 |
| JP4185607B2 (ja) * | 1998-12-15 | 2008-11-26 | ダイセル化学工業株式会社 | 新規な微生物及びアミド化合物の製造方法 |
-
2002
- 2002-01-08 CN CNB028035658A patent/CN1316010C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-08 PL PL365921A patent/PL208060B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2002-01-08 CZ CZ20031409A patent/CZ20031409A3/cs unknown
- 2002-01-08 WO PCT/EP2002/000103 patent/WO2002055670A1/de active Application Filing
- 2002-01-08 KR KR1020037009158A patent/KR100880143B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-01-08 CA CA2432060A patent/CA2432060C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-08 ES ES02709997T patent/ES2319875T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 HU HU0401111A patent/HU229283B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-01-08 AT AT02709997T patent/ATE417919T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-01-08 DE DE50213120T patent/DE50213120D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 JP JP2002556721A patent/JP4307837B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-08 IL IL15599602A patent/IL155996A0/xx unknown
- 2002-01-08 SK SK624-2003A patent/SK288061B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-01-08 PT PT02709997T patent/PT1352050E/pt unknown
- 2002-01-08 MX MXPA03006149 patent/MX268424B/es active IP Right Grant
- 2002-01-08 AU AU2002228036A patent/AU2002228036A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-08 DK DK02709997T patent/DK1352050T3/da active
- 2002-01-08 KR KR1020087025004A patent/KR100903756B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-01-08 EP EP02709997A patent/EP1352050B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 EA EA200300749A patent/EA008600B1/ru not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-05-19 IL IL155996A patent/IL155996A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-06-19 US US10/465,495 patent/US20040142447A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-08 NO NO20033116A patent/NO329719B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-02-27 US US11/710,983 patent/US7838271B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5334519A (en) | Process for biological production of amides with R. rhodochrous J-1 | |
| US7838271B2 (en) | Microbiological method for producing amides | |
| US7595178B2 (en) | Process for the preparation of amides | |
| KR20010040960A (ko) | 신규한 미생물 및 아미드 화합물의 제조 방법 | |
| JP2670838B2 (ja) | Ｌ―α―アミノ酸類の製造方法 | |
| MXPA00000440A (es) | Procedimiento para la preparacion de amidas | |
| JP2006158323A (ja) | 微生物によるアミド化合物の製造方法およびそれに使用する微生物、菌体処理物および酵素 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20140108 |