DE4313649C1

DE4313649C1 - Mikroorganismus und Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines Nitrilhydratase-/Amidase-Enzymkomplexes

Info

Publication number: DE4313649C1
Application number: DE4313649A
Authority: DE
Inventors: Brigitte Huebner; Monika Dr Boehme; Brigitte Dr Lebentrau; Martina Mueller; Barbara Dr Haefner; Eberhard Dr Juhr
Original assignee: FZB BIOTECHNIK GmbH
Current assignee: FZB BIOTECHNIK GmbH
Priority date: 1993-04-21
Filing date: 1993-04-21
Publication date: 1995-01-26
Anticipated expiration: 2013-04-22

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus Rhodococcus und ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines Nitrilhydratase- /Amidase-Enzymkomplexes für den Abbau organischer Cyanidverbin dungen (Nitrile) im Umweltbereich sowie die Umwandlung solcher nitrilgruppentragender organischer Zwischenprodukte in die entsprechenden Amide bzw. Carbonsäurederivate, für die eine chemische Hydrolyse aufgrund der Empfindlichkeit vorhandener funktioneller Gruppen nicht in Frage kommt.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bekanntermaßen werden zur Gewinnung von nitrilhydrolysierenden Enzymkomplexen (EC 3.5.5.1) Mikroorganismen der Gattungen
Pseudomonas sp.
Pseudomonas chloraphilis B23
Nocardia sp.
Fusarium solani
Arthrobacter sp.
Acinetobacter sp.
Brevibacterium sp. R312
Rhodococcus sp. N-774
Rhodococcus rhodochrous J1
verwendet.

Die Gewinnung von Amiden aus Nitrilen mit dem Mikroorganismus Rhodococcus erythropolis AK-3132 (FERM BP-1040) wird in dem EP 204 555 A vorgestellt. Beispiele für hydrolisierte Substrate sind Acetonitril, Acrylnitril, Phthalodinitril, Methacrylnitril, Nicotinonitril.

Die Gewinnung chiraler Carbonsäuren durch enantioselektive Hydrolyse mit einer Amidase, u. a. aus Rhodococcus erythropolis ist Gegenstand der DK-PS 90/1616 (NOVO INDUSTRI).

Die US-PS 4,705,752 beschreibt die enzymatische Hydrolyse von D-a-Aminosäureamiden zu entsprechenden D-a-Aminosäuren mit einer Aminoacylamidase aus Rhodococcus erythropolis NCIB 11538, 11539, 11540 bzw. der Mutante NCIB 12019. Die Kultivierung des Mikroorganismus erfolgt in einem Medium, dem Acetonitril als Induktor zuge setzt wird.

Vaughan u. Mitarb. [Appl. Microbiol Biotechnol (1990) 34 : 42-46] be richten über die Induktion einer Arylacylamidase, die in der kli nischen Diagnostik von Acetaminophen einsetzbar ist. Die US-PS 5,030,571 der gleichen Autoren benennt als Enzymbildner Rhodococ cus erythropolis NCIB 12273 und beschreibt die Kultivierung, wobei dem Medium als Acylamidaseinduktor Acetanilid zugesetzt wird.

Meist werden als Induktoren für die Bildung von Nitrilhydratase/ Amidase bzw. Nitrilase Nitrile und Amide den Medien zugesetzt. So beschreiben Nagasawa u. Mitarb. im EP 444640 A2 (4.9.91), daß Lactame geeignete Induktoren für die Bildung einer Nitrilase aus den Mikroorganismen Rhodococcus rhodochrous J1, Rhodococcus rhodo chrous ATCC 33278, Rhodococcus sp. NCIB 11215 und Rhodococcus sp. NCIB 11216 sind. Substrate für diese Nitrilase sind u. a. Acryl nitril und 3-Cyanopyridin.

Der Einsatz von Lactamen als Induktor für die Bildung von Nitrilase aus Rhodococcus rhodochrous wird ebenfalls im EP 91-102938 erwähnt, die gewonnene Biomasse ist in der Lage, aliphatische bzw. (hetero)aromatische Mono- und Dinitrile zu den entsprechenden Carbonsäuren zu hydrolysieren.

Auch Harnstoff wird als Induktor beschrieben. In der DD-PS 298 659 wird berichtet, daß hohe Nitrilhydratase-Aktivitäten aus Rhodococ cus rhodochrous J1 durch Zusätze von Harnstoff und seine Derivate sowie Cobalt-Ionen erzielt werden. Als Substrate für die Nitril hydratase werden Benzonitril, 3-Cyanopyridin und Acrylnitril ange geben.

Es ist bekannt, daß Ionen von Nebengruppenelementen im Medium die Bildung von Nitrilhydratase bzw. Nitrilase verbessern können. Die Gewinnung von Amiden mittels Nitrilhydratase aus Rhodococcus rhodochrous wird in der DD-PS 274 631 beschrieben. Die Kultivie rung des Stammes erfolgt unter Zusatz von Cobalt-Ionen, wodurch eine Aktivitätssteigerung der Nitrilhydratase erzielgt wird, die sowohl aromatische wie auch aliphatische Nitrile hydrolisiert; als Beispiele werden 3-Cyanopyridin und Acrylnitril genannt.

Laut US-PS 4,661,456 werden hohe Nitrilhydratase-Aktivitäten der Mikroorganismen Pseudomonas chlororaphis B23 bzw. Pseudomonas sp. PS1 dadurch erzielt, daß den Medien Aminosäuren zugesetzt werden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Lösung des technischen Problems der Bereitstellung eines neuen Mikroorganismus, der bevor zugt befähigt ist, einen Nitrilhydratase-/Amidase-Enzymkomplex zu bilden. Darüber hinaus soll ein Verfahren zur mikrobiellen Her stellung des Enzymkomplexes mit dem neuen Stamm entwickelt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Es wurde gefunden, daß der Stamm Rhodococcus erythropolis, hinterlegt in der DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH unter der Nummer 7529, in der Lage ist, einen Nitrilhydratase-/Amidase-Enzymkomplex zu bilden.

Die Fähigkeit des Enzymkomplexes zur Hydrolyse aromatischer, ali phatischer, heteroaromatischer Nitrile zu den entsprechenden Carbonsäureamiden bzw. der weitere Abbau der Carbonsäureamide zu den Carbonsäuren wurde nachgewiesen. Dieser Prozeß ist eine Zwei-Stufen-Hydrolyse, die immer über das Zwischenprodukt Säure amid führt.

Die deutlich differenten Eigenschaften von Nitrilhydratase und Amidase in Bezug auf pH- und Temperatur-Wirkungsoptimum eröffnen vielfältige Möglichkeiten für die Steuerung des Hydrolysegrades sowie eine gezielte Amid- bzw. Carbonsäure-Produktsynthese.

Charakteristik des Stammes Rhodococcus erythropolis DSM 7529
Form:
Kurzstäbchen
Beweglichkeit:	-
Sporenbildung:	-
Gramfärbung:	+
Koloniemorphologie:	Pepton/Hefeextrakt-Agar, 48 h, 30°C
	beige, rauh/matt, Rand glatt

Untersuchung im 48-h-Test bei 25°C
NO₃-Reduktion:
-
Indol-Nachweis:	-
Säurebildung aus Glucose:	-
Arginindihydrolase:	-
Urease:	+
Aesculinhydrolyse:	+
Gelatinehydrolyse:	-
β-Galactosidase:	-
Glucose-Assimilation:	+
Mannose:	-
Mannitol:	+
Arabinose:	-
N-Acetylglucosamin:	+
Maltose:	-
Gluconat:	+
Caprat:	-
Adipat:	+
Malat:	+
Citrat:	+
Phenylacetat:	+
Cytochromoxidase:	-

Säurebildung aus Kohlenhydraten
L-Arabinose:
-
D-(+)-Xylose:	-
Glucose (Dextrose):	+
d-Fructose:	+
Saccharose:	+
Trehalose:	+
d-Galactose:	-
d-Mannose:	+
Maltose:	-
D-Mannit:	+
d-Sorbit:	+
Inosit:	+
Salicin:	-
Raffinose:	+
L-Rhamnose:	-
D-Ribose:	+
Dulcit:	-
Aesculin:	-

C-Quellen Verwertungs-Test/qualitativer Enzym-Test

Chemotaxonomische Untersuchungsergebnisse
1. Diagnostische Aminosäuren des Peptidoglycans:
meso-Diaminopimelinsäure
2. Zucker aus Ganzzell-Hydrolysaten:	Arabinose und Galaktose
3. Mycolsäure:	Mycolsäuren mit einer Kettenlänge von C₃₂-C₄₀
4. Fettsäuremuster:	Unverzweigte gesättigte und ungesättigte Fettsäuren plus Tuberculostearinsäure
5. Menachinoe:	MK-8 (H₂)

Erfindungsgemäß erfolgt die Kultivierung des Stammes Rhodococcus erythropolis DSM 7529 in Medien, die neben üblichen C- und N-Quellen sowie Salzen als Stickstoffquelle Aminosäuren enthalten (bevorzugt Alanin, Histidin, Phenylalanin, Glutamin säure, Asparaginsäure). Dem Medium werden darüber hinaus als Induktoren Nitrile, wie Acetonitril, Crotonitril, Valeronitril oder Lactame, wie Piperidinon, und/oder Ionen von Nebengruppen elementen, z. B. Co-Ionen zugesetzt. Das Verfahren wird im Bereich von pH 6,5 bis 8,5 und unter pO₂-Regulierung bis zu einem Grenzwert von 1 bis 30%, insbesondere 20% der maximalen Sauerstoff-Sättigungskonzentration des Mediums geführt. Die Kulturführung erfolgt aerob über 2 bis 4 Tage bei Temperaturen zwischen 5 bis 45°C, insbesondere 25 bis 32°C, wobei durch pH- und pO₂-Regulierung Biomassen mit hoher Nitrilhydratase- und Amidase- Aktivität gewonnen werden. Die erfindungsgemäße Verknüpfung einzelner, an sich bekannter Kultivierungsmedienbestandteile sowie die Einhaltung bestimmter pH- und pO₂-Bedingungen sichern die in der Zielstellung der Erfin dung angestrebte Herstellung des Enzymkomplexes mit wirtschaft lichem Ertrag.

Die Erfindung soll an einem Beispiel näher erläutert werden, ohne die Erfindung damit einzuschränken.

Beispiel

Mit einer 48-stündigen bei 30°C bebrüteten Schrägagarkultur des Stammes Rhodococcus erythropolis DSM-Nummer 7529 (Pepton/Hefeextrakt-Agar) wird ein Vorkulturmedium (50 ml pro 500-ml-Rundstehkolben) beimpft und 24 Stunden bei 30°C auf einer Schüttelmaschine (200 rpm) geschüttelt. Das Produktionsmedium wird mit einer solchen Inoculummenge beimpft, daß die Anfangsbiomasse 0,4 bis 0,5 mg Biotrocken masse/ml beträgt. Der Produktionsprozeß unter Verwendung eines nachfolgend aufge führten Produktionsmediums erfolgt im 5-l-Fermentor mit 4,4 l Füll volumen bei einer Temperatur von 30°C, 300 bis 400 rpm, 0,1 bis 0,3 vvm und pH-Werten zwischen 7,0 bis 8,0.

Zusammensetzung der Nährmedien

Pepton/Hefeextrakt-Agar
Komponenten
Konzentration [g/l aqua dest.]
Bacto Pepton
10
Hefeextrakt	10
NaCl	5
Agar	20
pH: 7,0-7,2

Vorkulturmedium
Komponenten
Konzentration [g/l Leitungsw.]
KH₂PO₄
0,5
K₂HPO₄	0,5
MgSO₄_*7H₂O	0,5
Hefeextrakt	5
Glucose	5

Produktionsmedium
Komponenten
Konzentration [g/l Leitungsw.]
KH₂PO₄
0,5
K₂HPO₄	0,5
MgSO₄_*7H₂O	0,5
Hefeextrakt	3
Alanin	5
Co-Salz	0,03
Acetonitril	0,5

Zum Nitrilabbau wird entweder Biofeuchtmasse oder Biomasse in lyophilisierter oder immobilisierter Form eingesetzt.

Bei Umsätzen an verschiedenen Substraten werden folgende Aktivitäten [µmol/min × Zelltrockengewicht] erreicht:

Relative Aktivitäten der Nitrilhydratase bzw. Amidase aus Rhodococcus erythropolis DSM-Nummer 7529 [µmol/min × mg Zelltrockengewicht]

Claims

1. Rhodococcus erythropolis DSM 7529

2. Verfahren zur Herstellung eines Nitrilhydratase-/Amidase- Enzymkomplexes, dadurch gekennzeichnet, daß Rhodococcus ery tropolis DSM 7529 in einem Medium kultiviert wird, das neben üblichen C- und N-Quellen sowie Salzen als Stickstoffquelle Aminosäuren enthält und dem Medium darüber hinaus als Induktoren Nitrile wie Acetonitril, Crotonitril, Valeronitril oder Lactame, wie Piperidinon, und/oder Ionen von Nebengruppenelementen, z. B. Co-Ionen zugesetzt werden und daß das Verfahren im Bereich von pH 6,5 bis 8,5 und unter pO₂-Regulierung bis zu einem Grenzwert von 1 bis 30%, insbeson dere 20% der maximalen Sauerstoff-Sättigungskonzentration des Mediums geführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminosäure bevorzugt Alanin, Histidin, Phenylalanin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure eingesetzt wird.