SK288061B6 - Microbiological method for producing amides - Google Patents

Microbiological method for producing amides Download PDF

Info

Publication number
SK288061B6
SK288061B6 SK624-2003A SK6242003A SK288061B6 SK 288061 B6 SK288061 B6 SK 288061B6 SK 6242003 A SK6242003 A SK 6242003A SK 288061 B6 SK288061 B6 SK 288061B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
rhodococcus
nitrile hydratase
activity
acetonitrile
cyanopyridine
Prior art date
Application number
SK624-2003A
Other languages
English (en)
Other versions
SK6242003A3 (en
Inventor
Karen Tracey Robins
Toru Nagasawa
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of SK6242003A3 publication Critical patent/SK6242003A3/sk
Publication of SK288061B6 publication Critical patent/SK288061B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

The invention relates to micro-organisms of strain Rhodococus which are capable of tolerating an acetonitrile concentration of at least 3 M. In addition it relates to a novel method for producing amides of general formula (III) based on the corresponding nitriles using said micro-organisms. The invention also relates to the use of said micro-organisms for eliminating acetonitrile residues.

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka mikroorganizmov, ktoré sú schopné tolerovať acetonitril v koncentrácii aspoň 3M, enzýmu s aktivitou nitrilhydratázy, spôsobu výroby amidov použitím týchto mikroorganizmov, prípadne enzýmu a taktiež použitia týchto mikroorganizmov na odstránenie acetonitrilových odpadov.
Doterajší stav techniky
Na výrobu amidov, ako napríklad amidu kyseliny nikotínovej, esenciálneho vitamínu komplexu vitamínu B pre zvieratá a človeka, je známych niekoľko biotechnologických spôsobov.
Napríklad EP-A 0 307 926 opisuje premenu 3-kyánpyridínu na amid kyseliny nikotínovej pomocou Rhodococcus rhodochrous Jl. Nevýhodou tohto spôsobuje červené zafarbenie Rhodococcus rhodochrous Jl, čím dochádza k zafarbeniu produktu. Navyše tento mikroorganizmus má vysokú hodnotu KM vzhľadom na substrát 3-kyánpyridín, má nízku tepelnú toleranciu a malú toleranciu proti 3-kyánpyridínu.
WO 99/5306 opisuje napríklad spôsob výroby amidu kyseliny nikotínovej zo zodpovedajúceho nitrilu pomocou mikroorganizmov rodu Rhodococcus, Amycolatopsis a Actinomadura. Nevýhodou tohto spôsobuje to, že použité mikroorganizmy rodu Amycolatopsis sa pri vyšších teplotách inaktivujú. Navyše majú tieto mikroorganizmy malú toleranciu proti 3-kyánpyridínu a amidu kyseliny nikotínovej. Mikroorganizmy rodu Rhodococcus, ktoré sa opisujú, majú vysokú hodnotu KM vzhľadom na substrát 3-kyánpyridín a nízku tepelnú stabilitu. Z týchto dôvodov tento spôsob pre veľkovýrobu nie je hospodárny.
Úlohou predloženého vynálezu bolo poskytnúť mikroorganizmy, ktoré sú stabilnejšie, majú nižšiu hodnotu KM napríklad pre substrát 3-kyánpyridín a tak sú použiteľné pre hospodárny spôsob výroby amidov. Zodpovedajúci amid sa pritom môže izolovať vo veľmi dobrom výťažku a čistote. Táto úloha sa rieši pomocou mikrooganizmov podľa nároku 1, enzýmom podľa nároku 5 alebo 7 a spôsobom podľa nároku 8.
Podstata vynálezu
Mikroorganizmy podľa vynálezu sa získajú vhodnou selekciou napríklad zo vzoriek pôdy, kalu alebo odpadových vôd pomocou zvyčajných mikrobiologických techník. Účelne sa mikroorganizmy podrobia selekcii pestovaním s pyridinaldoxímom všeobecného vzorca (I)
CHNOH (i) alebo s nitrilmi ako zdrojom uhlíka v prítomnosti iónov kobaltu a napríklad extraktom kvasníc a/alebo amónnych solí. Zo získaných kultúr sa potom selektujú také mikroorganizmy, ktoré sú schopné tolerovať acetonitril v koncentrácii aspoň 3M, a ktoré sú schopné premieňať nitrily, ako napríklad 3-kyánpyridín a acetonitril na zodpovedajúci amid.
Ako pyridinaldoxímy sa môžu použiť pyridín-2-, pyridín-3- alebo pyridín-4-aldoxím.
Nitrily vhodné na selekciu sú najmä také, ktoré sa majú použiť ako substrát pri neskoršej biotransformácii, napríklad acetonitril (nitril kyseliny octovej), propionitril, butyronitril, nitril kyseliny krotónovej a nitril kyseliny malónovej.
Ako zdroj pre kobaltové ióny sa výhodne používajú tzv. „zlúčeniny kobaltu generujúce kobaltové ióny“, napríklad soli Co2+ alebo Co3+ ako chloridy, sulfáty a acetáty kobaltu. Výhodne sa ako zlúčenina kobaltu použije soľ Co2+ ako napríklad CoCl2. Pestovanie sa však môže uskutočňovať tiež spolu s kovovým kobaltom alebo s inými zlúčeninami kobaltu. Zvyčajne sa kobalt alebo zlúčeniny kobaltu používajú v množstve od 1 do 30 mg/1, výhodne od 1 do 20 mg/1 v kultivačnom médiu.
Ako amónne soli sa môžu použiť napríklad amónne fosfáty ako (NH4)2HPO4 alebo (NH4)H2PO4. Mikroorganizmy sa pred vlastnou biotransformáciou pestujú vo vhodných médiách. Vhodné kultivačné médiá sú napríklad médiá, ktoré sa opisujú v tabuľkách 3 alebo 5.
Pestovanie sa zvyčajne uskutočňuje pri teplote od 20 do 40 °C a pri hodnote pH medzi 5 a 8, výhodne pri teplote od 25 do 35 °C a pri hodnote pH medzi 6 a 7,5.
Počas pestovania sa účelne indukujú účinné enzýmy, nitrilhydratázy, pridaním induktora enzýmu.
Ako indikátory enzýmu sa môžu použiť nasýtené alebo nenasýtené alifatické nitrily alebo zodpovedajúce amidy. Ako alifatické nitrily sa môžu použiť všetky C2.7-alkán-nitrily, ako napríklad butyronitril, izobutyronitril, nitril kyseliny valerovej alebo nitril kyseliny izovalerovej, alebo C3.7-alkénnitrily, ako napríklad metakrylnitril alebo nitril kyseliny krotónovej. Ako alifatické amidy sa môžu použiť všetky C2.7-alkánamidy, ako
SK 288061 Β6 napríklad butyramid, izobutyramid, amid kyseliny valerovej alebo amid kyseliny propiónovej, alebo C3.7-alkénamidy, ako napríklad metakrylamid alebo amid kyseliny krotónovej. Výhodné induktory enzýmu sú metakrylamid, butyramid, izobutyramid, amid kyseliny valerovej, metakrylnitril, amid kyseliny krotónovej, butyronitril alebo izobutyronitril. Obzvlášť výhodný induktor enzýmu je metakrylnitril.
Mikroorganizmy podľa vynálezu sú schopné tolerovať koncentráciu acetonitrilu vo výške aspoň 3M. Tým sa rozumie to, že aktivita enzýmu je stabilná po 1 hodinovej inkubácii s 3M acetonitrilom v 0,1 M káliumfosfátovom tlmivom roztoku pri pH 7,0 a 20 °C, to znamená, že strata na aktivite je maximálne 10 %. Výhodné mikroroganizmy tolerujú koncentráciu acetonitrilu vo výške aspoň 6 M počas 1 hodiny za uvedených podmienok pri strate aktivity maximálne 50 %. Obzvlášť výhodné mikroorganizmy tolerujú koncentráciu acetonitrilu vo výške aspoň 9 M počas 1 hodiny za uvedených podmienok pri strate aktivity maximálne 70 %. Pri celkom najvýhodnejších mikroorganizmoch je samotná aktivita enzýmu po niekoľkominútovej inkubácii s 15 M a 19 M acetonitrilom (to zodpovedá čistému acetonitrilu) stabilná.
Strata aktivity enzýmu je tak pri inkubácii s 15 M acetonitrilom po 10 minútach menej ako 10 %.
Mikroorganizmy podľa vynálezu majú veľkú termickú stabilitu, to znamená, že majú vyššiu stabilitu pri vysokých teplotách než dosiaľ známe mikroorganizmy. Výhodne predstavuje strata aktivity enzýmu mikroorganizmov podľa vynálezu po jednohodinovej inkubácii v 0,1 M káliumfosfátovom tlmivom roztoku, pH 7,0 pri 60 °C maximálne 10 % a strata aktivity enzýmu po dvojhodinovej inkubácii za uvedených podmienok predstavuje maximálne 40 %.
Pod pojmom aktivita enzýmu sa tu rozumie aktivita nitrilhydratázy, najmä aktivita nitrilhydratázy proti 3-kyanpyridínu ako substrátu.
Ďalšími vlastnosťami mikroorganizmov podľa vynálezu sú vysoká tolerancia proti výhodne používanému substrátu 3-kyánpyridínu a proti produktu z toho vytvoreného amidu kyseliny nikotínovej a nízka hodnota KM vzhľadom na 3-kyánpyridín. Vynikajúcou vlastnosťou je tiež to, že môžu akumulovať acetamid vo vyššej koncentrácii než zodpovedá koncentrácii roztoku acetamidu nasýtenému pri 30 °C (cca 220-230 g acetamidu v 100 ml vody).
Výhodné mikroorganizmy patria k rodu Rhodococcus. Obzvlášť výhodné mikroorganizmy sú kmeň Rhodococcus sp. FZ4 a jeho funkčne ekvivalentné varianty a mutanty. Pod pojmom funkčne ekvivalentné varianty a mutanty sa rozumejú také varianty a mutanty, ktoré tolerujú acetonitril v koncentráciách najmenej 3 M. Celkom najvýhodnejšie sú „pigmentovo-negatívne“ kmene Rhodococcus, to znamená kmene, ktoré nie sú červené, a ktoré môžu spôsobiť zafarbenie požadovaného produktu. Takéto kmene sa dajú prípadne ľahko vytvoriť z mikroorganizmov tvoriacich pigment mutagenézou pomocou UV žiarenia alebo mutagennými chemikáliami.
Kmeň Rhodococcus sp. FZ4 sa uložil 11. júla 2000 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig podľa Budapeštianskej zmluvy pod depozitným číslom DSM 13597. Tento mikroorganizmus sa nemohol na základe jeho identifikačných údajov priradiť k žiadnemu dosiaľ známemu druhu Rhodococcus a teda sa priradil novému druhu.
Funkčne ekvivalentné varianty a mutanty kmeňa Rhodococcus sp. FZ4 sa môžu vytvoriť buď spontánnou mutáciou, alebo napríklad pomocou UV žiarenia, alebo mutagennými chemikáliami. Výhodné varianty a mutanty kmeňa Rhodococcus sp. FZ4 sú „pigmentovo negatívne“, to znamená, nemajú červenú farbu, ktorá môže spôsobiť zafarbenie požadovaného produktu.
Enzýmový extrakt je možné získať napríklad „otvorením“ mikroorganizmov, napríklad pomocou ultrazvuku, tlakovým zariadením podľa Frencha alebo pomocou lyzozymovej metódy.
Enzýmy podľa vynálezu s aktivitou nitrilhydratázy sa získajú z mikroorganizmov, ktoré sa opisujú skôr. Výhodne sa získajú z mikroorganizmov rodu Rhodococcus, najmä z mikroorganizmov Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597).
Tieto enzýmy majú najmä nasledujúce vlastnosti:
(a) hodnotu KM pre substrát acetonitril 2,84±l,00 mM a pre substrát 3-kyanopyridín 80,5±15,0 mM, zakaždým v 0,05 M káliumfosfátovom tlmivom roztoku, pH 7,0 pri 20 °C, (b) pH-optimum pri pH 6,5±l,0 pri 20 °C v 0,05 M káliumfosfátovom tlmivom roztoku, enzýmy majú najmä (c) natívnu molekulovú hmotnosť 465±50 kDa, stanovenú pomocou HPLC.
Vlastná biotransformácia sa môže uskutočňovať s mikroorganizmami, ktoré sa opisujú skôr, enzýmovým extraktom z týchto mikroorganizmov alebo s izolovaným enzýmom. Výhodne sa biotransformácia uskutočňuje s mikroorganizmami Rhodococcus sp. FZ4.
Ako substráty na biotransformáciu sa môžu použiť nitrily všeobecného vzorca (II)
R1—CN (II).
Vo všeobecnom vzorci (II) substituent R1 znamená Ci_6-alkylovú skupinu, C2.6-alkenylovú skupinu, alebo skupinu všeobecného vzorca (IV)
Vo všeobecnom vzorci (IV) X znamená atóm dusíka alebo -CH= a substituenty R2 a R3 znamenajú nezávisle od seba atóm vodíka, atóm halogénu, C ^-alkylovú skupinu alebo C2_6-alkenylovú skupinu.
Ako Ci_6-alkylová skupina sa môže použiť metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, terc- butyl, izobutyl, pentyl a jeho izoméry, ako aj hexyl a jeho izoméry. Ako C2.6-alkenylová skupina sa môže použiť napríklad vinyl, alyl, 1-propen-l-yl alebo l-propen-2-yl.
Ako halogén sa môže použiť F, Cl, Br alebo I.
Výhodnými zástupcami nitrilov všeobecného vzorca (II) sú acetonitril, butyronitril, akrylnitril, propionitril, nitril kyseliny krotónovej, 2-kyánpyridín, 3-kyánpyridín, 4-kyánpyridín, benzonitril, fluórbenzonitril, chlórbenzonitril a brómbenzonitril. Najvýhodnejšie substráty sú acetonitril a 3-kyánpyridín.
Výhodne sa biotransformácia uskutočňuje pri jednorazovom alebo kontinuálnom pridaní substrátu. Ako je odborníkovi známe, použiteľná koncentrácia substrátu je závislá od rozpustnosti substrátu, ktorý sa použije.
Výhodne sa spôsob uskutočňuje s bunkami v pokoji (s nerastúcimi bunkami).
Ako médiá na biotranformáciu sa môžu použiť v odbore obvyklé médiá, napríklad nízkomolekulové fosfátové tlmivé roztoky, tlmivý roztok HEPES, citrátový tlmivý roztok a borátový tlmivý roztok. Z nízkomolekulových fosfátových tlmivých roztokov je výhodný 0,01 až 0,5 M fosfátový tlmivý roztok, zvlášť je výhodný 0,05 až 0,25 M fosfátový tlmivý roztok.
Výhodne sa biotransformácia uskutočňuje pri teplote od 5 do 50 °C, zvlášť výhodne pri teplote od 20 do 40 °C. Výhodná hodnota pH je medzi 5 a 10, obzvlášť výhodná je medzi 6 a 7,5.
Po premene nitrilu všeobecného vzorca (II) sa potom môžu izolovať zodpovedajúce amidy všeobecného vzorca (III)
R1—CONH2 (III), kde R1 má už uvedený význam, prípadne po oddelení buniek pomocou zvyčajných metód spracovania, ako napríklad kryštalizáciou alebo rozstrekovým sušením.
Ďalším predmetom vynálezu je použitie opísaných mikroorganizmov, najmä rodu Rhodococcus, na odstránenie odpadov acetonitrilu.
Acetonitril je rozpúšťadlo, ktoré sa používa napríklad pri HPLC a nakoniec sa musí odstrániť ako odpad. Pri odstránení acetonitrilových odpadov podľa vynálezu môže byť acetonitril prítomný v koncentrácii maximálne až 19 M, čo zodpovedá čistému acetonitrilu. Výhodne sa používa 0,25 až 15,0 M, výhodne 1 až 10 M roztok, prípadne suspenzia acetonitrilu.
Výhodne sa mikroorganizmy používajú na odstránenie acetonitrilových odpadov pri teplote od 5 do 50 °C, výhodne pri teplote od 20 do 40 °C. Hodnota pH je výhodne medzi 5 a 10, výhodne medzi 6 a 8. Čas premeny acetonitrilu na acetamid na odstránenie odpadov závisí od koncentrácie acetonitrilu. Napríklad tento čas je cca 2 hodiny pri výrobe 9,5 M roztoku/suspenzia acetamidu, pri hodnote pH 7,0 a teplote cca 20 °C. Identifikácia kmeňa FZ4 (DSM 13597):
(A) Chemotaxonomické znaky:
1. Diagnostická aminokyselina pepetidoglykanu: kyselina mezo-diaminopimelová.
2. Kyseliny mykolové: prítomné sú kyseliny mykolové s dĺžkou reťazca od C40 do C48.
3. Vzorka mastných kyselín: prítomné sú lineárne, nasýtené a nenasýtené mastné kyseliny ako i vysoký podiel kyseliny tuberkulostearovej. Na základe vzorky mastných kyselín sa kmeň FZ4 identifikoval ako patriaci k rodu Rhodococcus.
(B) Konvenčné znaky:
Makroskopický vzhľad a morfológia buniek kmeňa FZ4 sa podobali Rhodococcus rhodochrous. Kolónie kmeňa FZ4 sú lososovo červené (RAL 3022) a mladé kultúry vyvíjali rozvetvené čiarky („hyfy“), ktoré sa vyvinuli do tvaru tyčiniek a kokov.
Na základe chemotaxonomických a konvenčných znakov sa kmeň FZ4 identifikoval ako patriaci k druhu Rhodococcus rhodochrous, ale s malým korelačným faktorom.
(C) Analýza prvých 500 báz 16S rDNA
Sekvencia prvých 500 báz 16S rDNA ukazuje podobnosť len 97,7 % k sekvencií typického zástupcu kmeňa predruh Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus rhodochrous DSM 43241, a 99,1 % k inému referenčnému kmeňu Rhodococcus rhodochrous. Pretože podobnosť sekvencie prvých 500 báz 16S rDNA kmeňa FZ4 k sekvencií kmeňa Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 bola pod 99,5 %, nemôže sa kmeň FZ4 identifikovať ako patriaci k druhu Rhodococcus rhodochrous. Kmeň FZ4 sa preto identifikoval ako nový druh vnútri rodu Rhodococcus.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Zobrazená je biotransformácia acetonitrilu na acetamid s bunkami v pokoji Rhodococcus sp. FZ4. Obr. 2: Zobrazené je teplotné optimum aktivity nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. FZ4. Obr. 3: Zobrazená je termická stabilita aktivity nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. V7A. Obr. 4: Zobrazené je pH-optimum aktivity nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 5: Zobrazená je pH-stabilita aktivity nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 6: Zobrazená je 3-kyanpyridínová tolerancia aktivity nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 7: Zobrazená je nikotínamidová tolerancia aktivity nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 8: Zobrazený je vplyv koncentrácie acetonitrilu na aktivitu nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. FZ4 pri biotransformácii acetonitrilu na acetamid.
Obr. 9: Zobrazený je vplyv koncentrácie acetonitrilu na aktivitu nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 10: Zobrazená je aktivita nitrilhydratázy v bunkách v pokoji Rhodococcus sp.
FZ4 v závislosti od koncentrácie 3-kyánpyridínu.
Obr. 11: Zobrazené je logaritmické vynesenie molekulových hmotností nitrilhydratázy a referenčných proteínov oproti príslušnej HPLC retenčnej dobe.
Obr. 12: Zobrazené je logaritmické vynesenie molekulových hmotností podjednotiek nitrilhydratázy a referenčných proteínov oproti príslušnej hodnote SDS Page RF.
Obr. 13: Zobrazená je aktivita čistenia nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4 v závislosti od koncentrácie 3-kyánpyridínu.
Obr. 14: Zobrazená je aktivita čistenej nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4 v závislosti od koncentrácie acetonitrilu.
Obr. 15: Zobrazená je termická stabilita čistenia nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 16: Zobrazené je pH-optimum čistenej nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 17: Zobrazená je pH-stabilita čistenej nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Stanovenie aktivity nitrilhydratázy
Na stanovenie aktivity nitrilhydratázy sa inkubovala reakčná zmes pozostávajúca z 3-kyánpyridínu (1,0 M; 1,0 ml), káliumfosfátového tlmivého roztoku (0,1 M, pH 7,0; 0,5 ml) a bunkovej suspenzie (0,5 ml) za miešania pri 20 °C počas 5 minút. Reakcia sa skončila pridaním HCI (5 M; 0,1 ml). Po filtrovaní (0,2 μιη filter) reakčnej zmesi sa množstvo vytvoreného amidu kyseliny nikotínovej stanovilo pomocou HPLC (Waters Spherisorb 5 μ ODS2 (4,6 x 150 mm); KH2PO4/H3PO4 (10 mM; pH 2,8)/acetonitril = 9:1 (obj./obj.); 4 ml/min.; 230 nm). Celková aktivita sa vyjadruje ako pmol vytvoreného amidu kyseliny nikotínovej/(min. x ml) a špecifická aktivita sa vyjadruje ako pmol vytvoreného amidu kyseliny nikotínovej/(min. x ml x GD^iOnm)·
Príklad 2
Izolácia kmeňa Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597)
V Árch. Microbiol. 1998, 170, 85-90 sa opisuje, že kmeň Rhodococcus sp. YH3-3 (TPU 3453) metabolizuje 3-pyridinaloxím cez 3-kyánpyridín a amid kyseliny nikotínovej na kyselinu nikotínovú. V tomto prípade sa aktivita aldoximdehydratázy rovnako ako aktivita nitrilhydratázy a amidázy kmeňa Rhodococcus sp. YH3-3 (TPU 3453) indukovala tak rôznymi aldoxímami, ako aj nitrilmi.
Do obohacovacieho média podľa tabuľky 1 sa inokulovali rôzne vzorky pôd a inkubovali sa 7 až 10 dní pri 37 °C. Takto získané kultúry sa preočkovali do rovnakého média a ešte raz sa kultivovali 7 až 10 dní pri 37 °C. Táto procedúra sa trikrát opakovala. Nakoniec sa kultúry zriedili a rozložili na doštičky. Po 5-dňovej inkubácii dosiek pri 37 °C sa získali jednotlivé kolónie. Jednotlivé kolónie sa testovali na prítomnosť aktivity nitrilhydratázy podľa príkladu 1. Týmto spôsobom sa izoloval kmeň Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597). Namiesto 3-pyridinaldoxímu sa môžu použiť i nitrily: acetonitril, propionitril, butyronitril, nitril kyseliny krotónovej, nitril kyseliny adipovej a nitril kyseliny malónovej ako zdroj uhlíka.
Tabuľka 1: Obohacovacie médium
Zložky Koncentrácia [g/i]
3-pyridinaldoxím 3,0 alebo 1,0
(NH4)2HPO4 2,0
kh2po4 2,0
NaCI 1,0
MgSO4.7 H2O 0,2
CoC12.6 H20 0,01
extrakt kvasníc 0,2
Vodou doplnené na 1 liter (pH 7,0)
Príklad 3
Vplyv kofaktorov počas pestovania na aktivitu nitrilhydratázy Rhodococcus sp. FZ4
Kmeň Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597) sa inokuloval do predkultúry podľa tabuľky 2 a za trepania sa inkuboval 1 až 2 dni pri teplote 28 °C. Predkultúra sa preočkovala do základného média podľa tabuľky 3, ktoré obsahovalo buď CoCl2, alebo FeSO4 a 2 až 3 dni sa kultivovala za trepania pri teplote 28 °C. Aktivita nitrilhydratázy sa stanovila podľa príkladu 1. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4. Aktivita nitrilhydratázy sa vyskytovala iba vtedy, keď sa Rhodococcus sp. FZ4 kultivoval v prítomnosti kobaltu.
Tabuľka 2: Predkultivačné médium
Zložky Koncentrácia [g/1]
Peptón 5,0
Mäsový extrakt 5,0
NaCI 2,0
Extrakt kvasníc 0,5
Vodou doplnené na 1 liter (pH 7,0)
Tabuľka 3: Základné médium
Zložky Koncentrácia [g/i]
Extrakt kvasníc 2,0
Peptón 0,2
L-glutamát, sodná soľ 15,0
MgSO4.7 H2O 0,5
CoC12.6 H2O (alebo FeSO4.7 H2O) 0,004
Amid kyseliny krotónovej 5,0
Vodou doplnené na 1 liter (pH 6,8)
Tabuľka 4: Vplyv kofaktorov počas pestovania na aktivitu nitrilhydratázy
Kofaktor Rast [OD^iOnm] Celková aktivita [pmol/(min.ml)] Špecifická aktivita [pmol/(min.ml. OD610nm)]
FeSO4 2,86 0,989 0,346
CoCl2 2,79 38,1 13,1
Príklad 4
Vplyv induktorov počas pestovania na aktivitu nitrilhydratázy Rhodococcus sp. FZ4
Kmeň Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597) sa inokuloval do predkultúry podľa tabuľky 2 a za trepania sa inkuboval 1 až 2 dni pri teplote 28 °C. Predkultúra sa preočkovala do kultivačného média podľa tabuľky 5, ktoré obsahovalo rôzne induktory a 3 dni sa kultivovala za trepania pri teplote 28 °C. Aktivita nitrilhydratázy sa stanovila podľa príkladu 1. Výsledky sú uvedené v tabuľke 6. Nitrilhydratáza z Rhodococcus sp. FZ4 sa exprimovala v priebehu pestovania len v prítomnosti induktora.
Tabuľka 5: Kultivačné médium
Zložky Koncentrácia [g/i]
Extrakt kvasníc l,o
Nátriumcitrát 10,0
Kukuričný extrakt 15,0
Induktor 0,2 % (hmotn./obj.)
KH2PO4 2,0
MgSO4.7 H2O 0,5
CoC12.6 H2O 0,015
Vodou doplnené na 1 liter (pH 7,0)
Tabuľka 6: Vplyv induktorov na aktivitu nitrilhydratázy
Induktor Rast [OD^ionm] Celková aktivita [pmol/(min.ml)] Špecifická aktivita [pmol/(min. ml. OD610nm)]
Metakrylamid 4,55 569 125
Izobutyramid 3,55 387 109
Butyramid 4,7 344 73,2
Metakrylnitril 4,61 330 71,5
Krotonamid 9,32 558 59,9
Butyronitril 5,26 307 58,4
Amid kyseliny Valérovej 5,61 322 57,5
Izobutyronitril 5,24 273 52,1
Nitril kyseliny krotónovej 8,24 407 49,4
Amid kyseliny propiónovej 5,17 149 28,7
Valeronitril 3,70 120 32,4
Nitril kyseliny izokaprónovej 4,72 134 28,5
Izovaleronitril 3,22 74,7 23,2
Nitril kyseliny kaprónovej 4,54 104 23,0
Propionitril 4,72 95,8 20,3
Akrylamid 5,17 60,5 11,7
3-Penténnitril 4,62 62 13,4
ε-Kaprolaktám 4,44 40,3 9,08
Benzonitril 5,62 40,3 7,17
Amid kyseliny pikolínovej 3,80 26,1 6,87
— 4,2 27,7 6,59
Kyanacetamid 4,75 30,9 6,50
Acetamid 4,37 21,6 4,98
Acetonitril 4,46 18,4 4,13
3-Kyánpyridín 5,54 12,3 2,21
Amid kyseliny izonikotínovej 5,03 10,9 2,17
Benzamid 3,88 8,24 2,12
SK 288061 Β6
Induktor Rast [ODóIOnm] Celková aktivita [pmol/(min.ml)] Špecifická aktivita [pmol/(min. ml. OD6i0nm)]
Akrylonitril 3,27 5,91 1,81
Amid kyseliny nikotínovej 3,55 4,94 1,39
Močovina 6,16 5,66 0,918
Príklad 5
Pestovanie Rhodococcus sp. FZ4
Kmeň Rhodococcus sp. FZ4 sa inokuloval do predkultúry podľa tabuľky 2 a za trepania sa inkuboval 1 až 5 2 dni pri teplote 28 °C. Predkultúra sa preočkovala do kultivačného média podľa tabuľky 5, ktoré obsahovalo g/1 metaktrylamidu ako induktor a 3 dni sa kultivovala za trepania pri teplote 28 °C. Po 48 hod. sa dodatočne „prikŕmilo“ metakrylamidom (0,2 % (obj./obj.)).
V príkladoch 6 až 13 sa použili bunky v pokoji Rhodococcus sp. FZ4.
Príklad 6
Substrátová špecifita aktivity nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4
Aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4 vzhľadom na rôzne substráty sa stanovila podľa príkladu 1 s tým, že namiesto 3-kyánpyridínu sa použil zodpovedajúci substrát a podmienky HPLC sa pozmenili v závislosti od použitého substrátu. Substrátová špecifita aktivity nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4 v porov15 naní so substrátovou špecifitou aktivity nitrilhydratázy z Rhodococcus rhodochrous J1 sa uvádza v tabuľke 7.
Tabuľka 7: Porovnanie substrátových špecifít aktivity nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4 a Rhodococcus rhodochrous J1
Substrát Rhodococcus sp. FZ4 Rhodococcus rhodochrous J1
Relatívna aktivita [%] Relatívna aktivita [%]
Acetonitril 646 0 (nitrilhydratáza A) 115 (nitrilhydratáza B)
Akrylonitril 498 478
Butyronitril 466 26
Propionitril 412 435
3-Kyánpyridín 100 100
4-Kyánpyridín 98,4 70
Nitril kyseliny krotónovej 92,1 78
Benzonitril 41,7 27
2-Kyánpyridín 39,3 45
m-Chlórbenzonitril 39,3 43
p-Chlórbenzonitril 8,25 13
Metakrylnitril 3,64 87
o-Chlórbenzonitril 0 2,8
Príklad 7
Teplotné minimum a termická stabilita aktivity nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4
Aktivita nitrilhydratázy sa stanovila podľa príkladu 1 pri rôznych teplotách v rozsahu od 20 do 70 °C.
Teplotné minimum pre aktivitu nitrilhydratázy bolo pri 60 °C (obr. 2).
Na zistenie termickej stability aktivity nitrilhydratáy sa bunková suspenzia inkubovala 15 minút pri rôznych teplotách v rozmedzí od 40 do 70 °C. Potom sa stanovila aktivita nitrilhydratázy podľa príkladu 1 pri 20 °C. Aktivita nitrilhydratázy po 15 minútovej inkubácii pri teplotách v rozmedzí od 40 do 60 °C zodpovedá pôvodnej aktivite nitrilhydratázy (obr. 3).
Príklad 8 pH-optimum a pH-stabilita aktivity nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4
Aktivita nitrilhydratázy sa stanovila podľa príkladu 1 pri rôznych hodnotách pH v rozsahu od 3 do 12 pri použití rôznych tlmivých roztokov (0,1 M). pH-optimum pre aktivitu nitrilhydratázy bolo medzi 6 a 7 (obr. 4).
Na zistenie pH-stability aktivity nitrilhydratázy sa bunková suspenzia inkubovala pri rôznych hodnotách pH v rozmedzí od 4 do 10 počas 24 hodín pri 20 °C. Potom sa bunková suspenzia odstredila. Oddelené bunky sa premyli a resuspendovali v tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M, pH 7,0). Aktivita nitrilhydratázy sa stanovila podľa príkladu 1. Aktivita nitrilhydratázy po 24 hodinovej inkubácii pri pH v rozmedzí od 5 do 10 zodpovedala približne pôvodnej aktivite nitrilhydratázy (obr. 5).
Príklad 9
Vplyv koncentrácie 3-kyánpyridínu na aktivitu nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4
Bunková suspenzia sa inkubovala pri rôznych koncentráciách 3-kyánpyridínu v rozmedzí od 0 do 10 % (hmotn./obj.) počas 60 minút pri 20 °C. Bunky sa oddelili, premyli a resuspendovali v tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M, pH 7,0). Aktivita nitrilhydratázy sa stanovila podľa príkladu 1. Aktivita nitrilhydratázy po 60 minútovej inkubácii pri koncentráciách 3-kyánpyridínu v rozmedzí od 0 do 20 % (hmotn./obj.) zodpovedala približne pôvodnej aktivite nitrilhydratázy (obr, 6).
Príklad 10
Vplyv koncentrácie amidu kyseliny nikotínovej na aktivitu nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4
Bunková suspenzia sa inkubovala pri rôznych koncentráciách amidu kyseliny nikotínovej v rozmedzí od 0 do 20 % (hmotn./obj.) počas 24 hodín pri 20 °C. Bunky sa oddelili, premyli a resuspendovali v 0,1 M tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M, pH 7,0). Aktivita nitrilhydratázy sa stanovila podľa príkladu 1. Aktivita nitrilhydratázy po 24 hodinovej inkubácii pri koncentráciách amidu kyseliny nikotínovej v rozmedzí od 0 do 20 % (hmotn./obj.) zodpovedala približne pôvodnej aktivite nitrilhydratázy (obr. 7).
Príklad 11
Stanovenie hodnoty KM pre 3-kyánpyridín pri nitrilhydratáze z Rhodococcus sp. FZ4
Reakčná zmes zložená z 3-kyánpyridínu (0,1-1,0 M; 1,0-1,8 ml), vodného roztoku NaCl (0,85 % (hmotn./obj.); 0,7 až 0,1 ml), tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,3 ml) a bunkovej suspenzie (0,01 ml) sa za trepania inkubovala počas 10 minút pri 30 °C. Celkový objem reakčnej zmesi bol podľa koncentrácie 3-kyánpyridínu medzi 2,0 až 2,2 ml. Reakcia sa zastavila pridaním HCI (2 M; 0,1 ml). Po odstredení (12 000 Upm (otáčok/min.); 5 minút) reakčnej zmesi sa množstvo vytvoreného amidu kyseliny nikotínovej stanovilo pomocou HPLC podľa príkladu 1. Hodnota KM bola 160 mM (obr. 10).
Príklad 12
Porovnanie aktivít nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4 s aktivitami nitrilhydratázy známych mikroorganizmov Amycolatopsis sp. NA40, Rhodococcus sp. GF 270 a Rhodococcus rhodochrous J1
Hodnoty KM pre substrát 3-kyánpyridín pre aktivity nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GF 270 (DSM 1221; WO 99/05306), Amycolatopsis sp. NA40 (DSM 11617; WO 99/05306) a Rhodococcus rhodochrous J1 sa stanovili podľa príkladu 11 použitím jednotlivých mikroorganizmov. Hodnoty KM kmeňov Amycolatopsis sp. NA40 a Rhodococcus sp. FZ4 sú nižšie ako ostatných mikroorganizmov (tabuľka 8).
Tabuľka 8: Porovnanie hodnôt KM pre substrát 3-kyánpyridín
Km [ mM]
Rhodococcus sp. FZ4 Rhodococcus sp. GF270 Amycolatopsis sp. NA40 Rhodococcus rhodochrous J1
160 >200 41,7 200
Termická stabilita aktivít nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GF 270, Amycolatopsis sp. NA40 a Rhodococcus rhodochrous J1 sa stanovila podľa príkladu 7 použitím určitého mikroorganizmu a za inkubačných podmienok uvedených v tabuľke 9. Aktivita nitrilhydratázy kmeňa Rhodococcus sp. FZ4 mala najväčšiu termickú stabilitu v porovnaní s aktivitou nitrilhydratázy ostatných mikroorganizmov.
Tabuľka 9: Porovnanie termickej stability aktivít nitrilhydratázy
Inkubačné podmienky Relatívna aktivita [%]
Rhodococcus sp. FZ4 Rhodococcus sp. GF270 Amycolatopsis sp. NA40 Rhodococcus rhodochrous J1
15 min. pri
50 °C 100 100 nba 100
60 °C 93 95 nba 80
70 °C 2 5 nba 0
60 min. pri
20 °C 100 100 100 nba
30 °C 100 100 95 nba
40 °C 100 100 80 nba
50 °C 100 100 32 nba
60 °C 100 89 0 nba
70 °C 6 0 0 nba
60 °C po
0 min. 100 100 nba nba
30 min. 100 67-80 nba nba
60 min. 92-100 52-68 nba nba
120 min. 72-87 29-47 nba nba
nestanovené
Vplyv koncentrácie 3-kyánpyridínu na aktivity nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp.
GF 270, Amycolatopsis sp. NA40 a Rhodococcus rhodochrous J1 sa stanovil podľa príkladu 9 použitím jednotlivých mikroorganizmov a koncentrácií 3-kyánpyridínu uvedených v tabuľke 10. Aktivity nitrilhydratázy kmeňov Rhodococcus sp. FZ4 a Rhodococcus sp. GF 270 mali najväčšiu toleranciu proti 3-kyánpyridínu.
Tabuľka 10: Porovnanie vplyvu koncentrácie 3-kyánpyridínu na aktivitu nitrilhydratázy
3-Kyánpyridín [% (hmotn./obj.)] Relatívna aktivita [%]
Rhodococcus sp. FZ4 Rhodococcus sp. GF270 Amycolatopsis sp. NA40 Rhodococcus rhodochrous J1
0 100a 100a 100b 100b
2,5 100a 100“ 74b nbc
5,0 100a 100a 56b 86b
7,5 100a 100a 47b nbc
10,0 100a 100a 16b 63b
a inkubácia 60 min.;b inkubácia 15 min.;c nestanovené
Vplyv koncentrácie amidu kyseliny nikotínovej na aktivity nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4, Rho15 dococcus sp. GF 270, Amycolatopsis sp. NA40 a Rhodococcus sp. J1 sa stanovil podľa príkladu 9 použitím jednotlivých mikroorganizmov a koncentrácií amidu kyseliny nikotínovej uvedených v tabuľke 11. Aktivity nitrilhydratázy kmeňov Rhodococcus sp. FZ4 a Rhodococcus sp. GF 270 mali najväčšiu toleranciu proti amidu kyseliny nikotínovej (tabuľka 11).
Tabuľka 11: Porovnanie vplyvu koncentrácie amidu kyseliny nikotínovej na aktivity nitrilhydratázy
Nikotínamid [% (hmotn./obj.)] Relatívna aktivita [%]
Rhodococcus sp. FZ4 Rhodococcus sp. GF270 Amycolatopsis sp. NA40 Rhodococcus rhodochrous J1
0 100 100 100 nba
10 100 100 55 nba
20 100 100 0 nba
30 100 100 0 nba
a nestanovené
Príklad 13
Biotransformácia 3-kyánpyridínu na nikotínamid s Rhodococcus sp. FZ4
K predlohe, ktorá pozostáva z bunkovej suspenzie (13,7 mg suchej bunkovej hmotnosti, 4 ml) a tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; ph 6,0; 16 ml) sa pridal roztok 3-kyánpyridínu v 42 dávkach (42 x 0,52 g = 21,8 g; 0,21 mol). Ďalšia dávka 3-kyánpyridínu sa pridala k reakčnej zmesi, keď sa 3-kyánpyridín v reakčnej zmesi kvantitatívne premenil na nikotínamid. Reakčná zmes v priebehu reakcie stuhla. Celkove sa vytvorilo 25,7 g nikotínamidu (kvantitatívny výťažok).
Príklad 14
Biotransformácia acetonitrilu na acetamid s Rhodococcus sp. FZ4
Acetonitril (5 ml; 95 mmólov) sa počas 80 minút prikvapkal do reakčnej zmesi zloženej z tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 4,5 ml) a bunkovej suspenzie (4,88 mg suchej bunkovej hmotnosti, 0,5 ml) pri 20 °C. Následná reakcia sa uskutočnila pri 20 °C za trepania. Tvorba acetamidu počas reakcie sa sledovala pomocou HPLC (Waters Spherisorp 5 μ ODS2 (4,6 x 150 mm); KH2PO4 (10 mM; pH 2,5/acetonitril = 99/1 (obj./obj.); 10 ml/min.; 210 nm). Počas 120 minút sa vytvorilo 6,14 g acetamidu (kvantitatívny výťažok), ktorý sa akumuloval v reakčnom médiu (obr. 1).
Príklad 15
Vplyv koncentrácie acetonitrilu na aktivitu nitrilhydratázy Rhodococcus sp. FZ4 pri biotransformácii acetonitrilu na acetamid
Reakčná zmes pozostávajúca z acetonitrilu (0,2-19,0 M; 1,0-1,6 ml), vodného roztoku NaCl (0,85 % (hmotn./obj.); 0,6-0,0 ml), tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,3 ml) a bunkovej suspenzie (0,1 ml) sa inkubovala 10 minút pri 20 °C za trepania. Celkový reakčný objem bol 2,0 ml. Reakcia sa skončila pridaním MeOH. Reakčná zmes sa odstredila (12 000 Upm (otáčok/min.), 5 min.) a množstvo vytvoreného acetamidu sa stanovilo pomocou HPLC podľa príkladu 14. Aktivita nitrilhydratázy bola v rozmedzí od 0,1 do 15 M acetonitrilu približne konštantná (obr. 8).
Príklad 16
Vplyv koncentrácie acetonitrilu na aktivitu nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4
Bunky sa inkubovali s acetonitrilom (0,0-15,0 M) v tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0) 1 hodinu pri 20 °C. Bunková suspenzia sa odstredila (12 000 Upm (otáčok/min.), 5 min.) a bunky sa resuspendovali vo vodnom roztoku NaCl (0,85 % (hmotn./obj.)). Reakčná zmes pozostávajúca z tejto bunkovej suspenzie (0,1 ml), 3-kyánpyridínu (0,5 M; 1,0 ml), vodného roztoku NaCl (0,85 % (hmotn./obj.); 0,6 ml) a tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 3 ml) sa počas 5 minútového trepania inkubovala pri 30 °C. Reakcia sa skončila pridaním MeOH. Reakčná zmes sa odstredila (12 000 Upm (otáčok/min.); 5 min.) a množstvo vytvoreného acetamidu sa stanovilo pomocou HPLC podľa príkladu 14.
Aktivita nitrilhydratázy bola po jednohodinovej inkubácii s acetontrilom s koncentráciou v rozmedzí od 0 do 3 M konštantná. Po jednohodinovej inkubácii so 6 M acetonitrilom bolo ešte 60 % pôvodnej aktivity nitrilhydratázy. Po jednohodinovej inkubácii s 9 M acetonitrilom bolo ešte cca 35 % pôvodnej aktivity nitrilhydratázy (obr. 9).
Príklad 17
Výroba pigmentovo negatívnych mutantov Rhodococcus sp. FZ4
Kmeň Rhodococcus sp. FZ4 sa inkuboval v živnom médiu (50 ml) a pri 28 °C za trepania sa inkuboval až sa dosiahla hodnota OD610nni 6,29. Predkultúra (10 ml) sa potom preočkovala do živného média (25 ml) a inkubovala sa pri 28 °C za trepania, až sa dosiahla hodnota OD6i0nm 1,90. Takto získaná kultúra (10 ml) sa odstredila (8 000 Upm (otáčok/min.), 5 min.). Supernatant sa odstránil a bunková zrazenina sa suspendovala do roztoku chloridu sodného pufrovaného fosfátom. Bunková suspenzia sa odstredila (8 000 Upm (otáčok/min), 5 min). Supematant sa odstránil a bunková zrazenia sa suspendovala do roztoku chloridu sodného pufrovaného fosfátom (5 ml). Bunková suspenzia sa preniesla do sklenenej Petriho misky (priemer 90 mm). Bunky sa ožarovali UV lampou (15 W, 254 nm) zo vzdialenosti 25 cm počas 17 minút. Potom sa bunky inkubovali v dvojnásobne koncentrovanom živnom médiu pri 28 °C počas 4 dní za trepania. Takto získaná kultúra sa 100-násobne zriedila a 100 μΐ alikvotnej časti z toho sa rozprestrelo na „plate count agar“ a inkubovalo pri 28 °C. Takmer 150 jednotlivých kolónií vyrástlo na jednotlivej doštičke. Doštičky sa vystavili dennému svetlu, aby sa indukovala tvorba červených pigmentov. Kolónie pigmentovo-negatívnych mutantov sa dali jednoducho rozlíšiť od zafarbených mutantov a od červeného divokého typu.
Príklad 18
Čistenie nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4
Rhodococcus sp. FZ4 sa pestoval v 2-litrovom fermentore podľa príkladu 3. Kultúra sa odstredila a bunková supenzia sa resuspendovala do vodného roztoku NaCl (85 % hmotn./obj.). Bunková suspenzia sa previedla do tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0), ktorý obsahoval kyselinu maslovú (44 mM) a ošetrila sa ultrazvukom. Bunkové zvyšky sa odstránili odstredením. Supematant sa použil na čistenie nitrilhydratázy podľa tabuľky 12. Aktivita nitrilhydratázy sa stanovila podľa príkladu 1. Namiesto bunkovej suspenzie sa však použili jednotlivé extrakty.
Tabuľka 12: Čistenie nitrilhydratázy z Rhodococcus sp. FZ4
Stupeň čistenia Obsah proteínov [mg] Celková aktivita [pmol/min.] Špecifická aktivita [pmol/min.mg]
Bezbunkový extrakt 335 5881 17,6
Zrazenina (NH4)2SO4 198 6087 28,4
DEAE-Sephacel 73,0 3553 48,7
Butyl-Toyopearl 66,2 2035 30,7
Fenyl-Sepharose 26,2 890 34,0
Príklad 19
Stanovenie molekulovej hmotnosti čistenej nitrilhydratázy
Molekulová hmotnosť sa zisťovala pomocou HPLC (TSK gél G 300 SW (0,75 x 60 cm); tlmivý roztok fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,5) a chlorid draselný (0,2 M); 0,7 ml/min.; 280 nm). Molekulová hmotnosť nitrilhydratázy bola 465 kDa (obr. 11). Nitrilhydratáza sa skladá z α-podjednotky s molekulovou hmotnosťou 27,7 kDa a β-podjednotky s molekulovou hmotnosťou 31,2 kDa (obr. 12).
Príklad 20
Teplotná stabilita čistenia nitrilhydratázy
Roztok pozostávajúci z roztoku nitrilhydratázy (0,697 pmol/min.; 0,025 ml) a tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,475 ml) sa inkuboval 60 minút pri rôznych teplotách v rozsahu od 20 do 70 °C. Potom sa roztok ochladil ľadovým kúpeľom na 20 °C a pridal sa kyánpyridín (0,5 M; 0,500 ml). Reakčná zmes sa inkubovala 10 minút pri 20 °C. Reakcia sa skončila pridaním MeOH. Množstvo vytvoreného nikotínamidu sa stanovilo pomocou HPLC podľa príkladu 1. Aktivita nitrilhydratázy sa výrazne znížila po 60 minútovej inkubácii pri teplotách nad 40 °C, po 60 minútovej inkubácii pri 50 °C bola aktivita nitrilhydratázy len 25 % pôvodnej aktivity (obr. 15).
Príklad 21 pH-optimum čistenej nitrilhydratázy
Reakčná zmes pozostávajúca z 3-kyánpyridínu (0,5 M; 0,500 ml), roztoku nitrilhydratázy (0,697 pmol/min.; 0,025 ml) a rôznych tlmivých roztokov v rozsahu pH od 4 do 11 (0,1 M; 0,0475 ml) sa inkubovala 10 minút pri 20 °C. Reakcia sa skončila pridaním MeOH. Množstvo vytvoreného nikotínamidu sa stanovilo pomocou HPLC podľa príkladu 1. pH-Optimum nitrilhydratázy bolo v rozmedzí od 6,0 do 6,5 (obr. 16).
Príklad 22 pH-stabilita čistenej nitrilhydratázy
Roztok pozostávajúci z roztoku nitrilhydratázy (8,36 pmol/min.; 0,47 ml), rôznych tlmivých roztokov v rozsahu pH od 4,0 do 11 (0,3 M; 0,10 ml) a destilovanej vody (0,03 ml) sa inkuboval 30 minút pri 20 °C. Reakčná zmes pozostávajúca z alikvotnej časti inkubovaného roztoku nitrilhydratázy (0,05 ml), 3-kyánpyridínu (0,5 M; 0,5 ml) a jednotlivých tlmivých roztokov (0,1 M; 0,45 ml) sa inkubovala 10 minút pri 20 °C. Reakcia sa skončila pridaním MeOH. Množstvo vytvoreného nikotínamidu sa stanovilo pomocou HPLC podľa príkladu 1. Aktivita nitrilhydratázy zodpovedala po 60 minútovej inkubácii pri pH v rozmedzí od 6 do 8 približne pôvodnej aktivite nitrilhydratázy (obr. 17).
Príklad 23
Substrátová špecificita čistenej nitrilhydratázy
Reakčná zmes pozostávajúca z roztoku nitrilhydratázy (0,695 pmol/min.; 0,025 ml), rôznych substrátov (0,5 ml) a tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,475 ml) sa inkubovala 5 až 10 minút pri 20 °C. Koncentrácia použitých substrátov bola v rozmedzí od 0,015 až 0,250 M. Reakcia sa skončila pridaním MeOH. Množstvo vytvoreného amidu sa stanovilo pomocou HPLC. Výsledky sa súhrnne uvádzajú v tabuľke 13. Nitrilhydratáza má najväčšiu aktivitu medzi testovanými substrátmi k substrátu acetonitrilu. Tabuľka 13: Substrátová špecifikácia čistenej nitrilhydratázy
Substrát Koncentrácia [M] Relatívna aktivita [%]
Acetonitril 0,2 1008
Akrylonitril 0,2 774
Propionitril 0,2 693
Butyronitril 0,2 578
Nitril kyseliny krotónovej 0,2 114
3-Kyánpyridín 0,25 100a
4-Kyánpyridín 0,125 92,8
Benzonitril 0,015 75,6
m-Chlórbenzonitril 0,015 66,5
2-Kyánpyridín 0,125 36,7
p-Chlórbenzonitril 0,015 8,31
Metakrylamid 0,2 1,39
o-Chlórbenzonitril 0,015 0
a Celková aktivita 4 164 pmol/(min.ml).
Príklad 24
Vplyv potenciálnych inhibítorov na čistenú nitrilhydratázu
Roztok pozostávajúci z roztoku nitrilhydratázy (0,695 pmol/min.; 0,025 ml), tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,475 ml), destilovanej vody (0,150 ml) a rôznych potencionálnych inhibítorov (0,100 ml) sa inkuboval 5 minút pri 20 °C. Potom sa pridal 3-kyánpyridín (1,0 M; 0,250 ml). Koncentrácia inhibítorov v reakčnej zmesi bola 1,0 mM. Reakčná zmes sa inkubovala 10 minút pri 20 °C. Reakcia sa skončila pridaním MeOH. Množstvo vytvoreného nikotínamidu sa stanovilo pomocou HPLC podľa príkladu
1. Výsledky sa súhrnne uvádzajú v tabuľke 14. Medzi testovanými potencionálnymi inhbítormi mali najsilnejší inhibičný účinok hydroxylamín a kyanid draselný.
Tabuľka 14: Vplyv potenciálnych inhibítorov na čistenú nitrilhydratázu
Potencionálny inhibítor Relatívna aktivita [%]
Kyselina p-chlórmerkuribenzoováa 187
Tiron 114
Fenylmetánsulfonylfluorid 110
1,10-Fenantrolín 106
Močovina 106
Ditiotreitol 103
Potencionálny inhibítor Relatívna aktivita [%]
EDTAb 100
— 100c
Cysteamín 99,1
8-Hydroxychinolín 97,8
2,2' -bipyridyl 97,8
Jódacetát 96,7
N-Etylmaleinimid 95,3
Azid sodný 93,5
5,5'-Ditiobis(2-kyselina nitrobenzoová)3 93,4
Dietylditiokarbamát 93,3
D-Cykloserín 86,3
Fenylhydrazín 84,6
2-Merkaptoetanol 76,3
Hydroxylamín 1,34
Kyanid draselný 0
a0,1 mM;b Kyselina etyléndiamíntetraoctová;c Celková aktivita: 3 776 pmol/(min.ml).
Príklad 25
Vplyv iónov kovu na aktivitu čistenej nitrilhydratázy
Vplyv iónov kovu na aktivitu čistenej nitrilhydratázy sa uskutočňoval podľa príkladu 24, ale za pridania iónov kovu namiesto potencionálnych inhibítorov. Koncentrácia iónov kovu v reakčnej zmesi bola 1,0 mM. Výsledky sa súhrnne uvádzajú v tabuľke 15. Medzi testovanými iónmi kovov mali inhibičný vplyv len katióny striebra a dvojmocné katióny ortuti.
Tabuľka 15: Vplyv iónov kovu na aktivitu čistenej nitrilhydratázy a Celková aktivita: 3 375 pmol/(min.ml); 0,1 mM.
Ióny kovu Relatívna aktivita [%]
CuSO4 177
MnCl2 123
NiCl2 123
ZnSO4 121
FeSO4 113
CaCl2 113
CoCl2 110
FeCl3 105
— 100“
AgNO3 0
HgCl? 0
Príklad 26
Stanovenie hodnoty KM pre 3-kyánpyridín pri čistenej nitrilhydratáze
K roztoku pozostávajúceho z roztoku nitrilhydratázy (0,697 pmol/min.; 0,025 ml) a tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,475 ml) sa pridal 3-kyánpyridín v rôznych koncentráciách (3,1-800 mM; 0,500 ml). Reakčná zmes sa inkubovala 10 minút pri 20 °C. Reakcia sa skončila pridaním MeOH.
Množstvo vytvoreného nikotínamidu sa stanovilo pomocou HPLC podľa príkladu 1. Hodnota KM pre 3-kyánpyridín bola 80,5 mM (obr. 13).
Príklad 27
Stanovenie hodnoty KM pre acetonitril pri čistenej nitrilhydratáze
K roztoku pozostávajúceho z roztoku nitrilhydratázy (0,697 pmol/min.; 0,025 ml) a tlmivého roztoku fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,475 ml) sa pridal acetonitril v rôznych koncentráciách (2,5-80 mM; 0,500 ml). Reakčná zmes sa inkubovala 10 minút pri 20 °C. Reakcia sa skončila pridaním MeOH. Množstvo vytvoreného acetamidu sa stanovilo pomocou HPLC podľa príkladu 14. Hodnota KM pre acetonitril bola 2,84 mM (obr. 14).

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Mikroorganizmus kmeňa Rhodococcus sp. FZ4 ako je uložený pod číslom DSM 13597.
  2. 2. Mikroorganizmy podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že sú schopné tolerovať koncentráciu acetonitrilu aspoň 3 M.
  3. 3. Mikroorganizmy podľa nároku 2, vyznačujúce sa tým, že sú schopné premieňať 3-kyánpyridín na amid kyseliny nikotínovej.
  4. 4. Mikroorganizmy podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 3, vyznačujúce sa tým, že sú prítomné mykolové kyseliny s dĺžkou reťazca C48.
  5. 5. Enzýmové extrakty získané z mikroorganizmov podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 4.
  6. 6. Nitrilhydratáza získaná z mikroorganizmov podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 4.
  7. 7. Nitrilhydratáza vyznačujúca sa (a) hodnotou KM pre substrát acetonitril 2,84+1,00 mM a pre substrát 3-kyánpyridín 80,5+15,0 mM, (b) pH-optimom pri pH 6,5+1,0, (c) molekulovou hmotnosťou 465+50 k Da, obsahujúcou a- a β- podjednotky, stanovenou pomocou HPLC.
  8. 8. Spôsob výroby amidov všeobecného vzorca (III)
    R*-CONH2 (III) kde R1 znamená Ci_6-alkylový zvyšok, C2.6-alkenylovú skupinu alebo skupinu všeobecného vzorca (IV) kde X znamená atóm dusíka alebo -CH= a R2 a R3 nezávisle od seba znamenajú atóm vodíka, atóm halogénu, Ci.6-alkylovú skupinu alebo C2.6-alkenylovú skupinu, vyznačujúci sa tým, že sa nitril všeobecného vzorca (II)
    R*-CN (II), kde R1 má uvedený význam, premieňa pomocou mikroorganizmu podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 4, enzýmového extraktu podľa nároku 5 alebo pomocou enzýmu podľa aspoň jedného z nárokov 6 alebo 7.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa ako nitril použije 3-kyánpyridín alebo acetonitril.
  10. 10. Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 8 alebo 9, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia uskutočňuje pri teplote od 5 do 50 °C a pri pH od 5 do 10.
  11. 11. Použitie mikroorganizmov podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 4 na odstránenie odpadov acetonitrilu.
    11 výkresov
    SK 288061 Β6
    Obr. 1
    Acetamid
SK624-2003A 2001-01-09 2002-01-08 Microbiological method for producing amides SK288061B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01100493 2001-01-09
US34237301P 2001-12-27 2001-12-27
PCT/EP2002/000103 WO2002055670A1 (de) 2001-01-09 2002-01-08 Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von amiden

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK6242003A3 SK6242003A3 (en) 2003-10-07
SK288061B6 true SK288061B6 (sk) 2013-04-03

Family

ID=26076438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK624-2003A SK288061B6 (sk) 2001-01-09 2002-01-08 Microbiological method for producing amides

Country Status (21)

Country Link
US (2) US20040142447A1 (sk)
EP (1) EP1352050B1 (sk)
JP (1) JP4307837B2 (sk)
KR (2) KR100880143B1 (sk)
CN (1) CN1316010C (sk)
AT (1) ATE417919T1 (sk)
AU (1) AU2002228036A1 (sk)
CA (1) CA2432060C (sk)
CZ (1) CZ20031409A3 (sk)
DE (1) DE50213120D1 (sk)
DK (1) DK1352050T3 (sk)
EA (1) EA008600B1 (sk)
ES (1) ES2319875T3 (sk)
HU (1) HU229283B1 (sk)
IL (2) IL155996A0 (sk)
MX (1) MX268424B (sk)
NO (1) NO329719B1 (sk)
PL (1) PL208060B1 (sk)
PT (1) PT1352050E (sk)
SK (1) SK288061B6 (sk)
WO (1) WO2002055670A1 (sk)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004013824A1 (de) 2004-03-20 2005-10-13 Degussa Ag Nitrilhydratasen aus Rhodococcus opacus
IT1400395B1 (it) 2010-06-08 2013-05-31 Procos Spa Processo one-pot per la sintesi di dalfampridine.
CN102212566A (zh) * 2011-04-11 2011-10-12 江苏大学 一种高纯度异丁酰胺生产方法
ITUA20163572A1 (it) * 2016-05-18 2017-11-18 Columbia S R L Metodo biotecnologico per la produzione di acrilammide e relativo nuovo ceppo batterico
JP7149337B2 (ja) * 2017-11-14 2022-10-06 コロンビア エス．アール．エル． アミド調製のための微生物プロセス
CN114686538B (zh) * 2020-12-30 2023-09-29 杭州唯铂莱生物科技有限公司 一种烟酰胺制备中烟酸含量的控制方法
WO2024195728A1 (ja) * 2023-03-17 2024-09-26 三菱ケミカル株式会社 アミド化合物の製造方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4255344A (en) * 1978-11-08 1981-03-10 Mitsubishi Chemical Industries, Limited 9-α-Hydroxy steroids
CA1133840A (en) * 1980-09-08 1982-10-19 James E. Zajic De-emulsification agents of microbiological origin
DE3248167A1 (de) * 1982-12-27 1984-06-28 Wintershall Ag, 3100 Celle Trehaloselipidtetraester
US5179014A (en) * 1985-01-08 1993-01-12 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Process for the preparation of amides using microorganisms
MX169933B (es) * 1987-09-18 1993-08-02 Hideaki Yamada Procedimiento para la produccion biologica de amidas
GB8910958D0 (en) * 1989-05-12 1989-06-28 Bruce Neil C Assay
AU627648B2 (en) * 1990-02-28 1992-08-27 Teruhiko Beppu Dna fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
US5753472A (en) * 1991-05-02 1998-05-19 Nitto Chemical Industry Co. Ltd. DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
DE4313649C1 (de) * 1993-04-21 1995-01-26 Fzb Biotechnik Gmbh Mikroorganismus und Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines Nitrilhydratase-/Amidase-Enzymkomplexes
RU2053300C1 (ru) * 1993-12-17 1996-01-27 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы
EA006444B1 (ru) 1997-07-22 2005-12-29 Лонца Аг Микроорганизмы amycolatopsis, способные превращать нитрил в амид, фермент с нитрилгидратазной активностью, полученный из указанных микроорганизмов, и способы их использования
JP4185607B2 (ja) * 1998-12-15 2008-11-26 ダイセル化学工業株式会社 新規な微生物及びアミド化合物の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002055670A1 (de) 2002-07-18
ES2319875T3 (es) 2009-05-14
NO329719B1 (no) 2010-12-06
KR20040012707A (ko) 2004-02-11
CA2432060A1 (en) 2002-07-18
EP1352050B1 (de) 2008-12-17
MXPA03006149A (es) 2004-05-04
EA008600B1 (ru) 2007-06-29
HUP0401111A2 (hu) 2004-08-30
ATE417919T1 (de) 2009-01-15
DE50213120D1 (de) 2009-01-29
US20070148743A1 (en) 2007-06-28
CN1316010C (zh) 2007-05-16
AU2002228036A1 (en) 2002-07-24
PT1352050E (pt) 2009-03-24
EA200300749A1 (ru) 2003-12-25
KR100880143B1 (ko) 2009-01-23
NO20033116L (no) 2003-07-08
PL208060B1 (pl) 2011-03-31
HUP0401111A3 (en) 2004-10-28
KR20080099348A (ko) 2008-11-12
NO20033116D0 (no) 2003-07-08
MX268424B (es) 2009-07-17
KR100903756B1 (ko) 2009-06-18
CN1486363A (zh) 2004-03-31
EP1352050A1 (de) 2003-10-15
IL155996A (en) 2010-04-29
US20040142447A1 (en) 2004-07-22
US7838271B2 (en) 2010-11-23
SK6242003A3 (en) 2003-10-07
DK1352050T3 (da) 2009-04-06
JP2004516849A (ja) 2004-06-10
PL365921A1 (en) 2005-01-10
JP4307837B2 (ja) 2009-08-05
IL155996A0 (en) 2003-12-23
CA2432060C (en) 2013-04-23
CZ20031409A3 (cs) 2003-11-12
HU229283B1 (en) 2013-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5334519A (en) Process for biological production of amides with R. rhodochrous J-1
US7838271B2 (en) Microbiological method for producing amides
US7595178B2 (en) Process for the preparation of amides
MXPA00000440A (es) Procedimiento para la preparacion de amidas

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20140108