JP2004516849A - アミド類を生成するための微生物学的方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性を示すことできる新規な微生物に関し、更に、一般式
【化１】
のアミドを生成する新規な方法に関する。ここで、Ｒ１はＣ１ 〜６のアルキル遊離基、Ｃ２ 〜６のアルケニル基、又は一般式
【化２】
で表される基であり、ここでＸは、前記微生物が用いる対応するニトリルに基づいて、チッ素原子又は−ＣＨ＝であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１ 〜 ６のアルキル基、又はＣ２ 〜 ６のアルケニル基である。本発明はさらに、アセトニトリルの廃棄物を除去するための、前記微生物の使用に関する。
【選択図】図１
【化１】
のアミドを生成する新規な方法に関する。ここで、Ｒ１はＣ１ 〜６のアルキル遊離基、Ｃ２ 〜６のアルケニル基、又は一般式
【化２】
で表される基であり、ここでＸは、前記微生物が用いる対応するニトリルに基づいて、チッ素原子又は−ＣＨ＝であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１ 〜 ６のアルキル基、又はＣ２ 〜 ６のアルケニル基である。本発明はさらに、アセトニトリルの廃棄物を除去するための、前記微生物の使用に関する。
【選択図】図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性を示すことできる微生物、ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素、該微生物又は該酵素を用いてアミド類を産生するための方法、並びにアセトニトリルの廃棄物を除去するための該微生物の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えばニコチン酸アミド、ビタミンＢ複合体のビタミンのような、動物及びヒトにとって必須であるアミド類を産生するための複数の生物工学的な方法が既に知られている。
【０００３】
例えば、ＥＰ−Ａ ０ ３０７ ９２６は、ロドコッカス・ロドコラスＪ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ１）によって、３−シアノピリジンをニコチン酸アミドに転化することを記載している。この方法は、ロドコッカス・ロドコラスＪ１が赤色なので、産物が退色するという欠点を有する。更に、この微生物は、３−シアノピリジン基質に対するＫＭ値が高く、温度に耐性が低く、３−シアノピリジンに対する耐性が低い。
【０００４】
ＷＯ ９９／０５３０６は、例えば、ロドコッカス属、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属、及びアクチノマドゥラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属の微生物を用いて、対応するニトリルから開始してニコチン酸アミドを産出する方法を記載している。この方法の欠点は、使用したアミコラトプシス属の微生物が、温度が上昇すると非活性化されることである。更に、これらの微生物は、３−シアノピリジン及びニコチン酸アミドに対して低い耐性を有する。記述したロドコッカス属の微生物は、３−シアノピリジンに対するＫＭ値が高く、温度安定性が低い。従って、この方法は工業的な方法としては非経済的である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、比較的安定であり、例えば３−シアノピリジンのような基質に対して比較的低いＫＭ値を有し、それ故、当該のアミドを非常に高収率かつ高純度で単離することができる、アミド類を産生するためのより経済的な方法のために用いることができる微生物を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この目的は、請求項１に記載の微生物、請求項５又は７に記載の酵素、及び請求項８に記載の方法によって達成される。
【０００７】
本発明の微生物は、例えば、土壌サンプル、スラッジ又は廃水から適切に選択することによって、通常の微生物学的な技術を用いて得られる。それらの微生物は、一般式が
【化４】
であるピリジンアルドキシム、またはコバルトイオン及び例えば酵母エキス及び／又はアンモニウム塩の存在下で炭素源としてのニトリル類を用いて培養することによって、都合よく選択される。次に、得られた培養物から、少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性を示し、例えば３−シアノピリジン及びアセトニトリルのようなニトリル類を対応するアミドに変換することができる微生物を選択する。
【０００８】
ピリジンアルドキシムとしては、ピリジン−２−，ピリジン−３−又はピリジン−４−アルドキシムを用いることができる。
【０００９】
選択に適したニトリル類は、特に、後に生体内変換で基質として用いられるものでもあり、例えばアセトニトリル（酢酸ニトリル）、プロビオニトリル、ブチロニトリル、クロトンニトリル、アジピン酸ニトリル及びマロン酸ニトリルである。
【００１０】
好ましいコバルトイオン源は、「コバルトイオンを発生するコバルト化合物」、例えば、塩化コバルト、硫酸コバルト、及び酢酸コバルトのようなＣｏ２＋又はＣｏ３＋塩である。好ましいコバルト化合物は、例えばＣｏＣｌ２のようなＣｏ２＋塩である。しかしながら、金属コバルト又は他のコバルト化合物と共に培養することもできる。通常、コバルト又はコバルト化合物を培地中に１乃至３０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１乃至２０ｍｇ／Ｌの量で用いる。
【００１１】
アンモニウム塩として、例えば、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４又は（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４のようなリン酸アンモニウムを用いることができる。
【００１２】
実際の生体内変換の前に微生物を適切な培地で培養する。適切な培地は、例えば、表１又は５に記載された培地である。
【００１３】
培養は、通常、温度２０乃至４０℃、ｐＨ５乃至８で行うが、好ましくは、温度２５乃至３５℃、ｐＨ６乃至７．５で行う。
【００１４】
便法として、酵素誘導物質を添加することによって、培養中に有効な酵素すなわちニトリルヒドラターゼを誘導する。
【００１５】
使用可能な酵素誘導物質は、飽和又は不飽和脂肪族ニトリル類又は対応するアミド類である。使用可能な脂肪族ニトリルは、例えばブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル又はイソバレロニトリルのような全てのＣ２ 〜７のアルカンニトリル、あるいは、例えばメタクリロニトリル又はクロトンニトリルのようなＣ３ 〜 ７のアルケンニトリルである。使用可能な脂肪族アミドは、例えばブチルアミド、イソブチルアミド、バレルアミド、又はプロピオンアミドのようなすべてのＣ２〜７のアルカンアミド、あるいは、例えばメタクリルアミド又はクロトンアミドのようなＣ３ 〜７のアルケンアミドである。好ましい酵素誘導物質は、メタクリルアミド、ブチルアミド、イソブチルアミド、バレルアミド、メタクリロニトリル、クロトンアミド、ブチロニトリル、及びイソブチロニトリルである。酵素誘導物質としてメタクリルニトリルを用いることが特に好ましい。
【００１６】
本発明の微生物は、少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性を示し、酵素活性が、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液中、ｐＨ７．０、および２０℃で１時間、３Ｍのアセトニトリルでインキュベーションした後に安定であることを意味する、すなわち、わずか１０％の活性が減少したのみである。好ましい微生物は、上記の条件下で少なくとも６Ｍの濃度のアセトニトリルに１時間耐性を示し、活性の減少は５０％のみである。特に好ましい微生物は、上記の条件下で少なくとも９Ｍの濃度のアセトニトリルに１時間耐性を示し、活性の減少は７０％のみである。
【００１７】
特に非常に好ましい微生物では、１５Ｍ及び１９Ｍの濃度のアセトニトリル（純粋なアセトニトリルに匹敵する）で数分間インキュベーションした後でさえ酵素活性は安定的である。１５Ｍのアセトニトリルで１０分間インキュベーションした後の酵素活性の減少は、１０％より少ない。
【００１８】
本発明の微生物は高い熱安定性、すなわち、高温において、これまで知られた微生物よりも高い安定性を有する。本発明の微生物の酵素活性の減少は、好ましくは、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液中、６０℃で１時間インキュベーションした後でわずか１０％であり、上記条件下で２時間インキュベーションした後でわずか４０％である。
【００１９】
ここでの酵素活性とは、ニトリルヒドラターゼ活性、特に、基質３−シアノピリジンに関するニトリルヒドラターゼ活性を意味する。
【００２０】
本発明の微生物の他の特性は、好ましくは用いられる基質３−シアノピリジン、及び、それらから生成したニコチンアミドに高耐性であり、
３−シアノピリジンに関するＫＭ値が低い。その他、特に優れた特性は、微生物が、アセトアミドを、３０℃で飽和したアセトアミド溶液の濃度（１００ｍＬの水の中に約２２０―２３０ｇのアセトアミド）よりも高い濃度で蓄積することができることである。
【００２１】
好ましい微生物はロドコッカス属に属している。特に好ましい微生物はロドコッカス種ＦＺ４株、及びそれらの、機能的に等しい変異体及び突然変異体である。機能的に等しい変異体及び突然変異体とは、少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性を示す変異体及び突然変異体を意味する。特に非常に好ましくは、「色素のない」ロドコッカス株、すなわち、所望の産物の退色をもたらすだろう赤色を欠損した株である。このような株は、場合によっては、紫外線照射又は突然変異誘発化学による突然変異誘発によって色素形成の微生物から容易に産生される。
【００２２】
ロドコッカス種ＦＺ４株を、ブダペスト条約に基づき、寄託番号ＤＳＭ１３５９７として、２０００年７月１１日に、Ｄ３８１２４ブラウンシュヴァイク マッシェローダー・ヴェーク１ｂに所在するドイッチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン・ゲーエムベーハー（ＤＳＭＺ）に寄託した。この微生物は、その同定データに基づいてこれまで知られていたロドコッカス種のいずれかに分類されることができず、従って、新種に分類された。
【００２３】
ロドコッカス種ＦＺ４株の機能的に等しい変異体及び突然変異体を、自然突然変異によって、あるいは、例えば紫外線照射又は突然変異誘発化学によって生成することができる。ロドコッカス種ＦＺ４株の好ましい変異体及び突然変異体は、「色素のない」、すなわち、所望の産物の退色をもたらすだろう赤色を有しないものである。
【００２４】
酵素抽出物は、例えば超音波方法、フレンチプレス、又はリゾチーム法によって、例えば、微生物を粉砕して得ることができる。
【００２５】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する本発明の酵素は、上記の微生物から得ることができる。それらは好ましくは、ロドコッカス属の微生物、特に、ロドコッカス種ＦＺ４（ＤＳＭ １３５９７）の微生物から得ることができる。
【００２６】
前記した酵素は、特に、以下の特性、
ａ）アセトニトリル基質に対するＫＭ値が２．８４±１．００ｍＭ、及び３−シアノピリジン基質に対するＫＭ値が８０．５±１５．０ｍＭ、
それぞれの場合で０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液中、ｐＨ７．０、２０℃；ｂ）２０℃の０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液中における最適ｐＨが６．５±１．０；
を有する。
【００２７】
特に、前記した酵素は、
ｃ）ＨＰＬＣによって測定した天然分子量が４６５±５０ｋＤａ；
を有する。
【００２８】
実際の生体内変換は、上記の微生物、それらの微生物の酵素抽出物、または単離した酵素を使用して行われることができる。ロドコッカス種ＦＺ４の微生物によって生体内変換を行なうことが好ましい。
【００２９】
生体内変換に使用可能な基質は、一般式
【化５】
のニトリルである。
【００３０】
一般式ＩＩにおいて、置換基Ｒ１はＣ１ 〜 ６のアルキル基、Ｃ２ 〜６のアルケニル基、又は一般式
【化６】
で表される基である。
【００３１】
一般式ＩＶにおいて、Ｘはチッ素原子又は−ＣＨ＝であり、置換基Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１ 〜 ６のアルキル基、又はＣ２ 〜 ６のアルケニル基である。
【００３２】
使用可能なＣ１ 〜６のアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、第３ブチル、イソブチル、ペンチル及びその異性体、および、ヘキシル及びその異性体である。使用可能なＣ２ 〜６のアルケニル基は、例えば、ビニル、アリル、１−プロペン−１−イルおよび１−プロペン−２−イルである。
【００３３】
使用可能なハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。
【００３４】
一般式ＩＩのニトリルの好ましい代表は、アセトニトリル、ブチロニトリル、アクリルニトリル、プロピオニトリル、クロトンニトリル、２−シアノピリジン、３−シアノピリジン、４−シアノピリジン、ベンゾニトリル、フルオロベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル及びブロモベンゾニトリルである。最も好ましい基質はアセトニトリル及び３−シアノピリジンである。
【００３５】
生体内変換は、好ましくは器質を一度だけ、または連続的に添加して行う。当業者に周知のように、用いられる基質濃度は、用いられる基質の溶解度に左右される。
【００３６】
静止（非増殖）細胞を用いた方法を実行することは好ましい。
【００３７】
生体内変換のための培地としては、当業者に周知である、例えば、低モル濃度のリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、及びホウ酸緩衝液を用いることができる。低モル濃度のリン酸緩衝液は、好ましくは０．０１乃至０．５Ｍのリン酸緩衝液、特に好ましくは０．０５乃至０．２５Ｍのリン酸緩衝液を意味する。
【００３８】
生体内変換は、好ましくは５乃至５０℃の温度で、特に好ましくは２０乃至４０℃の温度で行なう。好ましいｐＨは５〜１０、特に好ましくは６〜７．５である。
【００３９】
一般式ＩＩのニトリルを変換した後に、一般式
【化７】
で表される対応するアミドを、細胞の分離後、例えば結晶化又は噴霧乾燥のような通常の処理方法によって単離することが可能である。一般式ＩＩＩのＲ１は、上記で定義された通りである。
【００４０】
本発明はさらに、アセトニトリル廃棄物の除去のための上記微生物、特にロドコッカス属の使用に関する。
【００４１】
アセトニトリルは、例えばＨＰＬＣによって用いられ、最後には廃棄物として処理されねばならない溶媒である。本発明が除去するアセトニトリル廃棄物は、純粋なアセトニトリルに匹敵する、最大１９Ｍの濃度のアセトニトリルであり得る。０．２５乃至１５．０Ｍの、好ましくは１乃至１０Ｍのアセトニトリル溶液又は懸濁液を用いることが都合良い。
【００４２】
アセトニトリルの廃棄物を除去するために、微生物を、５乃至５０℃の温度で、好ましくは２０乃至４０℃で用いることが都合よい。ｐＨ値は５〜１０、好ましくは６〜８であることが都合よい。
【００４３】
廃棄物を除去するための、アセトニトリルのアセトアミドへの転化時間は、アセトニトリルの濃度に左右され、例えば、９．５Ｍのアセトアミド溶液又は懸濁液を生成するのにｐＨ７．０、約２０℃の温度で、約２時間かかる。
【００４４】
ＦＺ４（ＤＳＭ１３５９７）株の同定
【００４５】
（Ａ）化学分類学的マーカー
１．ペプチドグリカンの診断用アミノ酸：メソ−ジアミノピメリン酸
２．ミコール酸：Ｃ４０乃至Ｃ４８の鎖長を有するミコール酸を呈する
３．脂肪酸パターン；直線状の、飽和及び不飽和脂肪、および、ツベルクロステアリン酸（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）の高い含量を呈する。脂肪酸パターンに基づいて、ＦＺ４株を、ロドコッカス属であると同定した。
【００４６】
（Ｂ）従来法のマーカー
ＦＺ４株の細胞の肉眼で見える外観及び形態は、ロドコッカス・ロドコラスに類似した。ＦＺ４株のコロニーはサーモンピンク（ＲＡＬ３０２２）であり、若い培養物は桿菌及び球菌へと発展する分岐した球菌を発展させた。
【００４７】
化学分類学的及び従来法のマーカーによって、ＦＺ４株を、ロドコッカス・ロドコラス種に属するものと同定したが、相関係数は低かった。
【００４８】
（Ｃ）１６ｓ ｒＤＮＡの先頭の５００塩基の分析
１６Ｓ ｒＤＮＡの先頭の５００塩基のシーケンスによって、ロドコッカス・ロドコラス種の典型的な代表株ロドコッカス・ロドコラスＤＳＭ ４３２４１のものとわずか９７．７％の相同性が示され、他のロドコッカス・ロドコラス基準株とは９９．１％の相同性が示された。ＦＺ４株の１６ＳｒＤＮＡの先頭の５００塩基のシーケンスと、ロドコッカス・ロドコラスＤＳＭ ４３２４１株のシーケンスとの相同性が９９．５％を下回ったため、ＦＺ４株をロドコッカス・ロドコラス種に属するものと同定することは不可能である。
【００４９】
従って、ＦＺ４株を、ロドコッカス属の新種と同定した。
【００５０】
【実施例】
＜実施例１ ニトリルヒドラターゼ活性の測定＞
３−シアノピリジン（１．０Ｍ、１．０ｍＬ）と、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．５ｍＬ）と、細胞懸濁液（０．５ｍＬ）を含む反応混合物を、攪拌しながら２０℃で５分間インキュベーションして、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。反応は、ＨＣｌ（５Ｍ、０．１ｍＬ）を添加して停止した。反応混合物を濾過した後（０．２μｍ フィルタ）、生成したニコチンアミドの量をＨＰＬＣによって測定した（ウォーターズ・スフェリソブ（Ｗａｌｔｅｒｓ Ｓｐｈｅｒｉｓｏｂ） ５μ ＯＤＳ２（４．６×１５０ｍｍ）；ＫＨ２ＰＯ４／Ｈ３ＰＯ４（１０ｍＭ、ｐＨ２．８）／アセトニトリル＝９：１（ｖ／ｖ）；１ｍＬ／分；２３０ｎｍ）。全活性を、毎分１ｍｌ当たりに生成したニコチンアミドのμｍｏｌで示し、比活性を、毎分１ｍｌのＯＤ６１０ｎｍ当たり生成したニコチンアミドのμｍｏｌ（μｍｏｌ／分×ｍｌ×ＯＤ６１０）として示した。
【００５１】
＜実施例２ ロドコッカス種ＦＺ４株（ＤＳＭ １３５９７）の単離＞
Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｌ． １９９８， １７０， ８５−９０には、ロドコッカス種 ＹＨ３−３株（ＴＰＵ３４５３）株が、３−ピリジンアルドキシムを、３−シアノピリジン及びニコチンアミドを経てニコチン酸へ代謝することが開示されている。この場合では、ロドコッカス種ＹＨ３−３株（ＴＰＵ３４５３）のアルドキシムデヒドラターゼ活性、およびニトリルヒドラターゼ活性、およびアミダーゼ活性は、種々のアルドキシムおよびニトリルによって誘導された。
【００５２】
種々の土壌試料を表１に示した増菌培地に接種し、７乃至１０日間３７℃でインキュベーションした。得られた培養物を同様の培地に移し、再び７乃至１０日間３７℃で培養した。この手順を３回繰り返した。続いて、培養物を希釈して、プレートに塗布した。プレートを３７℃で５日間インキュベーションした後に、個々のコロニーを得た。個々のコロニーのニトリルヒドラターゼ活性の存在の有無を、例１に従って試験した。このようにして、ロドコッカス種ＦＺ４株（ＤＳＭ１３５９７）を単離した。３−ピリジンアルドキシムの代わりに、ニトリル類、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、クロトンニトリル、アジポニトリル、及びマロンニトリルを炭素源として用いることも可能である。
【表１】
【００５３】
＜実施例３ 培養中において共同因子がロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼす影響＞
ロドコッカス種ＦＺ４株（ＤＳＭ１３５９７）を表２に示した前培養培地に接種して、攪拌しながら１乃至２日間２８℃でインキュベーションした。前培養物を、ＣｏＣｌ２又はＦｅＳＯ４を含む、表３に示した基本培地に移して、攪拌しながら２乃至３日間２８℃で培養した。ニトリルヒドラターゼ活性を、実施例１に従って測定した。結果は表４に纏めた。ニトリルヒドラターゼ活性は、ロドコッカス種ＦＺ４をコバルトの存在下で培養したときのみ存在した。
【表２】
【表３】
【表４】
【００５４】
＜実施例４ 培養中において誘導物質がロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性へ及ぼす影響＞
ロドコッカス種ＦＺ４株（ＤＳＭ１３５９７）を表２に示した前培養培地に接種して、攪拌しながら１乃至２日間２８℃でインキュベーションした。前培養物を、異なる誘導物質を含む、表５に示した培地に移し、攪拌しながら３日間２８℃で培養した。ニトリルヒドラターゼ活性を実施例１に従って測定した。結果は表６に纏めた。ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼは、培養中に誘導物質が存在したときのみ発現した。
【表５】
【表６】
【００５５】
＜実施例５：ロドコッカス種ＦＺ４の培養＞
ロドコッカス種ＦＺ４を表２に示した前培養培地に接種して、攪拌しながら１乃至２日間２８℃でインキュベーションした。前培養物を、誘導物質として６ｇ／Ｌのメタクリルアミドを含む、表５に示した培地に移し、攪拌しながら３日間２８℃で培養した。４８時間後に追加のメタクリルアミド（０．２（ｖ／ｖ））を添加した。
【００５６】
実施例６乃至１３では、ロドコッカス種ＦＺ４の静止細胞を用いた。
【００５７】
＜実施例６ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の基質特異性＞
異なる基質に関するロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性を、３−シアノピリジンの代わりに適切な基質を用い、用いられた基質に応じてＨＰＬＣの条件を変更した以外は例１に従って測定した。ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の基質特異性を、ロドコッカス・ロドコラスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性の基質特異性と比較して表７に纏めた。
【表７】
【００５８】
＜実施例７ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の温度の最適値及び熱安定性＞
ニトリルヒドラターゼ活性を、実施例１に従って、２０乃至７０℃の範囲の種々の温度で測定した。ニトリルヒドラターゼ活性のための温度の最適値は６０℃であった（図２）。
【００５９】
ニトリルヒドラターゼ活性の熱安定性を測定するために、細胞懸濁液を１５分間、４０乃至７０℃の範囲の種々の温度でインキュベーションした。その後、ニトリルヒドラターゼ活性を、実施例１に従って２０℃で測定した。温度範囲が４０乃至６０℃で１５分インキュベーションした後のニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性に対応した（図３）。
【００６０】
＜実施例８ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ最適値及びｐＨ安定性＞
ニトリルヒドラターゼ活性を、種々の緩衝液（０．１Ｍ）を用いて、３乃至１２の範囲の種々のｐＨ値で、実施例１に従って測定した。ニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ最適値は６〜７であった（図４）。
【００６１】
ニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ安定性を測定するために、細胞緩衝液を４乃至１０の範囲の種々のｐＨ値で、２４時間２０℃でインキュベートした。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、分離された細胞を洗浄し、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に再懸濁した。ニトリルヒドラターゼ活性を実施例１に従って測定した。５乃至１０の範囲のｐＨ値で２４時間インキュベーション後のニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性に対応した（図５）。
【００６２】
＜実施例９ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性への３−シアノピリジン濃度の影響＞
細胞懸濁液を、０乃至１０％（ｗ／ｖ）の範囲にある３−シアノピリジンの種々の濃度で、６０分間、２０℃でインキュベーションした。細胞を分離し、洗浄し、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に再懸濁した。ニトリルヒドラターゼ活性を実施例１に従って測定した。０乃至２０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲にある３−シアノピリジンで６０分インキュベーションした後のニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性に対応した（図６）。
【００６３】
＜実施例１０ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすニコチンアミド濃度の影響＞
細胞懸濁液を、２４時間、２０℃で、０乃至２０％（ｗ／ｖ）の範囲にあるニコチンアミドの種々の濃度でインキュベーションした。細胞を分離し、洗浄し、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に再懸濁した。ニトリルヒドラターゼ活性を実施例１に従って測定した。０乃至２０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲のニコチンアミドで２４時間インキュベーションした後のニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性とほぼ対応した（図７）。
【００６４】
＜実施例１１ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に関する３−シアノピリジンのＫＭ値の測定＞
３−シアノピリジン（１．０〜１．０Ｍ、１．０〜１．８ｍＬ）、ＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ）、０．７〜０．１ｍＬ）、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．３ｍＬ）、および細胞懸濁液（０．０１ｍＬ）を含む反応混合物を、攪拌しながら１０分間、３０℃でインキュベーションした。反応混合物の全量は、３−シアノピリジンの濃度に応じて、２．０〜２．２ｍＬであった。反応は、ＨＣｌ（２Ｍ、０．１ｍＬ）を添加して停止した。反応混合物を遠心分離した後に（１２０００ｒｐｍ、５分）、生成したニコチンアミド量を、実施例１に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。測定したＫＭ値は、１６０ｍＭであった（図１０）。
【００６５】
＜実施例１２ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性と、周知の微生物であるアミコラトプシス種（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．） ＮＡ４０、ロドコッカス種 ＧＦ２７０、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性との比較＞
ロドコッカス種 ＦＺ４、ロドコッカス種 ＧＦ２７０（ＤＳＭ１２２１１；ＷＯ９９／０５３０６）、アミコラトプシス種 ＮＡ４０（ＤＳＭ１１６１７；ＷＯ９９／０５３０６）、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性に関する基質３−シアノピリジンのＫＭ値を、実施例１１に従って、各々の微生物を用いて測定した。アミコラトプシス種 ＮＡ４０株及びロドコッカス種 ＦＺ４株のＫＭ値は、他の微生物よりも低い（表８）。
【表８】
【００６６】
ロドコッカス種 ＦＺ４、ロドコッカス種 ＧＦ２７０、アミコラトプシス種 ＮＡ４０、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１の、ニトリルヒドラターゼ活性の熱安定性を、実施例７に従って各々の微生物を用いて、表９に記載したインキュベーション条件で測定した。ロドコッカス種 ＦＺ４株のニトリルヒドラターゼ活性は、他の微生物のニトリルヒドラターゼ活性と比較して最も高い熱安定性を示した。
【表９】
【００６７】
ロドコッカス種 ＦＺ４、ロドコッカス種 ＧＦ２７０、アミコラトプシス種 ＮＡ４０、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼす３−シアノピリジン濃度の影響を、実施例９に従って、各々の微生物を用い、表１０に記載した３−シアノピリジン濃度で測定した。ロドコッカス種 ＦＺ４株及びロドコッカス種 ＧＦ２７０株のニトリルヒドラターゼ活性は、３−シアノピリジンに対する最も高い耐性を示した。
【表１０】
【００６８】
ロドコッカス種 ＦＺ４、ロドコッカス種 ＧＦ２７０、アミコラトプシス種 ＮＡ４０、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１の、ニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすニコチンアミド濃度の影響を、実施例９に従って、各々の微生物を用い、表１１に記載したニコチンアミド濃度で測定した。ロドコッカス種 ＦＺ４株及びロドコッカス種 ＧＦ２７０株のニトリルヒドラターゼ活性は、ニコチンアミドに対する最も高い耐性を示した（表１１）。
【表１１】
【００６９】
＜実施例１３ ロドコッカス種 ＦＺ４を用いた３−シアノピリジンのニコチンアミドへの生体内変換＞
３−シアノピリジンの溶液を、細胞懸濁液（１３．７ｍｇの細胞乾燥重量、４ｍＬ）及びリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０、１６ｍＬ）を含む混合物（Ｖｏｒｌａｇｅ）に、４２分割して（ｉｎ ４２ ｐｏｒｔｉｏｎｓ）（４２×０．５２ｇ＝２１．８ｇ、０．２１ｍｏｌ）添加した。反応混合物中の３−シアノピリジンが定量的にニコチンアミドに転化された後、３−シアノピリジンの次の一部を混合物に加えた。反応混合物は反応過程の間に固形になった。２５．７ｇ（定量的な収量（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｙｉｅｌｄ））のニコチンアミドが生成した。
【００７０】
＜実施例１４ ロドコッカス種 ＦＺ４を用いたアセトニトリルのアセトアミドへの生体内変換＞
アセトニトリル（５ｍＬ、９５ｍｏｌ）を、８０分間、２０℃で、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、４．５ｍＬ）及び細胞懸濁液（４．８８ｍｇの細胞乾燥重量、０．５ｍＬ）を含む反応混合物に滴下しつつ加えた。後反応（ａｆｔｅｒｒｅａｃｔｉｏｎ）を２０℃で攪拌しつつ行なった。反応中のアセトアミドの生成を、ＨＰＬＣ法（ウォーターズ・スフェリソブ ５μＯＤＳ２（４．６×１５０ｍｍ）；ＫＨ２ＰＯ４（１０ｍＭ、ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝９９／１（ｖ／ｖ）；１．０ｍＬ／分；２１０ｎｍ）によってモニターした。１２０分以内に、反応培地に蓄積されたアセトアミド６．１４ｇ（定量的な収量）が生成した（図１）。
【００７１】
＜実施例１５ アセトニトリルのアセトアミドへの生体内変換における、ロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすアセトニトリル濃度の影響＞
アセトニトリル（０．２〜１９．０Ｍ、１．０〜１．６ｍＬ）、ＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ）、０．６〜０．０ｍＬ）、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．３ｍＬ）、および、細胞懸濁液（０．１ｍＬ）を含む反応混合物を、攪拌しつつ、２０℃で１０分間インキュベーションした。全反応容量は２．０ｍＬであった。反応は、ＭｅＯＨを添加して停止した。反応混合物を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）し、生成したアセトアミド量を、実施例１４に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。ニトリルヒドラターゼ活性は、アセトニトリル濃度が０．１乃至１５Ｍの範囲内でほぼ一定であった（図８）。
【００７２】
＜実施例１６ ロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすアセトニトリル濃度の影響＞
細胞を、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）中でアセトニトリル（０．０〜１５．０Ｍ）と共に２０℃で１時間インキュベーションした。細胞懸濁液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）し、ＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ））に再懸濁した。この細胞懸濁液（０．１ｍＬ）と、３−シアノピリジン（０．５Ｍ、１．０ｍＬ）、ＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ）、０．６ｍＬ）、および、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．３ｍＬ）を含む反応混合物を、攪拌しつつ５分間、３０℃でインキュベーションした。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。反応混合物を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）し、生成したアセトアミド量を、実施例１４に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。
【００７３】
ニトリルヒドラターゼ活性は、アセトニトリル濃度範囲０乃至３Ｍで１時間のインキュベーションした後、ほぼ一定であった。６Ｍのアセトニトリルで１時間インキュベーションした後でも、元のニトリルヒドラターゼ活性の６０％が存在した。９Ｍのアセトニトリルで１時間インキュベーションした後でも、元のニトリルヒドラターゼ活性の約３５％が存在した（図９）。
【００７４】
＜実施例１７ 色素陰性（ｐｉｇｍｅｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）ロドコッカス種 ＦＺ４突然変異体の発生＞
ロドコッカス種ＦＺ４株を「肉栄養（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）」培地（５０ｍＬ）に接種し、ＯＤ６１０ｎｍが６．２９に達するまで、攪拌しつつ２８℃でインキュベーションした。次に、前培養物（１０ｍＬ）を「肉栄養」培地（２５ｍＬ）に移し、ＯＤ６１０ｎｍが１．９０に達するまで、攪拌しつつ２８℃でインキュベーションした。得られた培養物（１０ｍＬ）を遠心分離（８０００ｒｐｍ、５分）した。上清を捨て、沈殿した細胞をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。細胞懸濁液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、５分）した。上清を捨て、沈殿した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（５ｍｌ）に懸濁した。細胞懸濁液をガラスペトリ皿（直径９０ｍｍ）に移した。細胞を、ＵＶランプ（１５Ｗ、２５４ｎｍ）で、２５ｃｍの距離から１７分間照射した。その後、細胞を、２倍濃度の「肉栄養」培地で４日間、２８℃で攪拌しつつインキュベーションした。得られた培養物を１００倍に希釈し、そのうちの１００μｌを「プレート計数寒天（ｐｌａｔｅ ｃｏｕｎｔ ａｇａｒ）」上に塗布し、２８℃でインキュベーションした。各プレートにつき、ほぼ１５０のシングルコロニーが増殖した。赤い色素の形成を誘導するために、プレートを日光に晒した。色素陰性突然変異体コロニーは、色素陽性突然変異体及び赤い野生型のコロニーと容易に区別することができた。
【００７５】
＜実施例１８ ロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼの精製＞
ロドコッカス種 ＦＺ４を、実施例３に従って、２Ｌの醗酵槽で培養した。培養物を遠心分離し、沈殿した細胞をＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ））に再懸濁した。細胞懸濁液を、酪酸（４４ｍＭ）を含むリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に移し、超音波処理した。細胞片を遠心分離によって除去した。上清を、表１２に示すようにニトリルヒドラターゼを精製するために使用した。ニトリルヒドラターゼ活性は実施例１に従って測定したが、細胞懸濁液の代わりにそれぞれの抽出液を用いた。
【表１２】
【００７６】
＜実施例１９ 精製ニトリルヒドラターゼの分子量の測定＞
分子量をＨＰＬＣ法によって測定した（ＴＳＫゲル Ｇ３００ＳＷ（０．７５×６０ｃｍ）、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）及び塩化カリウム（０．２Ｍ）；０．７ｍＬ／分；２８０ｎｍ）。ニトリルヒドラターゼの分子量は４６５ｋＤａであった（図１１）。
【００７７】
ニトリルヒドラターゼは２７．７ｋＤａの分子量を有するαサブユニットと、３１．２ｋＤａの分子量を有するβサブユニットとから構成される（図１２）。
【００７８】
＜実施例２０ 精製ニトリルヒドラターゼの熱安定性＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．６９７μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）及びリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）を含む溶液を、２０乃至７０℃の範囲にある種々の温度で６０分間インキュベーションした。その後、この溶液を氷浴によって２０℃に冷却し、３−シアノピリジン（０．５Ｍ、０．５００ｍＬ）を添加した。反応混合物を１０分間２０℃でインキュベーションした。反応は、ＭｅＯＨを添加して停止した。生成したニコチンアミド量は、実施例１に従ってＨＰＬＣ法で測定した。４０℃以上の温度で６０分間インキュベーションした後に、ニトリルヒドラターゼ活性は減少し、５０℃で６０分間インキュベーションした後には、ニトリルヒドラターゼ活性は元の活性の約２５％のみであった（図１５）。
【００７９】
＜実施例２１ 精製ニトリルヒドラターゼのｐＨ最適値＞
３−シアノピリジン（０．５Ｍ、０．５００ｍＬ）、ニトリルヒドラターゼ溶液（０．６９７μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、およびｐＨ範囲４乃至１１の種々の緩衝液（０．１Ｍ、０．０２５ｍＬ）を含む反応混合物を、１０分間、２０℃でインキュベートした。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。生成したニコチンアミド量は、実施例１に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。ニトリルヒドラターゼのｐＨ最適値は、６．０乃至６．５の範囲にあった（図１６）。
【００８０】
＜実施例２２ 精製ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（８．３６μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．４７ｍＬ）、ｐＨ範囲４．０乃至１１．０の種々の緩衝液（０．３Ｍ、０．１０ｍＬ）、および蒸留水（０．０３ｍＬ）を含む溶液を、３０分間、２０℃でインキュベーションした。インキュベーションしたニトリルヒドラターゼ溶液の一部（０．０５ｍＬ）、３−シアノピリジン（０．５Ｍ、０．５ｍＬ）、および各々の緩衝液（０．１Ｍ、０．４５ｍＬ）を含む反応混合物を、１０分間、２０℃でインキュベーションした。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。生成したニコチンアミド量は、実施例１に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。ｐＨ範囲６乃至８における６０分のインキュベーション後の、ニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性と略対応した（図１７）。
【００８１】
＜実施例２３ 精製ニトリルヒドラターゼの基質特異性＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．６９５μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、種々の基質（０．５００ｍＬ）、およびリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）を含む反応混合物を、２０℃で５乃至１０分間インキュベーションした。用いた基質濃度は、０．０１５乃至０．２５０Ｍの範囲であった。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。生成したアミド量は、ＨＰＬＣ法によって測定した。その結果は表１３に纏めた。試験した複数の基質のうち、ニトリルヒドラターゼ活性は基質アセトニトリルに関して最も高い活性を示した。
【表１３】
【００８２】
＜実施例２４ 精製ニトリルヒドラターゼに及ぼす潜在的阻害因子の影響＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．６９５μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）、蒸留水（０．１５０ｍＬ）、および種々の潜在的阻害因子（０．１００ｍＬ）を含む溶液を、２０℃で５分間インキュベーションした。その後、３−シアノピリジン（１．０Ｍ、０．２５０ｍＬ）を添加した。反応混合物中の阻害因子の濃度は１．０ｍＭであった。反応混合物は２０℃で１０分間インキュベーションした。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。生成したニコチンアミド量は、実施例１に従って、ＨＰＬＣ法によって測定した。その結果は表１４に纏めた。試験した複数の潜在的阻害因子の中で、ヒドロキシルアミン及びシアン化カリウムは最強の阻害作用を示す。
【表１４】
【００８３】
＜実施例２５ 精製ニトリルヒドラターゼの活性に及ぼす金属イオンの影響＞
精製されたニトリルヒドラターゼの活性に及ぼす金属イオンの影響を、実施例２４に従って、潜在的阻害因子の代わりに金属イオンを添加して行った。反応混合物中の金属イオンの濃度は１．０ｍＭであった。その結果は表１５に纏めた。試験された金属イオンのうち、銀カチオン及び二価の水銀カチオンのみが阻害作用を示す。
【表１５】
【００８４】
＜実施例２６ 精製ニトリルヒドラターゼの３−シアノピリジンに関するＫＭ値の測定＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．０６９７μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、およびリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）を含む溶液に、種々の濃度（３．１〜８００ｍＭ、０．５００ｍＬ）の３−シアノピリジンを添加した。反応混合物を２０℃で１０分間インキュベーションした。反応はメタノールを添加して停止し、生成したニコチンアミド量を実施例１に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。３−シアノピリジンに対するＫＭ値は８０．５ｍＭであった（図１３）。
【００８５】
＜実施例２７ 精製ニトリルヒドラターゼのアセトニトリルに関するＫＭ値の測定＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．０６９７μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、およびリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）を含む溶液に、種々の濃度（２．５〜８０ｍＭ、０．５００ｍＬ）のアセトニトリルを添加した。反応混合物を２０℃で１０分間インキュベーションした。反応はメタノールを添加して停止し、生成したアセトアミド量をＨＰＬＣ法によって実施例１４に従って測定した。アセトニトリルに対するＫＭ値は２．８４ｍＭであった（図１４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ロドコッカス種 ＦＺ４の静止細胞を用いた、アセトニトリルのアセトアミドへの生体内変換を示す。
【図２】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の温度最適値を示す。
【図３】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の熱安定性を示す。
【図４】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ最適値を示す。
【図５】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ安定性を示す。
【図６】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の３−シアノピリジン耐性を示す。
【図７】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性のニコチンアミド耐性を示す。
【図８】
アセトニトリルのアセトアミドへの生体内変換において、静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすアセトニトリル濃度の影響を示す。
【図９】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすアセトニトリル濃度の影響を示す。
【図１０】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性を３−シアノピリジン濃度の関数として示す。
【図１１】
ニトリルヒドラターゼ及び基準タンパク質の分子量を、それぞれのＨＰＬＣ保持時間の関数として示した対数図。
【図１２】
ニトリルヒドラターゼのサブユニット及び基準タンパク質の分子量を、それぞれＳＤＳ−ＰａｇｅのＲＦ値の関数として示した対数図。
【図１３】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性を３−シアノピリジン濃度の関数として示す。
【図１４】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性をアセトニトリル濃度の関数として示す。
【図１５】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼの熱安定性を示す。
【図１６】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼのｐＨ最適値を示す。
【図１７】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性を示すことできる微生物、ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素、該微生物又は該酵素を用いてアミド類を産生するための方法、並びにアセトニトリルの廃棄物を除去するための該微生物の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えばニコチン酸アミド、ビタミンＢ複合体のビタミンのような、動物及びヒトにとって必須であるアミド類を産生するための複数の生物工学的な方法が既に知られている。
【０００３】
例えば、ＥＰ−Ａ ０ ３０７ ９２６は、ロドコッカス・ロドコラスＪ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ１）によって、３−シアノピリジンをニコチン酸アミドに転化することを記載している。この方法は、ロドコッカス・ロドコラスＪ１が赤色なので、産物が退色するという欠点を有する。更に、この微生物は、３−シアノピリジン基質に対するＫＭ値が高く、温度に耐性が低く、３−シアノピリジンに対する耐性が低い。
【０００４】
ＷＯ ９９／０５３０６は、例えば、ロドコッカス属、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属、及びアクチノマドゥラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属の微生物を用いて、対応するニトリルから開始してニコチン酸アミドを産出する方法を記載している。この方法の欠点は、使用したアミコラトプシス属の微生物が、温度が上昇すると非活性化されることである。更に、これらの微生物は、３−シアノピリジン及びニコチン酸アミドに対して低い耐性を有する。記述したロドコッカス属の微生物は、３−シアノピリジンに対するＫＭ値が高く、温度安定性が低い。従って、この方法は工業的な方法としては非経済的である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、比較的安定であり、例えば３−シアノピリジンのような基質に対して比較的低いＫＭ値を有し、それ故、当該のアミドを非常に高収率かつ高純度で単離することができる、アミド類を産生するためのより経済的な方法のために用いることができる微生物を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この目的は、請求項１に記載の微生物、請求項５又は７に記載の酵素、及び請求項８に記載の方法によって達成される。
【０００７】
本発明の微生物は、例えば、土壌サンプル、スラッジ又は廃水から適切に選択することによって、通常の微生物学的な技術を用いて得られる。それらの微生物は、一般式が
【化４】
【０００８】
ピリジンアルドキシムとしては、ピリジン−２−，ピリジン−３−又はピリジン−４−アルドキシムを用いることができる。
【０００９】
選択に適したニトリル類は、特に、後に生体内変換で基質として用いられるものでもあり、例えばアセトニトリル（酢酸ニトリル）、プロビオニトリル、ブチロニトリル、クロトンニトリル、アジピン酸ニトリル及びマロン酸ニトリルである。
【００１０】
好ましいコバルトイオン源は、「コバルトイオンを発生するコバルト化合物」、例えば、塩化コバルト、硫酸コバルト、及び酢酸コバルトのようなＣｏ２＋又はＣｏ３＋塩である。好ましいコバルト化合物は、例えばＣｏＣｌ２のようなＣｏ２＋塩である。しかしながら、金属コバルト又は他のコバルト化合物と共に培養することもできる。通常、コバルト又はコバルト化合物を培地中に１乃至３０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１乃至２０ｍｇ／Ｌの量で用いる。
【００１１】
アンモニウム塩として、例えば、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４又は（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４のようなリン酸アンモニウムを用いることができる。
【００１２】
実際の生体内変換の前に微生物を適切な培地で培養する。適切な培地は、例えば、表１又は５に記載された培地である。
【００１３】
培養は、通常、温度２０乃至４０℃、ｐＨ５乃至８で行うが、好ましくは、温度２５乃至３５℃、ｐＨ６乃至７．５で行う。
【００１４】
便法として、酵素誘導物質を添加することによって、培養中に有効な酵素すなわちニトリルヒドラターゼを誘導する。
【００１５】
使用可能な酵素誘導物質は、飽和又は不飽和脂肪族ニトリル類又は対応するアミド類である。使用可能な脂肪族ニトリルは、例えばブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル又はイソバレロニトリルのような全てのＣ２ 〜７のアルカンニトリル、あるいは、例えばメタクリロニトリル又はクロトンニトリルのようなＣ３ 〜 ７のアルケンニトリルである。使用可能な脂肪族アミドは、例えばブチルアミド、イソブチルアミド、バレルアミド、又はプロピオンアミドのようなすべてのＣ２〜７のアルカンアミド、あるいは、例えばメタクリルアミド又はクロトンアミドのようなＣ３ 〜７のアルケンアミドである。好ましい酵素誘導物質は、メタクリルアミド、ブチルアミド、イソブチルアミド、バレルアミド、メタクリロニトリル、クロトンアミド、ブチロニトリル、及びイソブチロニトリルである。酵素誘導物質としてメタクリルニトリルを用いることが特に好ましい。
【００１６】
本発明の微生物は、少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性を示し、酵素活性が、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液中、ｐＨ７．０、および２０℃で１時間、３Ｍのアセトニトリルでインキュベーションした後に安定であることを意味する、すなわち、わずか１０％の活性が減少したのみである。好ましい微生物は、上記の条件下で少なくとも６Ｍの濃度のアセトニトリルに１時間耐性を示し、活性の減少は５０％のみである。特に好ましい微生物は、上記の条件下で少なくとも９Ｍの濃度のアセトニトリルに１時間耐性を示し、活性の減少は７０％のみである。
【００１７】
特に非常に好ましい微生物では、１５Ｍ及び１９Ｍの濃度のアセトニトリル（純粋なアセトニトリルに匹敵する）で数分間インキュベーションした後でさえ酵素活性は安定的である。１５Ｍのアセトニトリルで１０分間インキュベーションした後の酵素活性の減少は、１０％より少ない。
【００１８】
本発明の微生物は高い熱安定性、すなわち、高温において、これまで知られた微生物よりも高い安定性を有する。本発明の微生物の酵素活性の減少は、好ましくは、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液中、６０℃で１時間インキュベーションした後でわずか１０％であり、上記条件下で２時間インキュベーションした後でわずか４０％である。
【００１９】
ここでの酵素活性とは、ニトリルヒドラターゼ活性、特に、基質３−シアノピリジンに関するニトリルヒドラターゼ活性を意味する。
【００２０】
本発明の微生物の他の特性は、好ましくは用いられる基質３−シアノピリジン、及び、それらから生成したニコチンアミドに高耐性であり、
３−シアノピリジンに関するＫＭ値が低い。その他、特に優れた特性は、微生物が、アセトアミドを、３０℃で飽和したアセトアミド溶液の濃度（１００ｍＬの水の中に約２２０―２３０ｇのアセトアミド）よりも高い濃度で蓄積することができることである。
【００２１】
好ましい微生物はロドコッカス属に属している。特に好ましい微生物はロドコッカス種ＦＺ４株、及びそれらの、機能的に等しい変異体及び突然変異体である。機能的に等しい変異体及び突然変異体とは、少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性を示す変異体及び突然変異体を意味する。特に非常に好ましくは、「色素のない」ロドコッカス株、すなわち、所望の産物の退色をもたらすだろう赤色を欠損した株である。このような株は、場合によっては、紫外線照射又は突然変異誘発化学による突然変異誘発によって色素形成の微生物から容易に産生される。
【００２２】
ロドコッカス種ＦＺ４株を、ブダペスト条約に基づき、寄託番号ＤＳＭ１３５９７として、２０００年７月１１日に、Ｄ３８１２４ブラウンシュヴァイク マッシェローダー・ヴェーク１ｂに所在するドイッチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン・ゲーエムベーハー（ＤＳＭＺ）に寄託した。この微生物は、その同定データに基づいてこれまで知られていたロドコッカス種のいずれかに分類されることができず、従って、新種に分類された。
【００２３】
ロドコッカス種ＦＺ４株の機能的に等しい変異体及び突然変異体を、自然突然変異によって、あるいは、例えば紫外線照射又は突然変異誘発化学によって生成することができる。ロドコッカス種ＦＺ４株の好ましい変異体及び突然変異体は、「色素のない」、すなわち、所望の産物の退色をもたらすだろう赤色を有しないものである。
【００２４】
酵素抽出物は、例えば超音波方法、フレンチプレス、又はリゾチーム法によって、例えば、微生物を粉砕して得ることができる。
【００２５】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する本発明の酵素は、上記の微生物から得ることができる。それらは好ましくは、ロドコッカス属の微生物、特に、ロドコッカス種ＦＺ４（ＤＳＭ １３５９７）の微生物から得ることができる。
【００２６】
前記した酵素は、特に、以下の特性、
ａ）アセトニトリル基質に対するＫＭ値が２．８４±１．００ｍＭ、及び３−シアノピリジン基質に対するＫＭ値が８０．５±１５．０ｍＭ、
それぞれの場合で０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液中、ｐＨ７．０、２０℃；ｂ）２０℃の０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液中における最適ｐＨが６．５±１．０；
を有する。
【００２７】
特に、前記した酵素は、
ｃ）ＨＰＬＣによって測定した天然分子量が４６５±５０ｋＤａ；
を有する。
【００２８】
実際の生体内変換は、上記の微生物、それらの微生物の酵素抽出物、または単離した酵素を使用して行われることができる。ロドコッカス種ＦＺ４の微生物によって生体内変換を行なうことが好ましい。
【００２９】
生体内変換に使用可能な基質は、一般式
【化５】
【００３０】
一般式ＩＩにおいて、置換基Ｒ１はＣ１ 〜 ６のアルキル基、Ｃ２ 〜６のアルケニル基、又は一般式
【化６】
【００３１】
一般式ＩＶにおいて、Ｘはチッ素原子又は−ＣＨ＝であり、置換基Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１ 〜 ６のアルキル基、又はＣ２ 〜 ６のアルケニル基である。
【００３２】
使用可能なＣ１ 〜６のアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、第３ブチル、イソブチル、ペンチル及びその異性体、および、ヘキシル及びその異性体である。使用可能なＣ２ 〜６のアルケニル基は、例えば、ビニル、アリル、１−プロペン−１−イルおよび１−プロペン−２−イルである。
【００３３】
使用可能なハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。
【００３４】
一般式ＩＩのニトリルの好ましい代表は、アセトニトリル、ブチロニトリル、アクリルニトリル、プロピオニトリル、クロトンニトリル、２−シアノピリジン、３−シアノピリジン、４−シアノピリジン、ベンゾニトリル、フルオロベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル及びブロモベンゾニトリルである。最も好ましい基質はアセトニトリル及び３−シアノピリジンである。
【００３５】
生体内変換は、好ましくは器質を一度だけ、または連続的に添加して行う。当業者に周知のように、用いられる基質濃度は、用いられる基質の溶解度に左右される。
【００３６】
静止（非増殖）細胞を用いた方法を実行することは好ましい。
【００３７】
生体内変換のための培地としては、当業者に周知である、例えば、低モル濃度のリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、及びホウ酸緩衝液を用いることができる。低モル濃度のリン酸緩衝液は、好ましくは０．０１乃至０．５Ｍのリン酸緩衝液、特に好ましくは０．０５乃至０．２５Ｍのリン酸緩衝液を意味する。
【００３８】
生体内変換は、好ましくは５乃至５０℃の温度で、特に好ましくは２０乃至４０℃の温度で行なう。好ましいｐＨは５〜１０、特に好ましくは６〜７．５である。
【００３９】
一般式ＩＩのニトリルを変換した後に、一般式
【化７】
【００４０】
本発明はさらに、アセトニトリル廃棄物の除去のための上記微生物、特にロドコッカス属の使用に関する。
【００４１】
アセトニトリルは、例えばＨＰＬＣによって用いられ、最後には廃棄物として処理されねばならない溶媒である。本発明が除去するアセトニトリル廃棄物は、純粋なアセトニトリルに匹敵する、最大１９Ｍの濃度のアセトニトリルであり得る。０．２５乃至１５．０Ｍの、好ましくは１乃至１０Ｍのアセトニトリル溶液又は懸濁液を用いることが都合良い。
【００４２】
アセトニトリルの廃棄物を除去するために、微生物を、５乃至５０℃の温度で、好ましくは２０乃至４０℃で用いることが都合よい。ｐＨ値は５〜１０、好ましくは６〜８であることが都合よい。
【００４３】
廃棄物を除去するための、アセトニトリルのアセトアミドへの転化時間は、アセトニトリルの濃度に左右され、例えば、９．５Ｍのアセトアミド溶液又は懸濁液を生成するのにｐＨ７．０、約２０℃の温度で、約２時間かかる。
【００４４】
ＦＺ４（ＤＳＭ１３５９７）株の同定
【００４５】
（Ａ）化学分類学的マーカー
１．ペプチドグリカンの診断用アミノ酸：メソ−ジアミノピメリン酸
２．ミコール酸：Ｃ４０乃至Ｃ４８の鎖長を有するミコール酸を呈する
３．脂肪酸パターン；直線状の、飽和及び不飽和脂肪、および、ツベルクロステアリン酸（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）の高い含量を呈する。脂肪酸パターンに基づいて、ＦＺ４株を、ロドコッカス属であると同定した。
【００４６】
（Ｂ）従来法のマーカー
ＦＺ４株の細胞の肉眼で見える外観及び形態は、ロドコッカス・ロドコラスに類似した。ＦＺ４株のコロニーはサーモンピンク（ＲＡＬ３０２２）であり、若い培養物は桿菌及び球菌へと発展する分岐した球菌を発展させた。
【００４７】
化学分類学的及び従来法のマーカーによって、ＦＺ４株を、ロドコッカス・ロドコラス種に属するものと同定したが、相関係数は低かった。
【００４８】
（Ｃ）１６ｓ ｒＤＮＡの先頭の５００塩基の分析
１６Ｓ ｒＤＮＡの先頭の５００塩基のシーケンスによって、ロドコッカス・ロドコラス種の典型的な代表株ロドコッカス・ロドコラスＤＳＭ ４３２４１のものとわずか９７．７％の相同性が示され、他のロドコッカス・ロドコラス基準株とは９９．１％の相同性が示された。ＦＺ４株の１６ＳｒＤＮＡの先頭の５００塩基のシーケンスと、ロドコッカス・ロドコラスＤＳＭ ４３２４１株のシーケンスとの相同性が９９．５％を下回ったため、ＦＺ４株をロドコッカス・ロドコラス種に属するものと同定することは不可能である。
【００４９】
従って、ＦＺ４株を、ロドコッカス属の新種と同定した。
【００５０】
【実施例】
＜実施例１ ニトリルヒドラターゼ活性の測定＞
３−シアノピリジン（１．０Ｍ、１．０ｍＬ）と、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．５ｍＬ）と、細胞懸濁液（０．５ｍＬ）を含む反応混合物を、攪拌しながら２０℃で５分間インキュベーションして、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。反応は、ＨＣｌ（５Ｍ、０．１ｍＬ）を添加して停止した。反応混合物を濾過した後（０．２μｍ フィルタ）、生成したニコチンアミドの量をＨＰＬＣによって測定した（ウォーターズ・スフェリソブ（Ｗａｌｔｅｒｓ Ｓｐｈｅｒｉｓｏｂ） ５μ ＯＤＳ２（４．６×１５０ｍｍ）；ＫＨ２ＰＯ４／Ｈ３ＰＯ４（１０ｍＭ、ｐＨ２．８）／アセトニトリル＝９：１（ｖ／ｖ）；１ｍＬ／分；２３０ｎｍ）。全活性を、毎分１ｍｌ当たりに生成したニコチンアミドのμｍｏｌで示し、比活性を、毎分１ｍｌのＯＤ６１０ｎｍ当たり生成したニコチンアミドのμｍｏｌ（μｍｏｌ／分×ｍｌ×ＯＤ６１０）として示した。
【００５１】
＜実施例２ ロドコッカス種ＦＺ４株（ＤＳＭ １３５９７）の単離＞
Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｌ． １９９８， １７０， ８５−９０には、ロドコッカス種 ＹＨ３−３株（ＴＰＵ３４５３）株が、３−ピリジンアルドキシムを、３−シアノピリジン及びニコチンアミドを経てニコチン酸へ代謝することが開示されている。この場合では、ロドコッカス種ＹＨ３−３株（ＴＰＵ３４５３）のアルドキシムデヒドラターゼ活性、およびニトリルヒドラターゼ活性、およびアミダーゼ活性は、種々のアルドキシムおよびニトリルによって誘導された。
【００５２】
種々の土壌試料を表１に示した増菌培地に接種し、７乃至１０日間３７℃でインキュベーションした。得られた培養物を同様の培地に移し、再び７乃至１０日間３７℃で培養した。この手順を３回繰り返した。続いて、培養物を希釈して、プレートに塗布した。プレートを３７℃で５日間インキュベーションした後に、個々のコロニーを得た。個々のコロニーのニトリルヒドラターゼ活性の存在の有無を、例１に従って試験した。このようにして、ロドコッカス種ＦＺ４株（ＤＳＭ１３５９７）を単離した。３−ピリジンアルドキシムの代わりに、ニトリル類、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、クロトンニトリル、アジポニトリル、及びマロンニトリルを炭素源として用いることも可能である。
【表１】
＜実施例３ 培養中において共同因子がロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼす影響＞
ロドコッカス種ＦＺ４株（ＤＳＭ１３５９７）を表２に示した前培養培地に接種して、攪拌しながら１乃至２日間２８℃でインキュベーションした。前培養物を、ＣｏＣｌ２又はＦｅＳＯ４を含む、表３に示した基本培地に移して、攪拌しながら２乃至３日間２８℃で培養した。ニトリルヒドラターゼ活性を、実施例１に従って測定した。結果は表４に纏めた。ニトリルヒドラターゼ活性は、ロドコッカス種ＦＺ４をコバルトの存在下で培養したときのみ存在した。
【表２】
＜実施例４ 培養中において誘導物質がロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性へ及ぼす影響＞
ロドコッカス種ＦＺ４株（ＤＳＭ１３５９７）を表２に示した前培養培地に接種して、攪拌しながら１乃至２日間２８℃でインキュベーションした。前培養物を、異なる誘導物質を含む、表５に示した培地に移し、攪拌しながら３日間２８℃で培養した。ニトリルヒドラターゼ活性を実施例１に従って測定した。結果は表６に纏めた。ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼは、培養中に誘導物質が存在したときのみ発現した。
【表５】
＜実施例５：ロドコッカス種ＦＺ４の培養＞
ロドコッカス種ＦＺ４を表２に示した前培養培地に接種して、攪拌しながら１乃至２日間２８℃でインキュベーションした。前培養物を、誘導物質として６ｇ／Ｌのメタクリルアミドを含む、表５に示した培地に移し、攪拌しながら３日間２８℃で培養した。４８時間後に追加のメタクリルアミド（０．２（ｖ／ｖ））を添加した。
【００５６】
実施例６乃至１３では、ロドコッカス種ＦＺ４の静止細胞を用いた。
【００５７】
＜実施例６ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の基質特異性＞
異なる基質に関するロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性を、３−シアノピリジンの代わりに適切な基質を用い、用いられた基質に応じてＨＰＬＣの条件を変更した以外は例１に従って測定した。ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の基質特異性を、ロドコッカス・ロドコラスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性の基質特異性と比較して表７に纏めた。
【表７】
＜実施例７ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の温度の最適値及び熱安定性＞
ニトリルヒドラターゼ活性を、実施例１に従って、２０乃至７０℃の範囲の種々の温度で測定した。ニトリルヒドラターゼ活性のための温度の最適値は６０℃であった（図２）。
【００５９】
ニトリルヒドラターゼ活性の熱安定性を測定するために、細胞懸濁液を１５分間、４０乃至７０℃の範囲の種々の温度でインキュベーションした。その後、ニトリルヒドラターゼ活性を、実施例１に従って２０℃で測定した。温度範囲が４０乃至６０℃で１５分インキュベーションした後のニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性に対応した（図３）。
【００６０】
＜実施例８ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ最適値及びｐＨ安定性＞
ニトリルヒドラターゼ活性を、種々の緩衝液（０．１Ｍ）を用いて、３乃至１２の範囲の種々のｐＨ値で、実施例１に従って測定した。ニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ最適値は６〜７であった（図４）。
【００６１】
ニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ安定性を測定するために、細胞緩衝液を４乃至１０の範囲の種々のｐＨ値で、２４時間２０℃でインキュベートした。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、分離された細胞を洗浄し、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に再懸濁した。ニトリルヒドラターゼ活性を実施例１に従って測定した。５乃至１０の範囲のｐＨ値で２４時間インキュベーション後のニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性に対応した（図５）。
【００６２】
＜実施例９ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性への３−シアノピリジン濃度の影響＞
細胞懸濁液を、０乃至１０％（ｗ／ｖ）の範囲にある３−シアノピリジンの種々の濃度で、６０分間、２０℃でインキュベーションした。細胞を分離し、洗浄し、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に再懸濁した。ニトリルヒドラターゼ活性を実施例１に従って測定した。０乃至２０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲にある３−シアノピリジンで６０分インキュベーションした後のニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性に対応した（図６）。
【００６３】
＜実施例１０ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすニコチンアミド濃度の影響＞
細胞懸濁液を、２４時間、２０℃で、０乃至２０％（ｗ／ｖ）の範囲にあるニコチンアミドの種々の濃度でインキュベーションした。細胞を分離し、洗浄し、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に再懸濁した。ニトリルヒドラターゼ活性を実施例１に従って測定した。０乃至２０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲のニコチンアミドで２４時間インキュベーションした後のニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性とほぼ対応した（図７）。
【００６４】
＜実施例１１ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に関する３−シアノピリジンのＫＭ値の測定＞
３−シアノピリジン（１．０〜１．０Ｍ、１．０〜１．８ｍＬ）、ＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ）、０．７〜０．１ｍＬ）、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．３ｍＬ）、および細胞懸濁液（０．０１ｍＬ）を含む反応混合物を、攪拌しながら１０分間、３０℃でインキュベーションした。反応混合物の全量は、３−シアノピリジンの濃度に応じて、２．０〜２．２ｍＬであった。反応は、ＨＣｌ（２Ｍ、０．１ｍＬ）を添加して停止した。反応混合物を遠心分離した後に（１２０００ｒｐｍ、５分）、生成したニコチンアミド量を、実施例１に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。測定したＫＭ値は、１６０ｍＭであった（図１０）。
【００６５】
＜実施例１２ ロドコッカス種ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性と、周知の微生物であるアミコラトプシス種（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．） ＮＡ４０、ロドコッカス種 ＧＦ２７０、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性との比較＞
ロドコッカス種 ＦＺ４、ロドコッカス種 ＧＦ２７０（ＤＳＭ１２２１１；ＷＯ９９／０５３０６）、アミコラトプシス種 ＮＡ４０（ＤＳＭ１１６１７；ＷＯ９９／０５３０６）、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性に関する基質３−シアノピリジンのＫＭ値を、実施例１１に従って、各々の微生物を用いて測定した。アミコラトプシス種 ＮＡ４０株及びロドコッカス種 ＦＺ４株のＫＭ値は、他の微生物よりも低い（表８）。
【表８】
ロドコッカス種 ＦＺ４、ロドコッカス種 ＧＦ２７０、アミコラトプシス種 ＮＡ４０、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１の、ニトリルヒドラターゼ活性の熱安定性を、実施例７に従って各々の微生物を用いて、表９に記載したインキュベーション条件で測定した。ロドコッカス種 ＦＺ４株のニトリルヒドラターゼ活性は、他の微生物のニトリルヒドラターゼ活性と比較して最も高い熱安定性を示した。
【表９】
ロドコッカス種 ＦＺ４、ロドコッカス種 ＧＦ２７０、アミコラトプシス種 ＮＡ４０、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼす３−シアノピリジン濃度の影響を、実施例９に従って、各々の微生物を用い、表１０に記載した３−シアノピリジン濃度で測定した。ロドコッカス種 ＦＺ４株及びロドコッカス種 ＧＦ２７０株のニトリルヒドラターゼ活性は、３−シアノピリジンに対する最も高い耐性を示した。
【表１０】
ロドコッカス種 ＦＺ４、ロドコッカス種 ＧＦ２７０、アミコラトプシス種 ＮＡ４０、及びロドコッカス・ロドコラスＪ１の、ニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすニコチンアミド濃度の影響を、実施例９に従って、各々の微生物を用い、表１１に記載したニコチンアミド濃度で測定した。ロドコッカス種 ＦＺ４株及びロドコッカス種 ＧＦ２７０株のニトリルヒドラターゼ活性は、ニコチンアミドに対する最も高い耐性を示した（表１１）。
【表１１】
＜実施例１３ ロドコッカス種 ＦＺ４を用いた３−シアノピリジンのニコチンアミドへの生体内変換＞
３−シアノピリジンの溶液を、細胞懸濁液（１３．７ｍｇの細胞乾燥重量、４ｍＬ）及びリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０、１６ｍＬ）を含む混合物（Ｖｏｒｌａｇｅ）に、４２分割して（ｉｎ ４２ ｐｏｒｔｉｏｎｓ）（４２×０．５２ｇ＝２１．８ｇ、０．２１ｍｏｌ）添加した。反応混合物中の３−シアノピリジンが定量的にニコチンアミドに転化された後、３−シアノピリジンの次の一部を混合物に加えた。反応混合物は反応過程の間に固形になった。２５．７ｇ（定量的な収量（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｙｉｅｌｄ））のニコチンアミドが生成した。
【００７０】
＜実施例１４ ロドコッカス種 ＦＺ４を用いたアセトニトリルのアセトアミドへの生体内変換＞
アセトニトリル（５ｍＬ、９５ｍｏｌ）を、８０分間、２０℃で、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、４．５ｍＬ）及び細胞懸濁液（４．８８ｍｇの細胞乾燥重量、０．５ｍＬ）を含む反応混合物に滴下しつつ加えた。後反応（ａｆｔｅｒｒｅａｃｔｉｏｎ）を２０℃で攪拌しつつ行なった。反応中のアセトアミドの生成を、ＨＰＬＣ法（ウォーターズ・スフェリソブ ５μＯＤＳ２（４．６×１５０ｍｍ）；ＫＨ２ＰＯ４（１０ｍＭ、ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝９９／１（ｖ／ｖ）；１．０ｍＬ／分；２１０ｎｍ）によってモニターした。１２０分以内に、反応培地に蓄積されたアセトアミド６．１４ｇ（定量的な収量）が生成した（図１）。
【００７１】
＜実施例１５ アセトニトリルのアセトアミドへの生体内変換における、ロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすアセトニトリル濃度の影響＞
アセトニトリル（０．２〜１９．０Ｍ、１．０〜１．６ｍＬ）、ＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ）、０．６〜０．０ｍＬ）、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．３ｍＬ）、および、細胞懸濁液（０．１ｍＬ）を含む反応混合物を、攪拌しつつ、２０℃で１０分間インキュベーションした。全反応容量は２．０ｍＬであった。反応は、ＭｅＯＨを添加して停止した。反応混合物を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）し、生成したアセトアミド量を、実施例１４に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。ニトリルヒドラターゼ活性は、アセトニトリル濃度が０．１乃至１５Ｍの範囲内でほぼ一定であった（図８）。
【００７２】
＜実施例１６ ロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすアセトニトリル濃度の影響＞
細胞を、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）中でアセトニトリル（０．０〜１５．０Ｍ）と共に２０℃で１時間インキュベーションした。細胞懸濁液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）し、ＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ））に再懸濁した。この細胞懸濁液（０．１ｍＬ）と、３−シアノピリジン（０．５Ｍ、１．０ｍＬ）、ＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ）、０．６ｍＬ）、および、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．３ｍＬ）を含む反応混合物を、攪拌しつつ５分間、３０℃でインキュベーションした。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。反応混合物を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）し、生成したアセトアミド量を、実施例１４に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。
【００７３】
ニトリルヒドラターゼ活性は、アセトニトリル濃度範囲０乃至３Ｍで１時間のインキュベーションした後、ほぼ一定であった。６Ｍのアセトニトリルで１時間インキュベーションした後でも、元のニトリルヒドラターゼ活性の６０％が存在した。９Ｍのアセトニトリルで１時間インキュベーションした後でも、元のニトリルヒドラターゼ活性の約３５％が存在した（図９）。
【００７４】
＜実施例１７ 色素陰性（ｐｉｇｍｅｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）ロドコッカス種 ＦＺ４突然変異体の発生＞
ロドコッカス種ＦＺ４株を「肉栄養（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）」培地（５０ｍＬ）に接種し、ＯＤ６１０ｎｍが６．２９に達するまで、攪拌しつつ２８℃でインキュベーションした。次に、前培養物（１０ｍＬ）を「肉栄養」培地（２５ｍＬ）に移し、ＯＤ６１０ｎｍが１．９０に達するまで、攪拌しつつ２８℃でインキュベーションした。得られた培養物（１０ｍＬ）を遠心分離（８０００ｒｐｍ、５分）した。上清を捨て、沈殿した細胞をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。細胞懸濁液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、５分）した。上清を捨て、沈殿した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（５ｍｌ）に懸濁した。細胞懸濁液をガラスペトリ皿（直径９０ｍｍ）に移した。細胞を、ＵＶランプ（１５Ｗ、２５４ｎｍ）で、２５ｃｍの距離から１７分間照射した。その後、細胞を、２倍濃度の「肉栄養」培地で４日間、２８℃で攪拌しつつインキュベーションした。得られた培養物を１００倍に希釈し、そのうちの１００μｌを「プレート計数寒天（ｐｌａｔｅ ｃｏｕｎｔ ａｇａｒ）」上に塗布し、２８℃でインキュベーションした。各プレートにつき、ほぼ１５０のシングルコロニーが増殖した。赤い色素の形成を誘導するために、プレートを日光に晒した。色素陰性突然変異体コロニーは、色素陽性突然変異体及び赤い野生型のコロニーと容易に区別することができた。
【００７５】
＜実施例１８ ロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼの精製＞
ロドコッカス種 ＦＺ４を、実施例３に従って、２Ｌの醗酵槽で培養した。培養物を遠心分離し、沈殿した細胞をＮａＣｌ水溶液（０．８５％（ｗ／ｖ））に再懸濁した。細胞懸濁液を、酪酸（４４ｍＭ）を含むリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に移し、超音波処理した。細胞片を遠心分離によって除去した。上清を、表１２に示すようにニトリルヒドラターゼを精製するために使用した。ニトリルヒドラターゼ活性は実施例１に従って測定したが、細胞懸濁液の代わりにそれぞれの抽出液を用いた。
【表１２】
＜実施例１９ 精製ニトリルヒドラターゼの分子量の測定＞
分子量をＨＰＬＣ法によって測定した（ＴＳＫゲル Ｇ３００ＳＷ（０．７５×６０ｃｍ）、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）及び塩化カリウム（０．２Ｍ）；０．７ｍＬ／分；２８０ｎｍ）。ニトリルヒドラターゼの分子量は４６５ｋＤａであった（図１１）。
【００７７】
ニトリルヒドラターゼは２７．７ｋＤａの分子量を有するαサブユニットと、３１．２ｋＤａの分子量を有するβサブユニットとから構成される（図１２）。
【００７８】
＜実施例２０ 精製ニトリルヒドラターゼの熱安定性＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．６９７μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）及びリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）を含む溶液を、２０乃至７０℃の範囲にある種々の温度で６０分間インキュベーションした。その後、この溶液を氷浴によって２０℃に冷却し、３−シアノピリジン（０．５Ｍ、０．５００ｍＬ）を添加した。反応混合物を１０分間２０℃でインキュベーションした。反応は、ＭｅＯＨを添加して停止した。生成したニコチンアミド量は、実施例１に従ってＨＰＬＣ法で測定した。４０℃以上の温度で６０分間インキュベーションした後に、ニトリルヒドラターゼ活性は減少し、５０℃で６０分間インキュベーションした後には、ニトリルヒドラターゼ活性は元の活性の約２５％のみであった（図１５）。
【００７９】
＜実施例２１ 精製ニトリルヒドラターゼのｐＨ最適値＞
３−シアノピリジン（０．５Ｍ、０．５００ｍＬ）、ニトリルヒドラターゼ溶液（０．６９７μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、およびｐＨ範囲４乃至１１の種々の緩衝液（０．１Ｍ、０．０２５ｍＬ）を含む反応混合物を、１０分間、２０℃でインキュベートした。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。生成したニコチンアミド量は、実施例１に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。ニトリルヒドラターゼのｐＨ最適値は、６．０乃至６．５の範囲にあった（図１６）。
【００８０】
＜実施例２２ 精製ニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（８．３６μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．４７ｍＬ）、ｐＨ範囲４．０乃至１１．０の種々の緩衝液（０．３Ｍ、０．１０ｍＬ）、および蒸留水（０．０３ｍＬ）を含む溶液を、３０分間、２０℃でインキュベーションした。インキュベーションしたニトリルヒドラターゼ溶液の一部（０．０５ｍＬ）、３−シアノピリジン（０．５Ｍ、０．５ｍＬ）、および各々の緩衝液（０．１Ｍ、０．４５ｍＬ）を含む反応混合物を、１０分間、２０℃でインキュベーションした。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。生成したニコチンアミド量は、実施例１に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。ｐＨ範囲６乃至８における６０分のインキュベーション後の、ニトリルヒドラターゼ活性は、元のニトリルヒドラターゼ活性と略対応した（図１７）。
【００８１】
＜実施例２３ 精製ニトリルヒドラターゼの基質特異性＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．６９５μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、種々の基質（０．５００ｍＬ）、およびリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）を含む反応混合物を、２０℃で５乃至１０分間インキュベーションした。用いた基質濃度は、０．０１５乃至０．２５０Ｍの範囲であった。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。生成したアミド量は、ＨＰＬＣ法によって測定した。その結果は表１３に纏めた。試験した複数の基質のうち、ニトリルヒドラターゼ活性は基質アセトニトリルに関して最も高い活性を示した。
【表１３】
＜実施例２４ 精製ニトリルヒドラターゼに及ぼす潜在的阻害因子の影響＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．６９５μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）、蒸留水（０．１５０ｍＬ）、および種々の潜在的阻害因子（０．１００ｍＬ）を含む溶液を、２０℃で５分間インキュベーションした。その後、３−シアノピリジン（１．０Ｍ、０．２５０ｍＬ）を添加した。反応混合物中の阻害因子の濃度は１．０ｍＭであった。反応混合物は２０℃で１０分間インキュベーションした。反応はＭｅＯＨを添加して停止した。生成したニコチンアミド量は、実施例１に従って、ＨＰＬＣ法によって測定した。その結果は表１４に纏めた。試験した複数の潜在的阻害因子の中で、ヒドロキシルアミン及びシアン化カリウムは最強の阻害作用を示す。
【表１４】
＜実施例２５ 精製ニトリルヒドラターゼの活性に及ぼす金属イオンの影響＞
精製されたニトリルヒドラターゼの活性に及ぼす金属イオンの影響を、実施例２４に従って、潜在的阻害因子の代わりに金属イオンを添加して行った。反応混合物中の金属イオンの濃度は１．０ｍＭであった。その結果は表１５に纏めた。試験された金属イオンのうち、銀カチオン及び二価の水銀カチオンのみが阻害作用を示す。
【表１５】
＜実施例２６ 精製ニトリルヒドラターゼの３−シアノピリジンに関するＫＭ値の測定＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．０６９７μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、およびリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）を含む溶液に、種々の濃度（３．１〜８００ｍＭ、０．５００ｍＬ）の３−シアノピリジンを添加した。反応混合物を２０℃で１０分間インキュベーションした。反応はメタノールを添加して停止し、生成したニコチンアミド量を実施例１に従ってＨＰＬＣ法によって測定した。３−シアノピリジンに対するＫＭ値は８０．５ｍＭであった（図１３）。
【００８５】
＜実施例２７ 精製ニトリルヒドラターゼのアセトニトリルに関するＫＭ値の測定＞
ニトリルヒドラターゼ溶液（０．０６９７μｍｏｌ／ｍｉｎ、０．０２５ｍＬ）、およびリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、０．４７５ｍＬ）を含む溶液に、種々の濃度（２．５〜８０ｍＭ、０．５００ｍＬ）のアセトニトリルを添加した。反応混合物を２０℃で１０分間インキュベーションした。反応はメタノールを添加して停止し、生成したアセトアミド量をＨＰＬＣ法によって実施例１４に従って測定した。アセトニトリルに対するＫＭ値は２．８４ｍＭであった（図１４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ロドコッカス種 ＦＺ４の静止細胞を用いた、アセトニトリルのアセトアミドへの生体内変換を示す。
【図２】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の温度最適値を示す。
【図３】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の熱安定性を示す。
【図４】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ最適値を示す。
【図５】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性のｐＨ安定性を示す。
【図６】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性の３−シアノピリジン耐性を示す。
【図７】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性のニコチンアミド耐性を示す。
【図８】
アセトニトリルのアセトアミドへの生体内変換において、静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすアセトニトリル濃度の影響を示す。
【図９】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性に及ぼすアセトニトリル濃度の影響を示す。
【図１０】
静止細胞におけるロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性を３−シアノピリジン濃度の関数として示す。
【図１１】
ニトリルヒドラターゼ及び基準タンパク質の分子量を、それぞれのＨＰＬＣ保持時間の関数として示した対数図。
【図１２】
ニトリルヒドラターゼのサブユニット及び基準タンパク質の分子量を、それぞれＳＤＳ−ＰａｇｅのＲＦ値の関数として示した対数図。
【図１３】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性を３−シアノピリジン濃度の関数として示す。
【図１４】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼ活性をアセトニトリル濃度の関数として示す。
【図１５】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼの熱安定性を示す。
【図１６】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼのｐＨ最適値を示す。
【図１７】
精製されたロドコッカス種 ＦＺ４のニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性を示す。
Claims (11)
- 微生物であって、少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性であることを特徴とする微生物。
- 請求項１に記載の微生物であって、ロドコッカス属である微生物。
- 請求項２に記載の微生物であって、ＤＳＭ番号１３５９７で寄託された、ロドコッカス種 ＦＺ４と称する株である微生物。
- 請求項１乃至３のいずれか１に記載の微生物から得られる酵素抽出物。
- 請求項１乃至３のいずれか１に記載の微生物から得られるニトリルヒドラターゼ。
- 請求項５に記載のニトリルヒドラターゼであって、
ａ）アセトニトリル基質に対するＫＭ値が２．８４±１．００ｍＭであり、３−シアノピリジン基質に対するＫＭ値が８０．５±１５．０ｍＭであり；
ｂ）ｐＨ最適値がｐＨ６．５±１．０である、
ことを特徴とするニトリルヒドラターゼ。 - ニトリルヒドラターゼであって、
ａ）アセトニトリル基質に対するＫＭ値が２．８４±１．００ｍＭであり、３−シアノピリジン基質に対するＫＭ値が８０．５±１５．０ｍＭであり；
ｂ）ｐＨ最適値がｐＨ６．５±１．０である、
ことを特徴とするニトリルヒドラターゼ。 - 一般式
Ｒ１はＣ１ 〜６のアルキル遊離基、Ｃ２ 〜 ６のアルケニル基、又は一般式
Ｘはチッ素原子又は−ＣＨ＝であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１ 〜６のアルキル基、又はＣ２ 〜６のアルケニル基であり、一般式
- 請求項８に記載の方法であって、使用される前記ニトリルは３−シアノピリジン又はアセトニトリルであることを特徴とする方法。
- 請求項８および９のいずれかに記載の方法であって、前記反応は温度５乃至５０℃、およびｐＨ５乃至１０で行なうことを特徴とする方法。
- アセトニトリルの廃棄物を除去するための、請求項１乃至３のいずれか１に記載の微生物の使用。
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