PL184111B1 - Mikrobiologiczny sposób wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych - Google Patents

Abstract

1. Mikrobiologiczny sposób wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych o wzorach ogólnych 1 i 2, w których R1, R2 są takie same lub różne i każdy oznacza atom wodoru lub atom chlorowca, zaś X oznacza atom azotu lub grupę CH lub ich fizjologicznie tolerowanych soli, na drodze biotransformacji heteroaromatycznych nitryli o wzorach ogólnych 3 i 4, w których R1 R2 i X mają wyżej podane znaczenie, przy użyciu mikroorganizmów metabolizujących 2-cyjanopirydynę, rodzaju Alcaligenes, z wytworzeniem odpowiednich kwasów karboksylowych, a następnie ewentualnie przekształcenia wytworzonych kwasów w ich fizjologicznie tolerowane sole, znamienny tym, że przed biotransformacją prowadzi się hodowlę mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes, metabolizujących 2-cyjanopirydynę, w obecności źródła węgla wybranego z grupy obejmującej kwas dwukarboksylowy, kwas trójkarboksylowy i węglowodan, a następnie kwasy wytworzone w wyniku przeprowadzonej biotransformacji - gdy jest to pożądane, przeprowadza się w fizjologicznie tolerowane sole.

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy mikrobiologiczny sposób wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych o wzorach ogólnych 1 i 2, w których R1 r2 są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru lub atom chlorowca, zaś X oznacza atom azotu lub grupę CH lub ich fizjologicznie tolerowanych soli.

Heteroaromatyczne kwasy karboksylowe, takie jak przykładowo kwas 6-hydroksypikolinowy, są ważnymi produktami pośrednimi do wytwarzania środków farmaceutycznych, takich jak przykładowo 2-oksypirymidyna (Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschfft 1912, 45, str. 2456-2467) lub do wytwarzania herbicydów (opis EP-A 0 447 004).

Wiadomo ogólnie, że mikroorganizmy zawierające hydratazy i amidazy nitryli lub nitrylazy przekształcają nitryle w odpowiadające im kwasy. Przykładowo w opisie EP-A 0 187 680 opisano sposób wytwarzania kwasów organicznych takich jak przykładowo kwas nikotynowy, przy użyciu mikroorganizmów rodzajów Corynebacterium, Nocardia, Bacillus, Bacteridium, Micrococcus i Brevibacterium. Konieczne jest prowadzenie tego procesu w obecności energii świetlnej. Opis EP-A 0 444 640 ujawnia mikrobiologiczny proces wytwarzania kwasów organicznych takich jak przykładowo kwas nikotynowy przy użyciu mikroorganizmów rodzaju Rhodococcus. Konieczne jest prowadzenie tego procesu w obecności laktamu.

Ponadto, wiadomo że mikroorganizmy gatunku Rhodococcus rhodochrous J1 powodują konwersję, przykładowo 2-cyjanopirazyny do kwasu pirazynokarboksylowego (Kobayashi et al., J. of Antibiotics, tom 43 nr 10, 1990, strony 1316-1320), jednakże mikroorganizmy te nie są zdolne spowodować konwersji 2-cyjanopirydyny do kwasu pikolinowego (Mathew et al., Appl. Environmental Microbiology, Tom 54, nr 4, 1988, strony 1030-1032).

184 111

Wiadomo również, że mikroorganizmy utylizujące 2-cyjanopirydynę rodzaju Alcaligenes przekształcają 2-cyjanopirydynę w kwas 6-hydroksypikolinowy (opis EP-A 0 504 818). Niekorzystną cechą tego sposobu jest okoliczność, że kwas 6-hydroksypikolinowy powstaje z umiarkowaną wydajnością.

Celem obecnego wynalazku jest opracowanie bardziej ekonomicznego mikrobiologicznego sposobu wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych lub ich fizjologicznie tolerowanych soli, takich jak kwas pirazynokarboksylowy, kwas pikolinowy lub pikolinian chromu przy użyciu mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes, w którym kwasy karboksylowe lub ich fizjologicznie tolerowane sole wytwarzane są z dobrą wydajnością..

Cel ten osiągnięto sposobem według wynalazku, przedstawionym poniżej.

Mikrobiologiczny sposób wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych o wzorach ogólnych 1 i 2, w których R¹, R² są takie same lub różne i każdy oznacza atom wodoru lub atom chlorowca, zaś X oznacza atom azotu lub grupę CH lub ich fizjologicznie tolerowanych soli, na drodze biotransformacji heteroaromatycznych nitryli o wzorach ogólnych 3 i 4, w których R¹, R2 i X mają wyżej podane znaczenie, przy użyciu mikroorganizmów metabolizujących 2-cyjanopirydynę, rodzaju Alcaligenes, z wytworzeniem odpowiednich kwasów karboksylowych, a następnie ewentualnie przekształcenia wytworzonych kwasów w ich fizjologicznie tolerowane sole, według wynalazku polega na tym, że przed biotransformacją prowadzi się hodowlę mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes, metabolizujących 2-cyjanopirydynę, w obecności źródła węgla wybranego z grupy obejmującej kwas dwukarboksylowy, kwas trój karboksylowy i węglowodan, a następnie kwasy wytworzone w wyniku przeprowadzonej biotransformacji - gdy jest to pożądane, przeprowadza się w fizjologicznie tolerowane sole.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się mikroorganizmy gatunku Alcaligenes faecalis oznaczone jako DSM 6335 i ich funkcjonalnie ekwiwalentne odmiany i mutanty.

Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem biotransformację prowadzi się w pH 4 do 10 i w temperaturze 10 do 50°C.

Wynalazek dotyczy także wytwarzania kwasu pikolinowego lub jego fizjologicznie tolerowanych soli, na drodze biotransformacji 2-cyjanopirydyny przy użyciu mikroorganizmów metabolizujących 2-cyjanopirydynę, rodzaju Alcaligenes, a następnie ewentualnie przekształcenia wytworzonego kwasu w jego fizjologicznie tolerowane sole, który według wynalazku polega na tym, że przed biotransformacją prowadzi się hodowlę mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes, metabolizujących 2-cyjanopirydynę, w obecności kwasu dwukarboksylowego, kwasu trój karboksylowego lub węglowodanu, zaś biotransformację prowadzi się w warunkach anaerobowych, a następnie wytworzony kwas, gdy jest to pożądane - przeprowadza się w fizjologicznie tolerowaną sól.

Sposób według wynalazku prowadzi się tak, że heteroaromatyczne nitryle o wzorach ogólnych 3 i 4, których X, R1 i R² mają wyżej podane znaczenie jako substraty poddaje się konwersji do heteroaromatycznych kwasów karboksylowych o wzorach 1 i 2 stosując mikroorganizmy rodzaju Alcaligenes utylizujące 2-cyjanopirydynę, których hodowlę przed biotransformacją prowadzi się w obecności kwasu dwukarboksylowego, kwasu trój karboksylowego lub węglowodanu. Następnie heteroaromatyczne kwasy karboksylowe przekształca się w odpowiednie fizjologicznie tolerowane sole.

Określenie fizjologicznie tolerowane sole tych kwasów karboksylowych oznacza w dalszej części opisu sole chromu, wapnia lub sole amonowe.

Hodowlę mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes wykorzystywanych w tym procesie prowadzi się (kultywuje) w zwykły sposób, a ich skuteczne enzymy są dogodnie indukowane za pomocą 2-cyjanopirydyny. 2-Cyjanopirydynę stosować można do prowadzenia hodowli i indukcji w stężeniu 0,01 do 20% wagowych, korzystnie w stężeniu 0,1 do 1% wagowych.

Określenie kwas dwukarboksylowy oznacza kwas fumarowy, bursztynowy, maleinowy, glutarowy, malonowy oraz ich sole i pochodne takie jak estry.

Określenie kwas trój karboksylowy oznacza kwas cytrynowy, izocytrynowy lub ich sole i pochodne takie jak estry. Sole i pochodne kwasów dwukarboksylowych i trójkarbo4

184 111 ksylowych, jakie można wykorzystywać to fumarany, maleiniany, maloniany, szczawiooctany, cytryniany, sole kwasu akonitowego, izocytryniany, 2-oksoglutarany, bursztyniany lub sukcynylo-CoA. Korzystnie stosuje się fumaran, malonian lub bursztynian.

Określenie węglowodany oznacza monosacharydy takie jak glukoza, dwusacharydy takie jak sacharoza, trehaloza lub maltoza, trójsacharydy takie jak rafinoza, alkohole cukrowe takie jak gliceryna. Jako węglowodan korzystnie stosuje się glicerynę.

Jako pożywkę do hodowli można stosować pożywki zwyczajowo przyjęte wśród fachowców, takie jaki przykładowo pożywka z solami mineralnymi Kulla i wsp. (Arch. Microbiol., 135, 1-7, 1983), niskomolamy bufor fosforanowy lub pożywka wskazana w tabeli I. Korzystnie stosuje się tę opisaną w tabeli I.

Po fazie prowadzenia hodowli i przed faktycznym dodaniem substratu, mikroorganizmy zbiera się na drodze konwencjonalnych procesów separacji lub substrat dodaje się bezpośrednio do mikroorganizmów.

Substraty stosowane w biotransformacji, heteroaromatyczne nitryle o wzorach ogólnych 3 i 4, takie jak przykładowo 2-cyjanopirydyna są związkami dostępnymi w handlu.

Symbol X we wzorach ogólnych 1 i 2 oznacza atom azotu lub grupę CH, korzystnie grupę Ch. Podstawniki R¹ i r2 są takie same lub różne i każdy oznacza atom wodom lub atom chlorowca, takiego jak fluor, chlor, brom lub jod. Możliwymi substratami są zatem 2-cyjanopirydyna, 6-chloro-2-cyjanopirydyna, 5,6-dwuchloro-2-cyjanopirydyna, 2-cyjanopirazyna, 6-chloro-2-cyjanopirazyna, 5-bromo-6-chloro-2-cyjanopirazyna. Dogodnie jako substrat stosuje się 2-cyjanopirydynę, 2-cyjanopirazynę lub 6-chloro-2-cyjanopirydynę.

Substrat można poddawać biotransformacji dodając go jednorazowo, całość w jednym rzucie - lub w sposób ciągły. Dogodnie substrat wprowadza się tak, aby stężenie substratu w pożywce nie przekroczyło 20% wagowo, korzystnie tak aby stężenie nie przekroczyło 10% wagowych.

Biotransformację, którą normalnie prowadzi się stosując stacjonarne komórki, dogodnie prowadzi się stosując mikroorganizmy utylizujące 2-cyjanopirydynę z gatunku Alcaligenes faecalis ujawnione w opisie EP-A 0 504 818 i oznaczone dSm 6335 oraz stosując ich funkcjonalnie ekwiwalentne odmiany i mutanty. Mikroorganizmy te zostały zdeponowane 3 stycznia 1991 w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmhH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, zgodnie z traktatem budapesztańskim.

Określenie funkcjonalnie ekwiwalentne odmiany i mutanty oznacza mikroorganizmy, które mają zasadniczo takie same własności i funkcje jak oryginalne mikroorganizmy. Odmiany i mutanty tego typu można korzystnie uzyskać, przykładowo przez naświetlenie promieniowaniem UV.

Do biotransformacji można stosować takie same pożywki jak do hodowli. Biotransformacja może także nastąpić w obecności lub wobec braku kwasów dwukarboksylowych, kwasów trój karboksylowych lub węglowodanów opisanych wyżej.

Dogodnie, pH jest w zakresie od 4 do 10, korzystnie w zakresie od 5 do 9. Biotransformację można prowadzić w temperaturze od 10 do 50°C, korzystnie w temperaturze od 20 do 40°C.

Po zwykłym czasie konwersji od 6 do 10 godzin, odpowiedni kwas karboksylowy o wzorze ogólnym 1 lub 2 można następnie otrzymać stosując zwykłe metody obróbki, takie jak przykładowo zakwaszenie. Kwasy karboksylowe można także wyodrębnić w postaci soli, takiej jak przykładowo sól amonowa lub sól chromu.

Gdy wytwarzane heteroaromatyczne kwasy karboksylowe są heteroaromatycznymi kwasami hydroksylowanymi w pozycji 6 (wzór ogólny 2), biotransformację dogodnie prowadzi się w warunkach aerobowych. Jednakże, gdy wytwarza się niehydroksylowane heteroaromatyczne kwasy karboksylowe, takie jak przykładowo kwas pikolinowy, biotransformację dogodnie prowadzi się w warunkach anaerobowych.

Poniższe przykłady bliżej objaśniają obecny wynalazek.

Przykład I. Wytwarzanie kwasu 6-hydroksypikolinowego

Dobrano następujące warunki dla wytwarzania kwasu 6-hydroksypikolinowego przy użyciu szczepu Alcaligenes faecalis DSM 6335. Zastosowano fermentator o pojemności 7,5 l,

184 111 o roboczej objętości 5 l. Prowadzono hodowlę Alcaligenes faecalis DSM 6335 w pożywce z solami mineralnymi (tabela I) z dodatkiem fumaranu sodu stanowiącego jedyne źródło węgla i energii oraz 2-cyjanopirydyny jako induktora, w temperaturze 30°C przy 600 obr./min.

w pH 7,0. Napowietrzanie utrzymywano na poziomie 3 l/min. Dodanie fumaranu sodu nastąpiło przy kontroli pO2, gdy pO2 wynosiło >30 %. Stosowano roztwór fumaranu sodu o stężeniu 20%, do którego wprowadzono 0,5% 2-cyjanopirydyny. Hodowlę komórek prowadzono aż gęstość optyczna mierzona przy 650 nm (OD650) wynosiła 16 w ciągu 23 godzin poprzedzających początek biotransformacji. W fazie namnażania zużyto około 160 g fumaranu sodu w postaci 20% roztworu (około 800 ml).

Podczas aerobowej biotransformacji 2-cyjanopirydyny do kwasu 6-hydroksypikolinowego nie dodawano źródeł węgla ani energii. Biotransformację prowadzono z komórkami stacjonarnymi.

Wprowadzanie 2-cyjanopirydyny realizowano stopniowo za pomocą pompy dozującej. Wydajność pompy kontrolowano prowadząc jednoczesny monitoring metodą HPLC. Stężenie pośredniego kwasu pikolinowego, którego szybkość tworzenia jest około 2,5 razy większa niż szybkość konwersji kwasu pikolinowego do kwasu 6-hydroksypikolinowego (10 gl’^lh'¹ w porównaniu z 4 gl^i’¹) ograniczano do wartości <2 g/l, ponieważ w innym wypadku konwersja kwasu pikolinowego do kwasu 6-hydroksypikolinowego była inhibitowana.

Ponieważ 2-cyjanopirydyna jest substancją stałą w temperaturze pokojowej, konieczne było podgrzewanie pojemnika zawierającego 2-cyjanopirydynę do 50°C, co umożliwiło dozowanie 2-cyjanopirydyny w postaci ciekłej. Okazało się możliwe wytworzenie tym sposobem 75 g/l kwasu 6-hydroksypikolinowego w ciągu 31 godzin. Nie stwierdzono obecności związku pośredniego - kwasu pikolinowego na koniec biotransformacji.

Aby wyodrębnić kwas 6-hydroksypikolinowy, komórki oddzielono na drodze filtracji. Roztwór wolny od komórek ogrzano następnie do 60°C i zakwaszono kwasem siarkowym do pH 2 - 2,5. Przy tej wartości pH, kwas 6-hydroksypikolinowy wytrącał się z roztworu.

Następnie, podczas mieszania całość oziębiono powoli do 4°C i przesączono. Pozostałość przemyto zdemineralizowaną wodą i wysuszono (100 mbar /0,1 x 105 Pa/, 55 °C). Około g/l kwasu hydroksypikolinowego pozostało w macierzystym roztworze po tej operacji. Wydajność wynosiła 87 % w przeliczeniu na użytą 2-cyjanopirydynę.

Tabela 1

Skład:	Stężenie (g/l):
1	2
Fumaran dwusodowy	10
Ekstrakt drożdzowy	1
MgCl2 x 6H2O	0,8
Na2SO4	0,25
(NHĄSO,,	1,0
NH4CI	2 3 3
NaCl	0,2
CaCl2 x 2H2O	0,16
MnSO4	1,8 x 10’2
H3BO3	3 x 10’2
NiCl2	2 x 10’3
NaMoO4	3 x 10’3
FeSO4 x 7H2O	0,3

c.d. tabeli

1	2
Na2EDTA x 2H2O	0,75
2-cyjanopirydyna	1
KH2PO4	0,4
Na2HPO4	0,96

Przykład II. Wytwarzanie kwasu pikolinowego

Hodowlę biomasy prowadzono w sposób opisany w przykładzie I. Tworzenie kwasu pikolinowego prowadzono w warunkach ściśle anaerobowych. Do biotransformacji użyto kolbę szklaną o pojemności 500 ml z gumową przegrodą załadowaną 400 ml biomasy o ODć50=20. Inkubację prowadzono w 30°C. Zanim zapoczątkowano biotransformację, mieszaninę doprowadzono do warunków anaerobowych stosując czysty azot. W tym celu do mieszanej hodowli wprowadzano przez kaniulę azot (nadciśnienie 50 mbar /0,05 x 10⁵ Pa/) przez około 30 minut w celu ilościowego usunięcia tlenu. W celu zabezpieczenia przed dostępem tlenu podczas biotransformacji lub w czasie dodawania 2-cyjanopirydyny, wprowadzanie azotu kontynuowano podczas biotransformacji (nadciśnienie około 10 mbar /0,01 x 105 Pa/). 2-Cyjanopirydynę dodano w 12 porcjach, każda 10 g/l, co godzinę. Dodawanie można jednak realizować także w sposób ciągły. Posługiwano się HPLC w celu sprawdzenia czy 2-cyjanopirydyna uległa pełnej konwersji przed dodaniem następnej porcji substratu. Podczas biotransformacji nie stwierdzono powstawania amidu kwasu pikolinowego w wykrywalnych ilościach. Okazało się możliwym wytworzenie w ten sposób około 150 g/l kwasu pikolinowego w ciągu 26 godzin. Nie obserwowano również tworzenia się kwasu 6-hydroksypikolinowego.

W celu wyodrębnienia, kwas pikolinowy wytrącono z wolnego od komórek roztworu za pomocą CaCE/^SO^ W tym celu, wolny od komórek roztwór kwasu pikolinowego rozcieńczono 3-krotnie i ogrzano do 90°C, po czym ciągle mieszając dodano 0,5 równoważnika CaCl2 na każdy równoważnik kwasu pikolinowego. Powstający kompleks wapń/kwas pikolinowy wytrącał się natychmiast. Otrzymany kompleks oziębiono do 4°C z jednoczesnym mieszaniem, odsączono na szklanym spieku (porowatość 3) i przemyto zdemineralizowaną wodą. Placek filtracyjny przeprowadzono w postać wodnej zawiesiny w zdemineralizowanej wodzie i zakwaszono do pH 2,5 stężonym kwasem siarkowym. W trakcie tej operacji kwas pikolinowy wydzielił się z kompleksu z wapniem, a jednocześnie wytrącił się siarczan wapnia. Ponieważ kwas pikolinowy jest bardzo dobrze rozpuszczalny w wodzie możliwe było oddzielenie siarczanu wapnia przez odsączenie. Roztwór kwasu pikolinowego odparowano do sucha i poddano analizie. Wydajność surowego produktu wyniosła 70% przy czystości 86% określonej metodą miareczkowania. Zawartość wody, oznaczona metodą Karl-Fishera wynosiła 0,7%.

Przykład III. Wytwarzanie pikolinianu chromu(III)

Do roztworu pikolinianu amonu (271,4 g; 0,325 mol.; 16,8%) o pH 7,1 i temperaturze 73°C umieszczonego w kolbie o pojemności 500 ml wkroplono w ciągu 3,5 h wodny roztwór sześciowodzianu trójchlorku chromu (23,95 g; 0,09 mola Cr w 63 ml wody). Otrzymany fioletowy roztwór mieszano przez dalszą godzinę, a następnie powoli ochłodzono do 3°C. Po odstaniu czerwonego wytrąconego osadu górna niebieska faza została zdekantowana. Części stałe zawieszono w 100 ml wody na 30 minut i powtórzono dekantację. Po ponownym zawieszeniu części stałych w 50 ml wody (30 minut) osad odsączono z podciśnieniem i wysuszono pod próżnią w 50°C. Otrzymano 33,64 g ciemno czerwonych kryształów (90% wydajności).

Przykład IV. Hodowle Alcaligenes faecalis DSM 6335 z różnymi źródłami węgla

W 200 ml kolbach stożkowych zawierających 100 ml pożywki A+N (jak w tabeli I, bez fumaranu dwusodowego) prowadzono hodowle Alcaligenes faecalis (DSM 6335) z dodatkiem 2 gl’ 2-cyjanopirydyny i 10 gl’ następujących substancji stanowiących źródło węgla:

fumaran dwusodowy gliceryna malonian dwusodowy bursztynian dwusodowy

184 111

Inkubację prowadzono w wytrząsarce w 30°C. Po namnażaniu przez 16 godzin, komórki odwirowano i ponownie zawieszono w świeżej pożywce A+N (bez dodatku źródła węgla) zawierającej 10 gl- 2-cyjanopirydyny. Gęstość optyczna zawiesiny komórek mierzona przy 650 nm (OD650) wynosiła 10. Zawiesiny komórek (ogólna objętość 10-20 ml) inkubowano następnie w 30°C. Tworzenie kwasu 6-hydroksypikolinowego monitorowano spektrofotometrycznie, dokonując pomiaru absorpcji przy 308 nm w wolnym od komórek roztworze. Ustalono następujące przeciętne produktywności tworzenia kwasu 6-hydroksypikolinowego:

Źródło węgla Produktywność (w gl'*h'1) fumaran dwusodowy 2T4 gliceryna 2,0 malonian dwusodowy 4,2 bursztynian dwusodowy 0,14

Przykład V. Wytwarzanie kwasu 6-hydroksypirazynokarboksylowego

Prowadzono hodowlę Alcaligenes faecalis DSM 6335 jak w przykładzie IV z kwasem fumarowym jako źródłem węgla. Przemyte komórki przeprowadzano ponownie w zawiesinę w pożywce A+N zawierającej 10 gl'¹ 2-cyjanopirazyny (OD6so~10) i inkubowano w 30°C. Tworzenie kwasu 6-hydroksypirazynokarboksylowego monitorowano spektrofotometrycznie dokonując pomiaru absorpcji przy 320 nm w wolnym od komórek roztworze. Można było stwierdzić spadek stężenia 2-cyjanopirazyny (substratu) poprzez pomiar absorpcji przy 270 nm. Wzięta do procesu ilość 2-cyjanopirazyny uległa konwersji do kwasu 6-hydroksypirazynokarboksylowego po 7 godzinach.

Przykład VI. Wytwarzanie kwasu 6-chloropikolinowego i kwasu pirazynokarboksylowego

Prowadzono hodowlę Alcaligenes faecalis DSM 6335 jak w przykładzie IV z kwasem fumarowym jako źródłem węgla. Przemyte komórki przeprowadzano ponownie w zawiesinę w pożywce A+N w szklanych naczyniach (OD650=10), zamykanych gumowymi korkami i wprowadzano przez kaniulę azot w celu usunięcia rozpuszczonego tlenu. Następnie dodawano 2-cyjanopirazynę lub 6-chloro-2-cyjanopirydynę jako substraty do zawiesin komórek aż do uzyskania końcowego stężenia 10 gl'^r i hodowle inkubowano w 30°C. Po 3 godzinach substancje wyjściowe zostały ilościowo przekształcone w odpowiednie kwasy [wykrywanie metodą chromatografii cienkowarstwowej: silikażel 60 z indykatorem fluorescencyjnym, faza ruchoma: chloroform 30/etanol 55 /NH4OH (25%) 1O/H2O 5].

R N COOH

WZÓR

HO N COOH

WZÓR 2

R^N TN

WZÓR 3

,.x (ΟΊ

N^ACN

WZÓR 4

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Mikrobiologiczny sposób wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych o wzorach ogólnych 1 i 2, w których R¹, R² są takie same lub różne i każdy oznacza atom wodoru lub atom chlorowca, zaś X oznacza atom azotu lub grupę CH lub ich fizjologicznie tolerowanych soli, na drodze biotransformacji heteroaromatycznych nitryli o wzorach ogólnych 3 i 4, w których R\ r2 i X mają wyżej podane znaczenie, przy użyciu mikroorganizmów metabolizujących 2-cyjanopirydynę, rodzaju Alcaligenes, z wytworzeniem odpowiednich kwasów karboksylowych, a następnie ewentualnie przekształcenia wytworzonych kwasów w ich fizjologicznie tolerowane sole, znamienny tym, że przed biotransformacją prowadzi się hodowlę mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes, metabolizujących 2-cyjanopirydynę, w obecności źródła węgla wybranego z grupy obejmującej kwas dwukarboksylowy, kwas trój karboksylowy i węglowodan, a następnie kwasy wytworzone w wyniku przeprowadzonej biotransformacji - gdy jest to pożądane, przeprowadza się w fizjologicznie tolerowane sole.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizmy gatunku Alcaligenes faecalis oznaczone jako DSM 6335 i ich funkcjonalnie ekwiwalentne odmiany i mutanty.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że biotransformację prowadzi się w pH 4 do 10 i w temperaturze 10 do 50°C.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że 2-cyjanopirydynę poddaje się jako substrat konwersji do kwasu pikolinowego, prowadząc biotransformację w warunkach anaerobowych, a następnie wytworzony kwas, gdy jest to pożądane - przeprowadza się w fizjologicznie tolerowaną sól.