PL184111B1 - Microbiological method of obtaining heteroaromatic carboxylic acids - Google Patents
Microbiological method of obtaining heteroaromatic carboxylic acidsInfo
- Publication number
- PL184111B1 PL184111B1 PL31476596A PL31476596A PL184111B1 PL 184111 B1 PL184111 B1 PL 184111B1 PL 31476596 A PL31476596 A PL 31476596A PL 31476596 A PL31476596 A PL 31476596A PL 184111 B1 PL184111 B1 PL 184111B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- biotransformation
- acid
- cyanopyridine
- microorganisms
- carried out
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pyridine Compounds (AREA)
Abstract
1. Mikrobiologiczny sposób wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych o wzorach ogólnych 1 i 2, w których R1, R2 są takie same lub różne i każdy oznacza atom wodoru lub atom chlorowca, zaś X oznacza atom azotu lub grupę CH lub ich fizjologicznie tolerowanych soli, na drodze biotransformacji heteroaromatycznych nitryli o wzorach ogólnych 3 i 4, w których R1 R2 i X mają wyżej podane znaczenie, przy użyciu mikroorganizmów metabolizujących 2-cyjanopirydynę, rodzaju Alcaligenes, z wytworzeniem odpowiednich kwasów karboksylowych, a następnie ewentualnie przekształcenia wytworzonych kwasów w ich fizjologicznie tolerowane sole, znamienny tym, że przed biotransformacją prowadzi się hodowlę mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes, metabolizujących 2-cyjanopirydynę, w obecności źródła węgla wybranego z grupy obejmującej kwas dwukarboksylowy, kwas trójkarboksylowy i węglowodan, a następnie kwasy wytworzone w wyniku przeprowadzonej biotransformacji - gdy jest to pożądane, przeprowadza się w fizjologicznie tolerowane sole.1. Microbiological production method heteroaromatic carboxylic acids of general formulas 1 and 2 in which R1, R2 are of the same type alone or different, and each is hydrogen or halogen and X is nitrogen or CH group or their physiologically tolerated salts, by heteroaromatic biotransformation nitriles of general formulas 3 and 4, in which R1 R2 and X are as defined above when using microorganisms metabolizing 2-cyanopyridine, the genus Alcaligenes to give the corresponding carboxylic acids and then optionally converting the produced acids into their physiological ones tolerated salts, characterized in that before by biotransformation, the cultivation of microorganisms is carried out genus Alcaligenes, metabolizing 2-cyanopyridine, in the presence of a selected carbon source from the group consisting of a dicarboxylic acid, tricarboxylic acid and carbohydrate then acids produced as a result of the conducted biotransformation - when desired, it is carried out into physiologically tolerable salts.
Description
Przedmiotem wynalazku jest nowy mikrobiologiczny sposób wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych o wzorach ogólnych 1 i 2, w których R1 r2 są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru lub atom chlorowca, zaś X oznacza atom azotu lub grupę CH lub ich fizjologicznie tolerowanych soli.The subject of the invention is a new microbial process for the preparation of heteroaromatic carboxylic acids of general formulas 1 and 2, in which R1 and R2 are the same or different and represent a hydrogen atom or a halogen atom and X represents a nitrogen atom or a CH group or their physiologically tolerable salts.
Heteroaromatyczne kwasy karboksylowe, takie jak przykładowo kwas 6-hydroksypikolinowy, są ważnymi produktami pośrednimi do wytwarzania środków farmaceutycznych, takich jak przykładowo 2-oksypirymidyna (Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschfft 1912, 45, str. 2456-2467) lub do wytwarzania herbicydów (opis EP-A 0 447 004).Heteroaromatic carboxylic acids, such as, for example, 6-hydroxypicolinic acid, are important intermediates for the preparation of pharmaceuticals, such as, for example, 2-oxypyrimidine (Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschfft 1912, 45, pp. 2456-2467) or for the production of herbicides (EP description) -A 0 447 004).
Wiadomo ogólnie, że mikroorganizmy zawierające hydratazy i amidazy nitryli lub nitrylazy przekształcają nitryle w odpowiadające im kwasy. Przykładowo w opisie EP-A 0 187 680 opisano sposób wytwarzania kwasów organicznych takich jak przykładowo kwas nikotynowy, przy użyciu mikroorganizmów rodzajów Corynebacterium, Nocardia, Bacillus, Bacteridium, Micrococcus i Brevibacterium. Konieczne jest prowadzenie tego procesu w obecności energii świetlnej. Opis EP-A 0 444 640 ujawnia mikrobiologiczny proces wytwarzania kwasów organicznych takich jak przykładowo kwas nikotynowy przy użyciu mikroorganizmów rodzaju Rhodococcus. Konieczne jest prowadzenie tego procesu w obecności laktamu.It is generally known that microorganisms containing nitrile hydratases and amidases or nitrilases convert nitriles into the corresponding acids. For example, EP-A 0 187 680 describes a method for producing organic acids, such as, for example, nicotinic acid, using microorganisms of the genera Corynebacterium, Nocardia, Bacillus, Bacteridium, Micrococcus and Brevibacterium. It is necessary to conduct this process in the presence of light energy. EP-A 0 444 640 discloses a microbial process for the production of organic acids, such as, for example, nicotinic acid using microorganisms of the Rhodococcus genus. It is necessary to carry out this process in the presence of lactam.
Ponadto, wiadomo że mikroorganizmy gatunku Rhodococcus rhodochrous J1 powodują konwersję, przykładowo 2-cyjanopirazyny do kwasu pirazynokarboksylowego (Kobayashi et al., J. of Antibiotics, tom 43 nr 10, 1990, strony 1316-1320), jednakże mikroorganizmy te nie są zdolne spowodować konwersji 2-cyjanopirydyny do kwasu pikolinowego (Mathew et al., Appl. Environmental Microbiology, Tom 54, nr 4, 1988, strony 1030-1032).Furthermore, it is known that Rhodococcus rhodochrous J1 microorganisms convert, for example, 2-cyanopyrazine to pyrazinecarboxylic acid (Kobayashi et al., J. of Antibiotics, Vol. 43 No. 10, 1990, pages 1316-1320), however, these microorganisms are unable to cause conversion of 2-cyanopyridine to picolinic acid (Mathew et al., Appl. Environmental Microbiology, Vol. 54, No. 4, 1988, pp. 1030-1032).
184 111184 111
Wiadomo również, że mikroorganizmy utylizujące 2-cyjanopirydynę rodzaju Alcaligenes przekształcają 2-cyjanopirydynę w kwas 6-hydroksypikolinowy (opis EP-A 0 504 818). Niekorzystną cechą tego sposobu jest okoliczność, że kwas 6-hydroksypikolinowy powstaje z umiarkowaną wydajnością.It is also known that 2-cyanopyridine utilizing microorganisms of the genus Alcaligenes convert 2-cyanopyridine into 6-hydroxypicolinic acid (EP-A 0 504 818). This process has the disadvantage that 6-hydroxypicolinic acid is produced in a moderate yield.
Celem obecnego wynalazku jest opracowanie bardziej ekonomicznego mikrobiologicznego sposobu wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych lub ich fizjologicznie tolerowanych soli, takich jak kwas pirazynokarboksylowy, kwas pikolinowy lub pikolinian chromu przy użyciu mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes, w którym kwasy karboksylowe lub ich fizjologicznie tolerowane sole wytwarzane są z dobrą wydajnością..The object of the present invention is to provide a more economical microbial process for the preparation of heteroaromatic carboxylic acids or their physiologically tolerable salts such as pyrazinecarboxylic acid, picolinic acid or chromium picolinate using microorganisms of the genus Alcaligenes in which the carboxylic acids or their physiologically tolerable salts are produced in good yield. .
Cel ten osiągnięto sposobem według wynalazku, przedstawionym poniżej.This object is achieved by the method according to the invention shown below.
Mikrobiologiczny sposób wytwarzania heteroaromatycznych kwasów karboksylowych o wzorach ogólnych 1 i 2, w których R1, R2 są takie same lub różne i każdy oznacza atom wodoru lub atom chlorowca, zaś X oznacza atom azotu lub grupę CH lub ich fizjologicznie tolerowanych soli, na drodze biotransformacji heteroaromatycznych nitryli o wzorach ogólnych 3 i 4, w których R1, R2 i X mają wyżej podane znaczenie, przy użyciu mikroorganizmów metabolizujących 2-cyjanopirydynę, rodzaju Alcaligenes, z wytworzeniem odpowiednich kwasów karboksylowych, a następnie ewentualnie przekształcenia wytworzonych kwasów w ich fizjologicznie tolerowane sole, według wynalazku polega na tym, że przed biotransformacją prowadzi się hodowlę mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes, metabolizujących 2-cyjanopirydynę, w obecności źródła węgla wybranego z grupy obejmującej kwas dwukarboksylowy, kwas trój karboksylowy i węglowodan, a następnie kwasy wytworzone w wyniku przeprowadzonej biotransformacji - gdy jest to pożądane, przeprowadza się w fizjologicznie tolerowane sole.Microbiological process for the preparation of heteroaromatic carboxylic acids of the general formulas 1 and 2, wherein R 1, R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a halogen atom, and X represents a nitrogen atom or a CH group or a physiologically acceptable salt thereof, by biotransformation heteroaromatic nitriles of the general formulas 3 and 4, wherein R 1, R 2 and X are as defined above, using microorganisms metabolizing 2-cyanopyridine, the type Alcaligenes to yield the corresponding carboxylic acid, optionally followed by conversion of generated acids into their physiologically tolerated salts, according to the invention, consists in cultivating microorganisms of the genus Alcaligenes, metabolizing 2-cyanopyridine, in the presence of a carbon source selected from the group consisting of dicarboxylic acid, tricarboxylic acid and carbohydrate, and then the acids produced as a result of the biotransformation carried out - when it is desirable , is converted into physiologically tolerable salts.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się mikroorganizmy gatunku Alcaligenes faecalis oznaczone jako DSM 6335 i ich funkcjonalnie ekwiwalentne odmiany i mutanty.Preferably, the microorganisms of the species Alcaligenes faecalis designated DSM 6335 and their functionally equivalent variants and mutants are used in the process according to the invention.
Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem biotransformację prowadzi się w pH 4 do 10 i w temperaturze 10 do 50°C.Preferably, according to the invention, the biotransformation is carried out at a pH of 4 to 10 and a temperature of 10 to 50 ° C.
Wynalazek dotyczy także wytwarzania kwasu pikolinowego lub jego fizjologicznie tolerowanych soli, na drodze biotransformacji 2-cyjanopirydyny przy użyciu mikroorganizmów metabolizujących 2-cyjanopirydynę, rodzaju Alcaligenes, a następnie ewentualnie przekształcenia wytworzonego kwasu w jego fizjologicznie tolerowane sole, który według wynalazku polega na tym, że przed biotransformacją prowadzi się hodowlę mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes, metabolizujących 2-cyjanopirydynę, w obecności kwasu dwukarboksylowego, kwasu trój karboksylowego lub węglowodanu, zaś biotransformację prowadzi się w warunkach anaerobowych, a następnie wytworzony kwas, gdy jest to pożądane - przeprowadza się w fizjologicznie tolerowaną sól.The invention also relates to the production of picolinic acid or its physiologically tolerable salts by biotransformation of 2-cyanopyridine using 2-cyanopyridine metabolizing microorganisms of the genus Alcaligenes, and then optionally converting the produced acid into its physiologically tolerable salts, which according to the invention consist in the biotransformation cultivates microorganisms of the genus Alcaligenes, metabolizing 2-cyanopyridine, in the presence of a dicarboxylic acid, tricarboxylic acid or carbohydrate, and the biotransformation is carried out under anaerobic conditions, and then the produced acid, if desired, is converted to a physiologically tolerable salt.
Sposób według wynalazku prowadzi się tak, że heteroaromatyczne nitryle o wzorach ogólnych 3 i 4, których X, R1 i R2 mają wyżej podane znaczenie jako substraty poddaje się konwersji do heteroaromatycznych kwasów karboksylowych o wzorach 1 i 2 stosując mikroorganizmy rodzaju Alcaligenes utylizujące 2-cyjanopirydynę, których hodowlę przed biotransformacją prowadzi się w obecności kwasu dwukarboksylowego, kwasu trój karboksylowego lub węglowodanu. Następnie heteroaromatyczne kwasy karboksylowe przekształca się w odpowiednie fizjologicznie tolerowane sole.The process according to the invention is carried out by converting the heteroaromatic nitriles of the general formulas 3 and 4, X, R 1 and R 2 as starting materials above, into heteroaromatic carboxylic acids of the formulas 1 and 2 using 2-cyanopyridine utilizing microorganisms of the Alcaligenes genus. which are cultured prior to biotransformation in the presence of a dicarboxylic acid, tricarboxylic acid or a carbohydrate. The heteroaromatic carboxylic acids are then converted into the corresponding physiologically tolerable salts.
Określenie fizjologicznie tolerowane sole tych kwasów karboksylowych oznacza w dalszej części opisu sole chromu, wapnia lub sole amonowe.The term physiologically tolerable salts of these carboxylic acids is hereinafter meant as chromium, calcium or ammonium salts.
Hodowlę mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes wykorzystywanych w tym procesie prowadzi się (kultywuje) w zwykły sposób, a ich skuteczne enzymy są dogodnie indukowane za pomocą 2-cyjanopirydyny. 2-Cyjanopirydynę stosować można do prowadzenia hodowli i indukcji w stężeniu 0,01 do 20% wagowych, korzystnie w stężeniu 0,1 do 1% wagowych.The cultivation of the microorganisms of the genus Alcaligenes used in this process is carried out (cultivated) in the usual way, and their effective enzymes are conveniently induced with 2-cyanopyridine. 2-Cyanopyridine can be used for cultivation and induction at a concentration of 0.01 to 20% by weight, preferably at a concentration of 0.1 to 1% by weight.
Określenie kwas dwukarboksylowy oznacza kwas fumarowy, bursztynowy, maleinowy, glutarowy, malonowy oraz ich sole i pochodne takie jak estry.The term dicarboxylic acid denotes fumaric acid, succinic acid, maleic acid, glutaric acid, malonic acid and their salts and derivatives such as esters.
Określenie kwas trój karboksylowy oznacza kwas cytrynowy, izocytrynowy lub ich sole i pochodne takie jak estry. Sole i pochodne kwasów dwukarboksylowych i trójkarbo4The term tricarboxylic acid denotes citric acid, isocitric acid or their salts and derivatives such as esters. Salts and derivatives of dicarboxylic acids and tricarboxylic acids
184 111 ksylowych, jakie można wykorzystywać to fumarany, maleiniany, maloniany, szczawiooctany, cytryniany, sole kwasu akonitowego, izocytryniany, 2-oksoglutarany, bursztyniany lub sukcynylo-CoA. Korzystnie stosuje się fumaran, malonian lub bursztynian.The xylates which can be used are fumarates, maleates, malonates, oxaloacetates, citrates, aconitic acid salts, isocitrates, 2-oxoglutarates, succinates or succinyl CoA. Preferably fumarate, malonate or succinate is used.
Określenie węglowodany oznacza monosacharydy takie jak glukoza, dwusacharydy takie jak sacharoza, trehaloza lub maltoza, trójsacharydy takie jak rafinoza, alkohole cukrowe takie jak gliceryna. Jako węglowodan korzystnie stosuje się glicerynę.The term carbohydrates denote monosaccharides such as glucose, disaccharides such as sucrose, trehalose or maltose, trisaccharides such as raffinose, sugar alcohols such as glycerin. Glycerin is preferably used as the carbohydrate.
Jako pożywkę do hodowli można stosować pożywki zwyczajowo przyjęte wśród fachowców, takie jaki przykładowo pożywka z solami mineralnymi Kulla i wsp. (Arch. Microbiol., 135, 1-7, 1983), niskomolamy bufor fosforanowy lub pożywka wskazana w tabeli I. Korzystnie stosuje się tę opisaną w tabeli I.As culture medium, media customary among those skilled in the art may be used, such as, for example, mineral salt medium by Kulla et al. (Arch. Microbiol. 135, 1-7, 1983), low-molar phosphate buffer or the medium indicated in Table I. the one described in Table I.
Po fazie prowadzenia hodowli i przed faktycznym dodaniem substratu, mikroorganizmy zbiera się na drodze konwencjonalnych procesów separacji lub substrat dodaje się bezpośrednio do mikroorganizmów.After the culturing phase and before the actual addition of the substrate, the microorganisms are either harvested by conventional separation processes or the substrate is added directly to the microorganisms.
Substraty stosowane w biotransformacji, heteroaromatyczne nitryle o wzorach ogólnych 3 i 4, takie jak przykładowo 2-cyjanopirydyna są związkami dostępnymi w handlu.The substrates used in the biotransformation, heteroaromatic nitriles of general formulas 3 and 4, such as, for example, 2-cyanopyridine are commercially available compounds.
Symbol X we wzorach ogólnych 1 i 2 oznacza atom azotu lub grupę CH, korzystnie grupę Ch. Podstawniki R1 i r2 są takie same lub różne i każdy oznacza atom wodom lub atom chlorowca, takiego jak fluor, chlor, brom lub jod. Możliwymi substratami są zatem 2-cyjanopirydyna, 6-chloro-2-cyjanopirydyna, 5,6-dwuchloro-2-cyjanopirydyna, 2-cyjanopirazyna, 6-chloro-2-cyjanopirazyna, 5-bromo-6-chloro-2-cyjanopirazyna. Dogodnie jako substrat stosuje się 2-cyjanopirydynę, 2-cyjanopirazynę lub 6-chloro-2-cyjanopirydynę.The symbol X in general formulas 1 and 2 represents a nitrogen atom or a CH group, preferably a Ch group. R 1 and R 2 are the same or different, and each is hydrogen or halogen such as fluoro, chloro, bromo or iodo. Possible substrates are therefore 2-cyanopyridine, 6-chloro-2-cyanopyridine, 5,6-dichloro-2-cyanopyridine, 2-cyanopyrazine, 6-chloro-2-cyanopyrazine, 5-bromo-6-chloro-2-cyanopyrazine. Conveniently, 2-cyanopyridine, 2-cyanopyrazine or 6-chloro-2-cyanopyridine is used as the substrate.
Substrat można poddawać biotransformacji dodając go jednorazowo, całość w jednym rzucie - lub w sposób ciągły. Dogodnie substrat wprowadza się tak, aby stężenie substratu w pożywce nie przekroczyło 20% wagowo, korzystnie tak aby stężenie nie przekroczyło 10% wagowych.The substrate can be biotransformed by adding it all at once, all in one run - or continuously. Suitably the substrate is introduced such that the concentration of the substrate in the medium does not exceed 20% by weight, preferably such that the concentration does not exceed 10% by weight.
Biotransformację, którą normalnie prowadzi się stosując stacjonarne komórki, dogodnie prowadzi się stosując mikroorganizmy utylizujące 2-cyjanopirydynę z gatunku Alcaligenes faecalis ujawnione w opisie EP-A 0 504 818 i oznaczone dSm 6335 oraz stosując ich funkcjonalnie ekwiwalentne odmiany i mutanty. Mikroorganizmy te zostały zdeponowane 3 stycznia 1991 w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmhH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, zgodnie z traktatem budapesztańskim.Biotransformation, which is normally carried out using stationary cells, is conveniently carried out using 2-cyanopyridine utilizing microorganisms of the species Alcaligenes faecalis disclosed in EP-A 0 504 818 and designated dSm 6335 and using functionally equivalent variants and mutants thereof. These microorganisms were deposited on January 3, 1991 at Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmhH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, in accordance with the Budapest Treaty.
Określenie funkcjonalnie ekwiwalentne odmiany i mutanty oznacza mikroorganizmy, które mają zasadniczo takie same własności i funkcje jak oryginalne mikroorganizmy. Odmiany i mutanty tego typu można korzystnie uzyskać, przykładowo przez naświetlenie promieniowaniem UV.The term functionally equivalent varieties and mutants means microorganisms which have substantially the same properties and functions as the original microorganisms. Variants and mutants of this type can advantageously be obtained, for example, by irradiation with UV radiation.
Do biotransformacji można stosować takie same pożywki jak do hodowli. Biotransformacja może także nastąpić w obecności lub wobec braku kwasów dwukarboksylowych, kwasów trój karboksylowych lub węglowodanów opisanych wyżej.The same media as for culture can be used for the biotransformation. Biotransformation can also occur in the presence or absence of dicarboxylic acids, tricarboxylic acids or carbohydrates as described above.
Dogodnie, pH jest w zakresie od 4 do 10, korzystnie w zakresie od 5 do 9. Biotransformację można prowadzić w temperaturze od 10 do 50°C, korzystnie w temperaturze od 20 do 40°C.Suitably the pH is in the range of 4 to 10, preferably in the range of 5 to 9. The biotransformation may be carried out at a temperature of from 10 to 50 ° C, preferably at a temperature of 20 to 40 ° C.
Po zwykłym czasie konwersji od 6 do 10 godzin, odpowiedni kwas karboksylowy o wzorze ogólnym 1 lub 2 można następnie otrzymać stosując zwykłe metody obróbki, takie jak przykładowo zakwaszenie. Kwasy karboksylowe można także wyodrębnić w postaci soli, takiej jak przykładowo sól amonowa lub sól chromu.After the usual conversion time of 6 to 10 hours, the corresponding carboxylic acid of the general formula 1 or 2 can then be obtained using conventional treatment methods such as, for example, acidification. The carboxylic acids can also be isolated as a salt such as, for example, an ammonium salt or a chromium salt.
Gdy wytwarzane heteroaromatyczne kwasy karboksylowe są heteroaromatycznymi kwasami hydroksylowanymi w pozycji 6 (wzór ogólny 2), biotransformację dogodnie prowadzi się w warunkach aerobowych. Jednakże, gdy wytwarza się niehydroksylowane heteroaromatyczne kwasy karboksylowe, takie jak przykładowo kwas pikolinowy, biotransformację dogodnie prowadzi się w warunkach anaerobowych.When the heteroaromatic carboxylic acids produced are heteroaromatic hydroxylated acids in the 6-position (general formula 2), the biotransformation is conveniently carried out under aerobic conditions. However, when producing non-hydroxylated heteroaromatic carboxylic acids such as, for example, picolinic acid, the biotransformation is conveniently carried out under anaerobic conditions.
Poniższe przykłady bliżej objaśniają obecny wynalazek.The following examples illustrate the present invention in more detail.
Przykład I. Wytwarzanie kwasu 6-hydroksypikolinowegoExample I. Preparation of 6-hydroxypicolinic acid
Dobrano następujące warunki dla wytwarzania kwasu 6-hydroksypikolinowego przy użyciu szczepu Alcaligenes faecalis DSM 6335. Zastosowano fermentator o pojemności 7,5 l,The following conditions were selected for the production of 6-hydroxypicolinic acid using the Alcaligenes faecalis DSM 6335 strain. A fermentor with a capacity of 7.5 l was used,
184 111 o roboczej objętości 5 l. Prowadzono hodowlę Alcaligenes faecalis DSM 6335 w pożywce z solami mineralnymi (tabela I) z dodatkiem fumaranu sodu stanowiącego jedyne źródło węgla i energii oraz 2-cyjanopirydyny jako induktora, w temperaturze 30°C przy 600 obr./min.184 111 with a working volume of 5 l. The cultivation of Alcaligenes faecalis DSM 6335 was carried out in a medium with mineral salts (Table I) with the addition of sodium fumarate as the only source of carbon and energy and 2-cyanopyridine as an inducer, at a temperature of 30 ° C and 600 rpm. min.
w pH 7,0. Napowietrzanie utrzymywano na poziomie 3 l/min. Dodanie fumaranu sodu nastąpiło przy kontroli pO2, gdy pO2 wynosiło >30 %. Stosowano roztwór fumaranu sodu o stężeniu 20%, do którego wprowadzono 0,5% 2-cyjanopirydyny. Hodowlę komórek prowadzono aż gęstość optyczna mierzona przy 650 nm (OD650) wynosiła 16 w ciągu 23 godzin poprzedzających początek biotransformacji. W fazie namnażania zużyto około 160 g fumaranu sodu w postaci 20% roztworu (około 800 ml).at pH 7.0. Aeration was kept at 3 l / min. Sodium fumarate was added with pO2 control when pO2 was> 30%. A solution of sodium fumarate with a concentration of 20% was used, into which 0.5% of 2-cyanopyridine was added. Cells were grown until the optical density measured at 650 nm (OD650) was 16 in the 23 hours preceding the start of the biotransformation. About 160 g of sodium fumarate as a 20% solution (about 800 ml) were used in the multiplication phase.
Podczas aerobowej biotransformacji 2-cyjanopirydyny do kwasu 6-hydroksypikolinowego nie dodawano źródeł węgla ani energii. Biotransformację prowadzono z komórkami stacjonarnymi.No carbon or energy sources were added during the aerobic biotransformation of 2-cyanopyridine to 6-hydroxypicolinic acid. Biotransformation was performed with stationary cells.
Wprowadzanie 2-cyjanopirydyny realizowano stopniowo za pomocą pompy dozującej. Wydajność pompy kontrolowano prowadząc jednoczesny monitoring metodą HPLC. Stężenie pośredniego kwasu pikolinowego, którego szybkość tworzenia jest około 2,5 razy większa niż szybkość konwersji kwasu pikolinowego do kwasu 6-hydroksypikolinowego (10 gl’lh'1 w porównaniu z 4 gl^i’1) ograniczano do wartości <2 g/l, ponieważ w innym wypadku konwersja kwasu pikolinowego do kwasu 6-hydroksypikolinowego była inhibitowana.The introduction of 2-cyanopyridine was carried out gradually by means of a dosing pump. Pump performance was controlled by simultaneous monitoring by HPLC. The concentration of the intermediate picolinic acid, the formation rate is about 2.5 times greater than the rate of conversion of picolinic acid into 6-hydroxypicolinic acid (10 gl "l h '1 compared to 4 ° C and gl-1) is restricted to a value of <2 g / 1, because otherwise the conversion of picolinic acid to 6-hydroxypicolinic acid was inhibited.
Ponieważ 2-cyjanopirydyna jest substancją stałą w temperaturze pokojowej, konieczne było podgrzewanie pojemnika zawierającego 2-cyjanopirydynę do 50°C, co umożliwiło dozowanie 2-cyjanopirydyny w postaci ciekłej. Okazało się możliwe wytworzenie tym sposobem 75 g/l kwasu 6-hydroksypikolinowego w ciągu 31 godzin. Nie stwierdzono obecności związku pośredniego - kwasu pikolinowego na koniec biotransformacji.Since 2-cyanopyridine is a solid at room temperature, it was necessary to heat the container containing 2-cyanopyridine to 50 ° C, which allowed for the dosing of liquid 2-cyanopyridine. It has proved possible to produce 75 g / l of 6-hydroxypicolinic acid in 31 hours by this method. The intermediate picolinic acid was not found at the end of the biotransformation.
Aby wyodrębnić kwas 6-hydroksypikolinowy, komórki oddzielono na drodze filtracji. Roztwór wolny od komórek ogrzano następnie do 60°C i zakwaszono kwasem siarkowym do pH 2 - 2,5. Przy tej wartości pH, kwas 6-hydroksypikolinowy wytrącał się z roztworu.To isolate the 6-hydroxypicolinic acid, cells were separated by filtration. The cell-free solution was then heated to 60 ° C and acidified with sulfuric acid to pH 2 - 2.5. At this pH, 6-hydroxypicolinic acid precipitated out of solution.
Następnie, podczas mieszania całość oziębiono powoli do 4°C i przesączono. Pozostałość przemyto zdemineralizowaną wodą i wysuszono (100 mbar /0,1 x 105 Pa/, 55 °C). Około g/l kwasu hydroksypikolinowego pozostało w macierzystym roztworze po tej operacji. Wydajność wynosiła 87 % w przeliczeniu na użytą 2-cyjanopirydynę.It was then slowly cooled to 4 ° C with stirring and filtered. The residue was washed with demineralized water and dried (100 mbar (0.1x10 5 Pa), 55 ° C). Approximately g / L of hydroxypicolinic acid remained in the mother liquor after this operation. The yield was 87% based on the 2-cyanopyridine used.
Tabela 1Table 1
c.d. tabelicontinued table
Przykład II. Wytwarzanie kwasu pikolinowegoExample II. Production of picolinic acid
Hodowlę biomasy prowadzono w sposób opisany w przykładzie I. Tworzenie kwasu pikolinowego prowadzono w warunkach ściśle anaerobowych. Do biotransformacji użyto kolbę szklaną o pojemności 500 ml z gumową przegrodą załadowaną 400 ml biomasy o ODć50=20. Inkubację prowadzono w 30°C. Zanim zapoczątkowano biotransformację, mieszaninę doprowadzono do warunków anaerobowych stosując czysty azot. W tym celu do mieszanej hodowli wprowadzano przez kaniulę azot (nadciśnienie 50 mbar /0,05 x 105 Pa/) przez około 30 minut w celu ilościowego usunięcia tlenu. W celu zabezpieczenia przed dostępem tlenu podczas biotransformacji lub w czasie dodawania 2-cyjanopirydyny, wprowadzanie azotu kontynuowano podczas biotransformacji (nadciśnienie około 10 mbar /0,01 x 105 Pa/). 2-Cyjanopirydynę dodano w 12 porcjach, każda 10 g/l, co godzinę. Dodawanie można jednak realizować także w sposób ciągły. Posługiwano się HPLC w celu sprawdzenia czy 2-cyjanopirydyna uległa pełnej konwersji przed dodaniem następnej porcji substratu. Podczas biotransformacji nie stwierdzono powstawania amidu kwasu pikolinowego w wykrywalnych ilościach. Okazało się możliwym wytworzenie w ten sposób około 150 g/l kwasu pikolinowego w ciągu 26 godzin. Nie obserwowano również tworzenia się kwasu 6-hydroksypikolinowego.The cultivation of the biomass was carried out as described in Example 1. The formation of picolinic acid was carried out under strictly anaerobic conditions. A 500 ml glass flask with a rubber septum loaded with 400 ml of biomass with OD650 = 20 was used for the biotransformation. Incubation was carried out at 30 ° C. Before the biotransformation was initiated, the mixture was made anaerobic using pure nitrogen. For this purpose the mixed culture was fed through a cannula with nitrogen (pressure 50 mbar / 0.05 x 10 5 Pa /) for about 30 minutes to quantitatively remove oxygen. In order to prevent the ingress of oxygen during the biotransformation or during the addition of 2-cyanopyridine, nitrogen injection was continued during the biotransformation (about 10 mbar overpressure (0.01 x 105 Pa). 2-Cyanopyridine was added in 12 portions, each with 10 g / L, every hour. However, the addition can also be carried out continuously. HPLC was used to verify that the 2-cyanopyridine was fully converted before adding the next aliquot of substrate. During the biotransformation, no detectable amounts of picolinic acid amide were formed. It has proved possible to produce about 150 g / l of picolinic acid in this way in 26 hours. The formation of 6-hydroxypicolinic acid was also not observed.
W celu wyodrębnienia, kwas pikolinowy wytrącono z wolnego od komórek roztworu za pomocą CaCE/^SO^ W tym celu, wolny od komórek roztwór kwasu pikolinowego rozcieńczono 3-krotnie i ogrzano do 90°C, po czym ciągle mieszając dodano 0,5 równoważnika CaCl2 na każdy równoważnik kwasu pikolinowego. Powstający kompleks wapń/kwas pikolinowy wytrącał się natychmiast. Otrzymany kompleks oziębiono do 4°C z jednoczesnym mieszaniem, odsączono na szklanym spieku (porowatość 3) i przemyto zdemineralizowaną wodą. Placek filtracyjny przeprowadzono w postać wodnej zawiesiny w zdemineralizowanej wodzie i zakwaszono do pH 2,5 stężonym kwasem siarkowym. W trakcie tej operacji kwas pikolinowy wydzielił się z kompleksu z wapniem, a jednocześnie wytrącił się siarczan wapnia. Ponieważ kwas pikolinowy jest bardzo dobrze rozpuszczalny w wodzie możliwe było oddzielenie siarczanu wapnia przez odsączenie. Roztwór kwasu pikolinowego odparowano do sucha i poddano analizie. Wydajność surowego produktu wyniosła 70% przy czystości 86% określonej metodą miareczkowania. Zawartość wody, oznaczona metodą Karl-Fishera wynosiła 0,7%.For isolation, picolinic acid was precipitated from the cell-free solution with CaCE / 3 SO 4. For this, the cell-free solution of picolinic acid was diluted 3-fold and heated to 90 ° C, then 0.5 eq. CaCl 2 was added with constant stirring. for each equivalent of picolinic acid. The resulting calcium / picolinic acid complex precipitated immediately. The obtained complex was cooled to 4 ° C while stirring, filtered on a glass frit (porosity 3) and washed with demineralized water. The filter cake was suspended in demineralized water and acidified to pH 2.5 with concentrated sulfuric acid. During this operation, picolinic acid separated from the complex with calcium, and at the same time calcium sulfate precipitated. Since picolinic acid is very soluble in water, it was possible to separate the calcium sulphate by filtration. The picolinic acid solution was evaporated to dryness and analyzed. The yield of the crude product was 70% with a purity of 86% as determined by the titration method. The water content was determined by the Karl-Fisher method to be 0.7%.
Przykład III. Wytwarzanie pikolinianu chromu(III)Example III. Production of chromium (III) picolinate
Do roztworu pikolinianu amonu (271,4 g; 0,325 mol.; 16,8%) o pH 7,1 i temperaturze 73°C umieszczonego w kolbie o pojemności 500 ml wkroplono w ciągu 3,5 h wodny roztwór sześciowodzianu trójchlorku chromu (23,95 g; 0,09 mola Cr w 63 ml wody). Otrzymany fioletowy roztwór mieszano przez dalszą godzinę, a następnie powoli ochłodzono do 3°C. Po odstaniu czerwonego wytrąconego osadu górna niebieska faza została zdekantowana. Części stałe zawieszono w 100 ml wody na 30 minut i powtórzono dekantację. Po ponownym zawieszeniu części stałych w 50 ml wody (30 minut) osad odsączono z podciśnieniem i wysuszono pod próżnią w 50°C. Otrzymano 33,64 g ciemno czerwonych kryształów (90% wydajności).To a solution of ammonium picolinate (271.4 g; 0.325 mol; 16.8%) at pH 7.1 and at 73 ° C placed in a 500 ml flask, an aqueous solution of chromium trichloride hexahydrate (23 , 95 g; 0.09 mol of Cr in 63 ml of water). The resulting purple solution was stirred for a further hour and then slowly cooled to 3 ° C. After the red precipitate had settled, the upper blue phase was decanted. The solids were suspended in 100 ml of water for 30 minutes and the decantation was repeated. After the solids were resuspended in 50 ml of water (30 minutes), the precipitate was suction filtered and dried in vacuo at 50 ° C. 33.64 g of dark red crystals (90% yield) were obtained.
Przykład IV. Hodowle Alcaligenes faecalis DSM 6335 z różnymi źródłami węglaExample IV. Alcaligenes faecalis DSM 6335 cultures with different carbon sources
W 200 ml kolbach stożkowych zawierających 100 ml pożywki A+N (jak w tabeli I, bez fumaranu dwusodowego) prowadzono hodowle Alcaligenes faecalis (DSM 6335) z dodatkiem 2 gl’ 2-cyjanopirydyny i 10 gl’ następujących substancji stanowiących źródło węgla:Alcaligenes faecalis (DSM 6335) cultures with the addition of 2 g of 2-cyanopyridine and 10 g of the following carbon source substances were grown in 200 ml conical flasks containing 100 ml of A + N medium (as in Table I, without disodium fumarate):
fumaran dwusodowy gliceryna malonian dwusodowy bursztynian dwusodowydisodium fumarate glycerin malonate disodium disodium succinate
184 111184 111
Inkubację prowadzono w wytrząsarce w 30°C. Po namnażaniu przez 16 godzin, komórki odwirowano i ponownie zawieszono w świeżej pożywce A+N (bez dodatku źródła węgla) zawierającej 10 gl- 2-cyjanopirydyny. Gęstość optyczna zawiesiny komórek mierzona przy 650 nm (OD650) wynosiła 10. Zawiesiny komórek (ogólna objętość 10-20 ml) inkubowano następnie w 30°C. Tworzenie kwasu 6-hydroksypikolinowego monitorowano spektrofotometrycznie, dokonując pomiaru absorpcji przy 308 nm w wolnym od komórek roztworze. Ustalono następujące przeciętne produktywności tworzenia kwasu 6-hydroksypikolinowego:Incubation was carried out on a shaker at 30 ° C. After 16 hours cultivation, cells were centrifuged and resuspended in fresh A + N medium (no carbon source added) containing 10 g1-2-cyanopyridine. The optical density of the cell suspensions measured at 650 nm (OD650) was 10. The cell suspensions (10-20 ml total volume) were then incubated at 30 ° C. The formation of 6-hydroxypicolinic acid was monitored spectrophotometrically by measuring the absorption at 308 nm in the cell-free solution. The average 6-hydroxypicolinic acid formation yields were found:
Źródło węgla Produktywność (w gl'*h'1) fumaran dwusodowy 2T4 gliceryna 2,0 malonian dwusodowy 4,2 bursztynian dwusodowy 0,14Carbon source Productivity (in gl '* h'1) disodium fumarate 2T4 glycerin 2.0 disodium malonate 4.2 disodium succinate 0.14
Przykład V. Wytwarzanie kwasu 6-hydroksypirazynokarboksylowegoExample 5 Preparation of 6-hydroxypyrazinecarboxylic acid
Prowadzono hodowlę Alcaligenes faecalis DSM 6335 jak w przykładzie IV z kwasem fumarowym jako źródłem węgla. Przemyte komórki przeprowadzano ponownie w zawiesinę w pożywce A+N zawierającej 10 gl'1 2-cyjanopirazyny (OD6so~10) i inkubowano w 30°C. Tworzenie kwasu 6-hydroksypirazynokarboksylowego monitorowano spektrofotometrycznie dokonując pomiaru absorpcji przy 320 nm w wolnym od komórek roztworze. Można było stwierdzić spadek stężenia 2-cyjanopirazyny (substratu) poprzez pomiar absorpcji przy 270 nm. Wzięta do procesu ilość 2-cyjanopirazyny uległa konwersji do kwasu 6-hydroksypirazynokarboksylowego po 7 godzinach.Alcaligenes faecalis DSM 6335 was grown as in Example 4 with fumaric acid as the carbon source. The washed cells were performed resuspended in A + N medium containing 10 gl -1 of 2-cyanopyrazine (OD6so ~ 10) and incubated at 30 ° C. The formation of 6-hydroxypyrazinecarboxylic acid was monitored spectrophotometrically by measuring the absorption at 320 nm in cell-free solution. It was possible to detect a decrease in the concentration of 2-cyanopyrazine (substrate) by measuring the absorption at 270 nm. The amount of 2-cyanopyrazine taken into the process was converted to 6-hydroxypyrazinecarboxylic acid after 7 hours.
Przykład VI. Wytwarzanie kwasu 6-chloropikolinowego i kwasu pirazynokarboksylowegoExample VI. Preparation of 6-chloropicolinic acid and pyrazinecarboxylic acid
Prowadzono hodowlę Alcaligenes faecalis DSM 6335 jak w przykładzie IV z kwasem fumarowym jako źródłem węgla. Przemyte komórki przeprowadzano ponownie w zawiesinę w pożywce A+N w szklanych naczyniach (OD650=10), zamykanych gumowymi korkami i wprowadzano przez kaniulę azot w celu usunięcia rozpuszczonego tlenu. Następnie dodawano 2-cyjanopirazynę lub 6-chloro-2-cyjanopirydynę jako substraty do zawiesin komórek aż do uzyskania końcowego stężenia 10 gl'r i hodowle inkubowano w 30°C. Po 3 godzinach substancje wyjściowe zostały ilościowo przekształcone w odpowiednie kwasy [wykrywanie metodą chromatografii cienkowarstwowej: silikażel 60 z indykatorem fluorescencyjnym, faza ruchoma: chloroform 30/etanol 55 /NH4OH (25%) 1O/H2O 5].Alcaligenes faecalis DSM 6335 was grown as in Example 4 with fumaric acid as the carbon source. The washed cells were resuspended in A + N medium in glass vessels (OD650 = 10), sealed with rubber stoppers, and nitrogen was introduced through a cannula to remove dissolved oxygen. Then 2-cyanopyrazine or 6-chloro-2-cyanopyridine as starting materials to the cell suspensions to a final concentration of 10 gl 'r and the cultures were incubated at 30 ° C. After 3 hours, the starting materials were quantitatively converted to the corresponding acids [detection by thin layer chromatography: silica gel 60 with fluorescent indicator, mobile phase: chloroform 30 / ethanol 55 / NH4OH (25%) 1O / H2O5].
R N COOHR N COOH
WZÓRPATTERN
HO N COOHHO N COOH
WZÓR 2PATTERN 2
R^N TNR ^ N TN
WZÓR 3MODEL 3
,.x (ΟΊ, .x (ΟΊ
NACNN A CN
WZÓR 4MODEL 4
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 50 copies
Cena 2,00 zł.Price PLN 2.00.
Claims (4)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH173395 | 1995-06-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL314765A1 PL314765A1 (en) | 1996-12-23 |
| PL184111B1 true PL184111B1 (en) | 2002-09-30 |
Family
ID=4217330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL31476596A PL184111B1 (en) | 1995-06-13 | 1996-06-13 | Microbiological method of obtaining heteroaromatic carboxylic acids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL184111B1 (en) |
-
1996
- 1996-06-13 PL PL31476596A patent/PL184111B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL314765A1 (en) | 1996-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2053300C1 (en) | Strain of bacterium rhodococcus rhodochrous - a producer of nitrile hydratase | |
| CA1168999A (en) | Method for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid | |
| US5360731A (en) | Bacteria capable of stereospecifically hydrolyzing R-(-)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxamide | |
| SK278496B6 (en) | Microbiological producing method of 6-hydroxypicolinic acid | |
| CA2177651C (en) | Microbiological process for the preparation of heteroaromatic carboxylic acids using microorganisms of the genus alcaligenes | |
| CA2091005C (en) | Microbiological process for hydroxylation of nitrogen-heterocyclic-carboxylic acids | |
| PL184111B1 (en) | Microbiological method of obtaining heteroaromatic carboxylic acids | |
| SK278514B6 (en) | Rhodococcus erythropolis microorganism and a method for producing hydroxylated pyrazines and quinoxalines | |
| KR100279227B1 (en) | Microbiological Preparation of Aromatic Hydroxyheterocyclic Carboxylic Acids | |
| US5496715A (en) | Process for preparing indigo | |
| CA2063225C (en) | Microbiological process for the production of 6-hydroxypicolinic acid | |
| CA2062667C (en) | Microbiological process for the production of 6-hydroxynicotinic acid | |
| CA2099857C (en) | Microbiological process for the production of 5-hydroxypyrazinecarboxylic acid | |
| JP3754785B2 (en) | Method for producing 3-hydroxy nitrogen-containing six-membered ring compound |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130613 |