KR100562734B1 - 아미노 알코올 및 그의 유도체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 (VII) (식중, R¹ 은 C₁-C₄-알킬, C₁-C₄-알콕시, 아릴 또는 아릴옥시를 나타낸다) 의 시클로펜텐 유도체를 유일한 질소 공급원, 유일한 탄소 공급원 또는 유일한 탄소 및 산소 공급원으로서 이용할 수 있는 신규 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화학식 (VII) 의 시클로펜텐 유도체를 가수분해하는 신규 효소에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학식 (I) 및 (II) 의 (1R,4S) 또는 (1S,4R)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐 및/또는 화학식 (III) 및 (IV) (식중, R¹ 은 상기의 의미를 갖는다) 의 (1S,4R) 또는 (1R,4S)-아미노-알코올 유도체의 신규 제조방법에 관한 것이다.

Description

아미노 알코올 및 그의 유도체의 제조 방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF AMINO ALCOHOLS AND DERIVATIVES THEREOF}

본 발명은 하기 화학식의 (1R,4S)- 또는 (1S,4R)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐:

및/또는 하기 화학식의 (1S,4R)- 또는 (1R,4S)-아미노 알코올 유도체의:

신규 제조 방법 및 하기 화학식의 시클로펜텐 유도체를:

유일한 질소 공급원, 유일한 탄소 공급원 또는 유일한 탄소와 질소 공급원으로 사용할 수 있는 신규의 미생물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 이들 미생물로부터 수득할 수 있는 효소 추출물 및 N-아세틸아미노-알코올 가수분해효소 활성을 갖는 효소에 관한 것이다.

화학식 I 의 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐은 예를 들어 카르보비르 (상품명 Carbovir: Campbell et al., J. Org. Chem. 1995, 60, 4602-4616) 와 같은 카르보시클릭 뉴클레오시드 제조를 위한 중요 중간체이다.

(1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐의 제조 방법은 문헌 [Campbell et al. (ibid) 및 Park K.H. & Rapoport H. (J. Org. Chem. 1994, 59, 394-399)] 에 의해 기술되었다.

이러한 방법에서 사용된 전구체는 D-글루코노-δ-락톤 또는 D-세린이며, (1R,4S)-N-tert-부톡시-카르보닐-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐을 형성하고, 이를 탈보호화하여 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐을 수득하는 데에는 약 15 개의 합성 단계가 필요하다. 이들 두 방법은 비용이 많이 들고, 정교하고 산업적으로는 수행될 수 없다.

WO 93/17020 은 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐의 제조 방법을 기술하고 있는데, 여기서 (1R,4S)-4-아미노-2-시클로펜텐-1-카르복실산은 수소화 리튬 알루미늄으로 환원되어 목적하는 산물이 된다.

한편, 이 방법의 단점은 시클로펜텐 고리의 이중 결합 또한 환원되고 수소화 리튬 알루미늄은 다루기가 힘들며, 한편 너무 비용이 많이 든다는 것이다.

문헌 [Taylor, S. J. et al. (Tetrahedron: Asymmetry Vol..4, No. 6, 1993, 1117-1128)] 은 전구체로 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온에서 출발하는 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로-펜텐의 제조 방법을 기술하고 있다. 이 경우, 전구체는 슈도모나스 솔라나세아럼 (Pseudomonas solanacearum) 또는 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 종의 미생물에 의하여 (1R,4S)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온으로 전환되고, 이는 디-tert-부틸 디카르보네이트에 의해 (1R,4S)-N-tert-부톡시카르보닐-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온으로 전환되고, 붕수소화 나트륨 및 트리플루오로아세트산에 의해 환원되어 목적하는 산물이 된다. 이 방법은 너무 비용이 많이 든다.

또한, Martinez et al. (J. Org. Chem. 1996, 61, 7963-7966) 은 디에틸 디알킬말로네이트로부터 출발하여 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐을 합성하는 10 단계 합성을 기술하고 있다. 이 방법은 또한 정교하고 산업적으로 수행할 수 없다는 단점을 가진다.

본 발명의 목적은 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐의 간단한 제조 방법을 공급하는 것이었다.

이러한 목적은 청구항 1 에 따른 본 발명의 미생물, 및 그들로부터 나온 효소 추출물, 청구항 4 에 따른 본 발명의 효소 및 청구항 7 에 따른 본 발명의 방법으로 이루어진다.

본 발명의 미생물은 통상적인 미생물학적 기술의 도움으로 토양 샘플, 진흙 또는 폐수로부터 분리될 수 있다.

본 발명에 따라서, 통상적인 방법으로 하기 화학식의 시클로펜텐 유도체 하나 이상을 유일한 탄소 및 질소 공급원, 적합한 탄소 공급원을 지닌 유일한 질소 공급원, 또는 적합한 질소 공급원을 지닌 유일한 탄소 공급원으로서 함유하는 영양 배지에서 미생물을 배양하여 이들을 분리한다:

(여기서, R¹ 은 C₁-C₄-알킬, C₁-C₄-알콕시, 아릴 또는 아릴옥시를 나타낸다).

C₁-C₄-알킬로서 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 부틸을 사용할 수 있다. C₁-C₄-알콕시로서 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시 또는 tert-부톡시를 사용할 수 있다. 아릴로서 예를 들면, 페닐 또는 벤질을 사용할 수 있다. 바람직하게는 벤질을 사용한다. 아릴옥시로서 예를 들면, 벤질옥시 또는 페녹시를 사용할 수 있다. 따라서, 하기의 예는 화학식 VII 의 시클로펜텐 유도체로서 적합하다:

1-아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐, 1-부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐 또는 1-페닐아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐.

유일한 질소 공급원, 유일한 탄소 공급원 또는 유일한 탄소와 질소 공급원으로서 화학식 VII 의 시클로펜텐 유도체의 (1R,4S)-이성질체를 이용한 것을 배양에 의해 수득한 배양액으로부터 선택하는 것이 적당하다.

미생물은 적합한 질소 공급원으로서 예를 들면, 암모늄, 질산, 아미노산 또는 성장 기질로서 우레아를 사용할 수 있다. 미생물은 적합한 탄소 공급원으로서 예를 들면, 당류, 당 알코올, C₂-C₄-카르복실산 또는 성장 기질로서 아미노산을 사용할 수 있다. 글루코오스 또는 펜토오스와 같은 헥소오스가 당류로 사용될 수 있다. 당 알코올로서 예를 들어 글리세롤을 사용할 수 있다. 예를 들어, 아세트산 또는 프로피온산이 C₂-C₄-카르복실산으로서 사용될 수 있다. 아미노산으로서는 예를 들어 루이신, 알라닌, 아스파라긴을 사용할 수 있다.

사용할 수 있는 선택 배지 또는 배양 배지는 당업자 사이에서 통상적인 것으로서, 예를 들면 표 1 에서 기술한 것 또는 완전 배지 (효모 추출물을 함유한 배지) 같은 것이며, 표 1 에서 기술한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

배양 및 선택 과정 중에서, 미생물의 활성 효소는 적절하게 유도된다. 화학식 VII 의 시클로펜텐 유도체는 효소 유도제로 사용될 수 있다.

배양 및 선택은 통상적으로 20 ℃ 내지 40 ℃, 바람직하게는 30 ℃ 내지 38 ℃ 의 온도에서, 그리고 5.5 내지 8.0, 바람직하게는 6.8 내지 7.8 의 pH 에서 일어난다.

바람직한 미생물은 로도코쿠스 (Rhodococcus), 고르도나 (Gordona), 아트로박터 (Arthrobacter), 알칼리겐스 (Alcaligenes), 아그로박테리움 (Agrobacterium)/리조비움 (Rhizobium), 바실루스 (Bacillus), 슈도모나스 (Pseudomonas) 또는 알칼리겐스 (Alcaligenes)/보르데텔라 (Bordetella) 속의 미생물이며, 특히 로도코쿠스 에리스로폴리스 (erythropolis) CB 101 (DSM 10686), 알칼리겐스/보르데텔라 FB 188 (DSM 11172), 아트로박터 sp. HSZ 5 (DSM 10328), 로도코쿠스 sp. FB 387 (DSM 11291), 알칼리겐스 자일로속시단스 (xylosoxydans) ssp. 데니트리피칸스 (denitrificans) HSZ 17 (DSM 10329), 아그로박테리움/리조비움 HSZ 30, 바실루스 심플렉스 (simplex) K2, 슈도모나스 푸티다 (putida) K32, 고르도나 sp. CB 100 (DSM 10687) 종 및 기능적으로 동등한 이들의 변종 및 돌연변이종이 바람직하다. Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroderweg 1b, D-38124 Braunschweig 에서의 부다페스트 조약에 따라, 1996 년 5 월 20 일에 미생물 DSM 10686 및 10687, 1995 년 11 월 6 일에 미생물 DSM 10328 및 DSM 10329, 1996 년 10 월 8 일에 미생물 DSM 11291, 1996 년 9 월 20 일에 미생물 DSM 11172 에 대한 기탁이 이루어졌다.

"기능적으로 동등한 변종 및 돌연변이종" 은 본래의 미생물과 본질적으로 같은 성질과 기능을 지닌 미생물을 의미한다. 이러한 형태의 변종 및 돌연변이종은 우연히, 예를 들면 UV 조사에 의해 생성될 수 있다.

알칼리겐스 (Alcaligenes)/보르데텔라 (Bordetella) FB 188 (DSM 11172) 의 분류학상의 기술

세포 형태 간균

너비 ㎛ 0.5 ~ 0.6

길이 ㎛ 1.0 ~ 2.5

운동성 +

편모성 균체에서 편모 돌출 (peritrichous)

그람 반응 -

3 % KOH 에 의한 용균 +

아미노펩티다제 (Cerny) +

포자 -

옥시다제 +

카탈라제 +

ADH (alcohol dehydrogenase) -

NO₃ 로부터 나온 NO₂ -

탈질소화 -

우레아제 -

젤라틴의 가수분해 -

하기로부터 나온 산 (OF test):

글루코오스 (Glucose) -

프럭토오스 (Fructose) -

아라비노오스 (Arabinose) -

아디페이트 (Adipate) +

카프레이트 (Caprate) +

시트레이트 (Citrate) +

말레이트 (Malate) +

만니톨 (Mannitol) -

로도코쿠스 에리스로폴리스 (Rhodococcus erythropolis) CB 101 (DSM 106 86) 의 분류학상의 기술

1. 콜로니의 형태 및 색깔: 짧은 분지의 균사 형태로, 오래되면 간균 및 구균으로 분해하며, 반짝반짝 빛나고 부분적으로 융합성을 가진 콜로니, 핑크빛이 도는 베이지, RAL 1001;

2. 분석된 펩티도글리칸의 아미노산: 메소-디아미노피멜산 (meso-diaminopimelic acid);

3. 미콜산 (mycolic acids): 로도코쿠스 미콜산; 미콜산 사슬 길이 (C₃₂ - C₄₄) 의 분석 및 DSM 미콜산 데이타 뱅크의 기재 사항과 데이타를 비교한 것에서 로도코쿠스 에리스로폴리스 균주의 형태와 매우 유사함 (유사도 0.588) 이 밝혀졌다.

4. 지방산 형태: 비분지, 포화 및 불포화 지방산 플러스 투베르쿨로스테아르산.

5. 균주의 16S rDNA 의 부분 서열상에서, 로도코쿠스 에리스로폴리스의 특정 부분의 서열과 고도로 일치함 (100 %) 이 발견되었다.

검정 결과는 세 개의 상호 독립적인 방법 (미콜산, 지방산, 16 S rDNA) 에 의해, 균주가 로도코쿠스 에리스로폴리스 종으로 지정되었기 때문에 명확하다.

고르도나 (Gordona) sp. CB 100 (DSM 10687) 의 분류학상의 기술

1. 콜로니의 형태 및 색깔: 짧은 분지의 균사 형태로, 오래되면 간균 및 구균으로 분해하며, 연한 오렌지 색깔의 콜로니 (RAL 2008);

2. 분석된 펩티도글리칸의 아미노산: 메소-디아미노피멜산;

3. 메나퀴논 (Menaquinone) 형태: MK-9 (H₂) 100 %;

4. 미콜산: 고르도나 미콜산; 미콜산 사슬 길이 (C₅₀ - C₆₀) 를 고온 가스 크로마토그래피로 분석한다. 이 형태는 고르도나 속의 대표적인 것에서 발견되는 형태와 일치한다.

5. 지방산 형태: 비분지, 포화 및 불포화 지방산 플러스 투베르쿨로스테아르산.

6. 균주의 16S rDNA 의 부분 서열상에서, 고르도나 루브로페르팅타 (rubropertincta) 의 특정 부분의 서열과 98.8 % 의 비교적 낮은 일치만이 발견되었다.

유효한 결과 (메나퀴논, 미콜산, 지방산, 16S rDNA) 를 기준으로 분리물이 명확하게 고르도나 속으로 판명될 수 있을 지라도, 그 결과를 기준으로 공지의 고르도나 종으로 판명하는 것은 불가능하다. 그러므로 균주 DSM 10687 은 신규이고 이전에는 기술되지 않은 고르도나 속의 종이라고 가정할 수 있다.

알칼리겐스 자일로속시단스 (Alcaligenes xylosoxydans) ssp. 데니트리피칸스 (denitrificans) HSZ 17 (DSM 10329) 의 분류학상의 기술

균주의 성질

세포 형태 간균

너비 ㎛ 0.5 ~ 0.6

길이 ㎛ 1.5 ~ 3.0

운동성 +

편모성 균체에서 편모 돌출 (peritrichous)

그람 반응 -

3 % KOH 에 의한 용균 +

아미노펩티다제 (Cerny) +

포자 -

옥시다제 +

카탈라제 +

혐기성 성장 -

ADH (alcohol dehydrogenase) +

NO₃ 로부터 나온 NO₂ +

탈질소화 +

우레아제 -

젤라틴의 가수분해 -

트윈 80 의 가수분해 -

하기로부터 나온 산 (OF test):

글루코오스 호기성 -

자일로오스 80 -

기질 이용성

글루코오스 -

프럭토오스 -

아라비노오스 -

시트레이트 (Citrate) +

말레이트 (Malate) +

만니톨 (Mannitol) -

아트로박터 (Arthrobacter) sp. HSZ5 (DSM 10328) 의 분류학상의 기술

특성의 기술: 분명한 간균-구균 성장 주기를 가진 그람 양성의 불규칙한 간균; 절대 호기성; 글루코오스로부터 산 또는 가스 생성 없음.

운동성 -

포자 -

카탈라제 +

세포벽 내에 메소-디아미노피멜산: 없음

펩티도글리칸 형태: A3α, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala

16S rDNA 서열 유사성: 아트로박터 파센스 (Arthrobacter pascens), A. 라모서스 (ramosus) 및 A. 옥시단스 (oxydans) 와 가장 큰 변이성을 가진 부분의 서열 상에서 발견된 가장 높은 수치는 98.2 % 이다.

아그로박테리움 (Agrobacterium)/리조비움 (Rhizobium) HSZ30 의 분류학상의 기술

세포 형태 다형성의 간균

너비 [㎛] 0.6 ~ 1.0

길이 [㎛] 1.5 ~ 3.0

그람 반응 -

3 % KOH 에 의한 용균 +

아미노펩티다제 (Cerny) +

포자 -

옥시다제 +

카탈라제 +

운동성 +

혐기성 성장 -

질산염으로부터 나온 아질산염 -

탈질소화 -

우레아제 +

젤라틴의 가수분해 -

하기로부터 나온 산:

L-아라비노오스 (Arabinose) +

갈락토오스 (Galactose) -

멜레지토오스 (Melezitose) -

푸코오스 (Fucose) +

아라비톨 (Arabitol) -

만니톨 (Mannitol) -

에리스리톨 (Erythritol) -

리트머스 유의 알칼리화 +

케토락토오스 (Ketolactose) -

16S rDNA 의 부분 서열은 아그로박테리움 및 리조비움 속의 대표적인 것과 약 96 % 의 비교적 많은 유사성을 나타냈다. 이러한 속에 기술된 종으로 명확하게 판명하는 것은 불가능하다.

바실루스 심플렉스 (Bacillus simplex) K2 의 분류학상의 기술

세포 형태 간균

너비 [㎛] 0.8 ~ 1.0

길이 [㎛] 3.0 ~ 5.0

포자 -

타원형 -

원형 -

유아포세포 (Sporagium) -

카탈라제 +

혐기성 성장 -

VP 반응 n.g.

최대 온도

성장 양성 온도 ℃ 40

성장 음성 온도 ℃ 45

배지 pH 5.7 에서의 성장 -

NaCl 2 % +

5 % -

7 % -

10 % -

리소짐 배지 +

하기로부터 나온 산 (ASS)

D-글루코오스 (Glucose) +

L-아라비노오스 (Arabinose) +

D-자일로오스 (Xylose) -

D-만니톨 (Mannitol) +

D-프럭토오스 (Fructose) +

프럭토오스로부터 나온 가스 -

레시티나아제 (Lecithinase) -

하기의 가수분해

전분 +

젤라틴 +

카제인 -

트윈 80 +

아에스쿨린 (Aesculin) -

하기의 사용

시트레이트 (Citrate) +

프로피오네이트 (Propionate) -

질산염으로부터 나온 아질산염 +

인돌 -

페닐알라닌 디아미나아제 -

아르기닌 디히드롤라아제 -

세포의 지방산을 분석하여 바실루스 속으로의 판명을 확인했다.

16S rDNA 의 부분 서열에서 바실루스 심플렉스와의 100 % 유사성이 밝혀졌다.

슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) K32 의 분류학상의 기술

세포 형태 간균

너비 [㎛] 0.8 ~ 0.9

길이 [㎛] 1.5 ~ 4.0

운동성 +

편모성 극성 ＞1

그람 반응 -

3 % KOH 에 의한 용균 +

아미노펩티다제 +

포자 -

옥시다제 +

카탈라제 +

혐기성 성장 -

색소

형광성 +

피오시아닌 -

ADH +

질산염으로부터 나온 아질산염 -

탈질소화 -

우레아제 -

젤라틴의 가수분해 -

기질 이용성

아디페이트 (Adipate) -

시트레이트 (Citrate) +

말레이트 (Malate) +

D-만델레이트 (Mandelate) +

페닐아세테이트 (Phenylacetate) +

D-타르트레이트 (Tartrate) -

D-글루코오스 (Glucose) +

트레할로오스 (Trehalose) -

만니톨 (Mannitol) -

벤조일포르메이트 (Benzoylformate) -

프로필렌 글리콜 +

부틸아민 +

벤질아민 +

트립타민 -

아세트아미드 +

히푸레이트 +

세포 지방산의 프로필은 전형적인 슈도모나스 푸티다이다.

16S rDNA 의 부분 서열은 슈도모나스 멘도시나 (mendocina) 및 슈도모나스 알칼리겐스와 약 98 % 의 유사성을 나타냈다. 슈도모나스 푸티다와의 유사성은 97.4 % 였다.

로도코쿠스 (Rhodococcus) sp. FB 387 (DSM 11291) 의 분류학상의 기술

1. 형태 및 콜로니의 색깔: 짧은 분지의 균사 형태로, 오래되면 간균 및 구균으로 분해되고, 콜로니 매트, 연한 붉은 오렌지 색 RAL 2008;

2. 분석된 펩티도글리칸의 아미노산: 메소-디아미노피멜산;

3. 미콜산: 로도코쿠스 미콜산;

미콜산 사슬 길이 (C₃₂-C₄₄) 의 분석 및 DSMZ 미콜산 데이타 뱅크의 기재사항과 데이타의 비교에서 로도코쿠스 루버 (ruber) 균주의 형태와 단지 아주 적은 유사성 (유사성 0.019) 만을 나타냈다. 이러한 대응 인자는 너무 낮아서 종 감별용으로 사용될 수 없다.

4. 지방산 형태: 비분지, 포화 및 불포화 지방산 플러스 투베르쿨로스테아르산.

이러한 지방산 형태는 로도코쿠스 속의 대표적인 것 및 마이코박테리움 (Mycobacterium), 노카르디아 (Nocardia) 및 고르도나 (Gordona) 와 같은 그의 가까운 계열 모두에게 특징적이다. 지방산 형태에 있어 질적 및 양적인 차이점을 포함함으로써 종 레벨로 분류를 행하려는 시도를 했다. 로도코쿠스 sp. FB 387 의 지방산 형태를 데이타 뱅크의 기재 사항과 비교하기 위해 많은 방법들을 사용하였다. 적은 정도의 유사성 (0.063) 때문에 이러한 방법으로 로도코쿠스 sp. FB 387 을 어떤 기술된 로도코쿠스 종으로 판명하는 것은 불가능했다.

5. 균주의 16s rDNA 의 부분 서열 상에서 96-818 은 97.9 % 의 일치로 로도코쿠스 오파쿠스 (opacus) 로 판명되었다. 이러한 서열의 일치는 이러한 분류군에서 명확한 종 판별을 위해 필요한 99.5 % 보다 훨씬 낮다.

유효한 결과를 기준으로, 균주 로도코쿠스 sp. FB 387 은 신규이며 이전에 기술된 로도코쿠스 종이 아님을 가정할 수 있다.

본 발명의 효소, 상기 화학식 VII 의 시클로펜텐 유도체를 가수분해할 수 있는 N-아세틸아미노-알코올 하이드롤라아제는 예를 들어 당업자에게 통상적인 방법으로 본 발명의 미생물 세포를 파괴함으로서 수득할 수 있다. 이를 위해 예를 들어, 초음파 또는 프렌치 압축법을 사용할 수 있다. 이러한 효소는 예를 들면, 로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101 (DSM 10686) 미생물로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 미생물, 특히 로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101 (DSM 10686) 로부터 수득할 수 있는 효소는 하기의 성질을 갖는 것이 바람직하다:

a) 최적 pH 는 pH 7.0 ± 1.0;

b) pH 7.0 에서의 최적 온도는 25 ℃ 내지 30 ℃; 그리고

c) 기질 1-아세틸아미노-히드록시메틸-2-시클로펜텐의 K_M 은 22.5 mM ± 7.5 mM (30 ℃, 100 mM 인산 완충용액, pH 7.0).

로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101 (DSM 10686) 으로부터 수득할 수 있는 효소의 서열 분석에서 또한 하기를 알아냈다:

d) N-말단 아미노산의 서열은 Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala- Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn;

그리고 분자량 분석에서 하기를 알아냈다:

e) SDS-PAGE 로 분석한 분자량 50 kD.

본 발명의 미생물, 예를 들면 로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101 (DSM 10686) 로부터 수득할 수 있는 것과 같은 효소는 예를 들면, 특히 1-아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐, 1-부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐, 1-프로피오닐아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐 및 1-이소부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐을 가수분해한다.

하기 화학식의 (1R,4S)- 또는 (1S,4R)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐:

및/또는 하기 화학식의 (1S,4R)- 또는 (1R,4S)-아미노 알코올 유도체:

(여기서, R¹ 은 정해진 의미를 갖는다)

를 제조하는 본 발명의 방법은 예를 들면, 첫번째 단계에서 하기 화학식의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온:

을 아실화함으로써 수행되어 하기 화학식의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온 유도체를 수득할 수 있다:

(여기서 R¹ 은 정해진 의미를 갖는다).

전구체 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온은 EP-B 0 508 352 에 설명된 바와 같이 제조할 수 있다.

아실화는 하기 화학식의 카르보닐 할라이드 또는 카르복실산 무수물로 수행될 수 있다:

(여기서, X 는 할로겐 원자를 나타내고 R¹ 은 정해진 의미를 갖는다)

(여기서, R¹ 은 정해진 의미를 갖는다).

F, Cl, Br 또는 I 는 할로겐 원자 X 로 사용될 수 있다. Cl 또는 F 를 사용하는 것이 바람직하다.

카르보닐 할라이드의 예는 하기와 같다: 아세틸 클로라이드, 클로로아세틸 클로라이드, 부티릴 클로라이드, 이소부티릴 클로라이드, 페닐아세틸 클로라이드, 벤질 클로로포르메이트 (Cbz-Cl), 프로피오닐 클로라이드, 벤조일 클로라이드, 알릴 클로로포르메이트 또는 tert-부틸 플루오로포르메이트. 카르복실산 무수물의 예는 하기와 같다: 디-tert-부틸 디카르보네이트, 부티르산 무수물, 아세트산 무수물 또는 프로피온산 무수물.

아실화는 용매없이 또는 비양성자성 용매에서 수행될 수 있다.

아실화는 비양성자성 용매 내에서 적절하게 수행된다. 적당한 비양성자성 용매의 예는 피리딘, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 테트라히드로푸란, 톨루엔, 메틸렌 클로라이드, N-메틸피롤리돈 또는 그의 혼합물이다. 바람직한 용매는 피리딘 또는 아세토니트릴, 특히 피리딘 및 아세토니트릴의 혼합물이다.

아실화는 -80 ℃ 내지 50 ℃, 바람직하게는 0 ℃ 내지 25 ℃ 의 온도에서 적절하게 수행된다.

방법의 두번째 단계에서, 화학식 VI 의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온 유도체를 환원하여 하기 화학식의 시클로펜텐 유도체를 수득할 수 있다:

(여기서, R¹ 은 정해진 의미를 갖는다).

환원은 알칼리 금속 보로히드리드 (borohydride) 또는 알칼리 토금속 보로히드리드, 알칼리 금속 알루미늄 히드리드 또는 알칼리 토금속 알루미늄 히드리드 또는 비트리드 (소듐 비스(2-메톡시에톡시)알루미늄 히드리드) 로 적절하게 수행된다. 나트륨 또는 칼륨 알루미늄 히드리드는 알칼리 금속 알루미늄 히드리드로서 사용될 수 있다. 나트륨 또는 칼륨 보로히드리드는 알칼리 금속 보로히드리도로서 사용될 수 있다. 칼슘 보로히드리드는 알칼리 토금속 보로히드리드로서 사용될 수 있다.

환원은 양성자성 용매 내에서 적절하게 수행된다. 사용할 수 있는 양성자성 용매는 저급 지방족 알코올, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올, 또는 물, 또는 그의 혼합물이다.

환원은 -40 ℃ 내지 40 ℃ , 바람직하게는 0 ℃ 내지 20 ℃ 의 온도에서 적절하게 수행된다.

화학식 VII 의 시클로펜텐 유도체를 하기 화학식의 (1R,4S)- 또는 (1S,4R)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐:

으로 변환하는 것은 미생물 또는 그로부터 나오는 효소 추출물에 의해, 페니실린 G 아실라아제에 의해 또는 N-아세틸아미노-알코올 히드롤라제 활성을 갖는 효소에 의해 본 발명에 따라 수행된다. 이러한 생체변환은 적절하게 분리되는 화학식 I 또는 II 의 (1R,4S)- 또는 (1S,4R)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐 뿐만 아니라 하기 화학식의 (1S,4R)- 또는 (1R,4S)-아미노 알코올 유도체를 얻어낸다:

(여기서, R¹ 은 일정한 의미를 갖는다). 후자도 마찬가지로 적절하게 분리될 수 있다.

화학식 VII 의 시클로펜텐 유도체를 유일한 질소 공급원, 유일한 탄소 공급원 또는 유일한 탄소 및 질소 공급원으로서 사용하는 모든 미생물이 적합하다. 생체변환은 시클로펜텐 유도체의 (1R,4S) 이성질체를 유일한 탄소 공급원, 유일한 탄소 및 질소 공급원 또는 유일한 질소 공급원으로 사용하는 미생물로 적절하게 수행된다.

생체변환은 알칼리겐스/보르데텔라, 로도코쿠스, 아트로박터, 알칼리겐스, 아그로박테리움/리조비움, 바실루스, 슈도모나스 또는 고르도나 속의 미생물, 특히 알칼리겐스/보르데텔라 FB 188 (DSM 11172), 로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101 (DSM 10686), 아트로박터 sp. HSZ 5 (DSM 10328), 로도코쿠스 sp FP 387 (DSM 11291), 알칼리겐스 자일로속시단스 ssp. 데니트리피칸스 HSZ 17 (DSM 10329), 아그로박테리움/리조비움 HSZ 30, 바실루스 심플렉스 K2, 슈도모나스 푸티다 K32, 또는 고르도나 sp. (DSM 19687), 및 그의 기능적으로 동등한 변종 및 돌연변이종을 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. 이들 미생물은 이미 기술했듯이 부다페스트 조약에 따라 기탁했다.

본 방법에 특히 적합한 미생물 종은 알칼리겐스/보르데텔라 FB 188 (DSM 11172), 로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101 (DSM 10686) 및 고르도나 sp. CB 100 (DSM 10687) 이다.

생체변환은 정지 세포 (탄소 및 에너지 공급원이 더이상 필요치 않은 성장하지 않는 세포) 또는 성장하는 세포를 가지고, 이들 미생물의 통상적인 초기 배양 후에 시행될 수 있다. 생체 변환은 정지 세포로 수행하는 것이 바람직하다.

본 방법에 적합한 본 발명에 따른 효소, N-아세틸아미노-알코올 히드롤라제는 상기에서 기술한 방법에 의해 수득할 수 있으며 이미 상기에서 기술한 특성을 가진다.

적합한 페니실린 G 아실라아제는 예를 들면, 박테리아 또는 악티노마이세티스 (actinomycetes) 와 같은 많은 미생물로부터 수득하며, 특히 하기의 미생물에서 수득한다: 대장균 (Escherichia coli) ATCC 9637, 바실루스 메가테리움 (megaterium), 스트렙토마이세스 라벤둘라 (Streptomyces lavendulae) ATCC 13664, 노카르디아 sp. ATCC 13635, 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri) ATCC 9918, 아트로박터 비스코수스 (viscosus) ATCC 15294, 로도코쿠스 파시안스 (fascians) ATCC 12975, 스트렙토마이세스 파에오크로모겐스 (phaeochromogenes) ATCC 21289, 아크로모박터 (Achromobacter) ACTT 23584 및 마이크로코쿠스 로세우스 (Micrococcus roseus) ATCC 416. 특히 판매될 수 있는 페니실린 G 아실라아제, 예를 들면 대장균 (E.coli) (Boehringer Mannheim) 또는 바실루스 메가테리움으로부터 얻어진 페니실린 G 아실라아제 EC 3.5.1.11 을 사용한다.

바람직한 구현예에서 고정된 페니실린 G 아실라아제를 사용한다.

당업자에게 통상적인 배지, 예를 들면 낮은 몰농도의 인산, 시트르산 또는 헤페스 (Hepes) 완충액, 물, 영양 효모 브로쓰 (Nutrient Yeast Broth: NYB) 와 같은 완전 배지 또는 표에서 기술한 배지 내에서 생체변환이 수행될 수 있다. 표 1 에 나타난 배지 또는 낮은 몰농도의 인산 완충액 내에서 생체변환을 수행하는 것이 바람직하다.

생체변환은 시클로펜텐 유도체 (화학식 VII) 를 한번 또는 연속적으로 첨가하여 그 농도가 10 중량 %, 바람직하게는 2 중량 % 를 초과하지 않도록 하여 적절하게 수행된다.

생체변환 중 pH 는 5 내지 9, 바람직하게는 6 내지 8 범위가 될 수 있다. 생체변환은 20 ℃ 내지 40 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 30 ℃ 의 온도에서 적절하게 수행된다.

생체변환 중 (1S,4R)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐이 생성된다면, 이는 예를 들어 염산으로 산 가수분해함으로써 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐으로 전환될 수 있다.

실시예:

실시예 1

(±)-2-아세틸-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온의 제조

100 g 의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 아세토니트릴 (800 ml) 및 피리딘 (161.26 ml) 에 용해한다. 12 ℃ 에서, 104.5 g 의 염화 아세틸을 2 시간에 걸쳐 적가한다. 그리고 나서, 혼합물을 실온에서 4.5 시간동안 교반한다. 800 ml 의 물을 혼합물에 가하고, 아세토니트릴을 진공에서 증발 제거한다. 수상을 400 ml 의 에틸 아세테이트로 3 번 추출한다. 혼합된 유상을 1N HCl (400 ml), 물 (400 ml), 포화 NaCl (400 ml) 로 수세하고, 황산 마그네슘으로 건조하고 완전히 증발시킨다. 잔류물을 염화 메틸렌에 흡수시키고 실리카 겔을 통해 여과한다. 여과물을 농축하고 생성물을 증류하여 정제한다. 107.76 g 의 생성물을 맑은 액체로서 수득한다. 수득율은 71 % 이다. 비점 (0.07 torr): 51 ℃

¹H-NMR (CDCl₃): δ [ppm] 2.25 (AB syst., 2H);

400 MHz 2.8 (s, 3H);

3.42 (m, 1H);

5.30 (m, 1H);

6.89 (m, 1H);

6.92 (m, 1H);

실시예 2

(±)-2-부티릴-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온의 제조

100.3 g 의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 아세토니트릴 (720 ml) 및 피리딘 (142 ml) 에 용해한다. 12 ℃ 에서, 141.8 g 의 염화 부티릴을 1 시간에 걸쳐 적가한다. 그리고 나서, 실온에서 3 시간동안 교반한다. 720 ml 의 물을 혼합물에 가한다. 아세토니트릴을 진공에서 증발 제거하고, 수상을 에틸 아세테이트 (300 ml) 로 3 번 추출한다. 혼합된 유상을 1N HCl (350 ml), 포화 NaCl (400 ml) 및 물 (500 ml) 로 수세하고, 황산 마그네슘으로 건조하고 완전히 증발시킨다. 생성물을 증류하여 정제한다. 107.76 g 의 생성물을 맑은 액체로서 수득한다. 수득율은 85 % 이다.

비점 (0.05 torr): 70 ℃

¹H-NMR (CDCl₃): δ [ppm] 0.98 (t, J=8.5 Hz, 3H);

400 MHz 1.58-1.65 (2H);

2.23 (AB syst., 2H);

2.82-2.90 (2H);

3.42 (m, 1H);

5.30 (m, 1H);

6.62 (m, 1H);

6.90 (m, 1H).

실시예 3

(±)-2-페닐아세틸-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온의 제조

33.4 g 의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 아세토니트릴 (240 ml) 및 피리딘 (48.3 ml) 에 용해한다. 12 ℃ 에서, 68.6 g 의 염화 페닐아세틸을 30 분에 걸쳐 적가한다. 그리고 나서, 혼합물을 실온에서 3.5 시간동안 교반한다. 240 ml 의 물을 혼합물에 가한다. 아세토니트릴을 진공에서 증발 제거하고, 수상을 에틸 아세테이트 (150 ml) 로 3 번 추출한다. 혼합된 유상을 1N HCl (150 ml), 포화 NaCl (150 ml) 및 물 (150 ml) 로 수세하고, 황산 마그네슘으로 건조하고 완전히 증발시킨다. 조생성물을 실리카 겔을 통해 여과한다 (헥산:에틸 아세테이트=1:1). 68.34 g 의 조생성물을 황색 오일로서 수득한다.

실시예 4

(±)-2-프로피오닐-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온의 제조

47 g 의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 아세토니트릴 (325 ml) 및 피리딘 (41 ml) 에 용해한다. 12 ℃ 에서, 43.9 g 의 염화 프로피오닐을 1 시간에 걸쳐 적가한다. 그리고 나서, 실온에서 5 시간동안 교반한다. 145 ml 의 물을 혼합물에 가하고, 아세토니트릴을 진공에서 증발 제거한다. 수상을 115 ml 의 에틸 아세테이트로 3 번 추출한다. 혼합된 유상을 1N HCl (140 ml), 포화 NaHCO₃ (40 ml) 및 NaCl (40 ml) 용액으로 수세하고, 황산 나트륨으로 건조하고 완전히 증발시킨다. 잔류물을 증류하여 정제한다. 55.8 g 의 표제 화합물을 수득하고 그대로 방치하여 고체화한다. 수득율은 81.6 % 이다.

비점 2.8 mbar 75 ~ 80 ℃

융점: 54 ~ 56 ℃

¹H-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm] 0.95 (t, 3H);

400 MHz 2.10 (quart., 1H);

2.28 (quart., 1H);

2.64 (m, 2H);

3.42 (s, 1H);

5.16 (s, 1H);

6.78 (m, 1H);

6.96 (m, 1H).

실시예 5

(±)-2-이소부티릴-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온의 제조

45.1 g 의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 아세토니트릴 (310 ml) 및 피리딘 (39 ml) 에 용해한다. 10 ℃ 에서, 54.1 g 의 염화 이소부티릴을 1 시간에 걸쳐 적가한다. 그리고 나서, 실온에서 5 시간동안 교반한다. 140 ml 의 물을 혼합물에 가하고, 아세토니트릴을 진공에서 증발 제거한다. 수상을 4 × 120 ml 의 에틸 아세테이트로 추출한다. 혼합된 유상을 1N HCl (50 ml), 포화 NaHCO₃ (50 ml) 및 NaCl (50 ml) 용액으로 수세하고, 황산 나트륨으로 건조하고 완전히 증발시킨다. 잔류물을 환류하 n-헥산 (240 ml) 내에서 활성 차콜과 함께 자비시킨다. 활성 차콜을 여과한 후, 여과물을 0 ℃ 로 냉각시키고 표제 화합물을 여과한다. 54.5 g 의 생성물을 수득한다. 수득율은 76 % 이다.

융점 : 41 ~ 42 ℃

¹H-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm] 0.92 (d, 3H);

400 MHz 1.06 (d, 3H);

2.10 (m, 1H);

2.28 (m, 1H);

3.40 (m, 2H);

5.16 (s, 1H);

6.78 (m, 1H);

7.92 (m, 1H).

실시예 6

(±)-2-클로로아세틸-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온의 제조

10.1 g 의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소하, 10 ℃ 에서 디클로로메탄 (10 ml), 피리딘 (8.4 ml) 및 0.22 g 의 4-N,N-디메틸아미노피리딘의 혼합물에 용해한다. 13.5 g 의 염화 클로로아세틸을 1 시간에 걸쳐 적가한다. 온도를 44 ℃ 로 올린다. 혼합물을 실온에서 2 시간동안 교반한다. 100 ml 의 물을 용액에 가한다. 상분리 후에, 수상을 100 ml 의 디클로로메탄으로 추출한다. 혼합된 유상을 황산 나트륨으로 건조하고 완전히 증발시킨다. 잔류물을 1 g 의 활성 차콜 존재하에서 10 분 동안, 환류하면서 100 ml 의 디이소프로필 에테르 내에서 자비시킨다. 고온 여과 후, 여과물을 실온으로 냉각하고, 고체를 여과하여 건조한다. 10.35 g 의 표제 화합물을 수득한다. 수득율은 60 % 이다.

융점: 86 ~ 88 ℃

¹H-NMR (CDCl₃): δ [ppm] 2.28 (d, 1H);

400 MHz 2.40 (d, 1H);

3.48 (s, 1H);

4.56 (d, 2H);

5.30 (s, 1H);

6.70 (d, 1H);

6.94 (m, 1H).

실시예 7

(±)-1-아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐의 제조

79.56 g 의 (±)-2-아세틸-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 에탄올 (450 ml) 에 용해하고, -10 ℃ 로 냉각한다. 19.8 g 의 소듐 보로히드리드을 45 분에 걸쳐 부분에 가한다.

0 ℃ 에서 3 시간동안 교반하고 나서 진한 황산으로 pH 를 1.8 로 조절한다. 에틸 아세테이트 (200 ml) 를 이 혼합물에 가하고, 고체를 여과 제거한다. 그리고 나서 완전히 증발시킨다. 잔류물을 물에 흡수시키고, 염화 메틸렌으로 수세하고 완전히 증발시킨다. 조생성물을 용매로서 에틸 아세테이트/메탄올 5:1 을 사용하여 실리카겔 여과로 정제한다. 여과물을 농축한다. 51.83 g 의 생성물을 백색 고체로서 수득한다. 수득율은 사용된 2-아세틸-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온 을 기준으로 64 % 이다.

융점 91 ~ 93 ℃

¹H-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm] 1.18 (m, 1H);

400 MHz 1.78 (s, 3H);

2.29 (m, 1H);

2.66 (m, 1H);

3.35 (s, 2H);

4.58 (s, 1H);

4.72 (m, 1H);

5.61 (d, 1H);

5.85 (d, 1H);

7.83 (d, 1H).

실시예 8

(±)-1-부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐의 제조

73.87 g 의 (±)-2-부티릴-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 에탄올 (400 ml) 에 용해하고, -10 ℃ 로 냉각한다. 15.68 g 의 소듐 보로히드리드를 45 분에 걸쳐 부분에 가한다. 0 ℃ 에서 3 시간동안 교반하고 나서 진한 황산으로 pH 를 1.5 로 조절한다. 에틸 아세테이트 (200 ml) 를 이 혼합물에 가하고, 고체를 여과 제거한다. 그리고 나서 완전히 증발시킨다. 잔류물을 물에 흡수시키고, 염화 메틸렌으로 수세하고, 고도의 진공 하에서 증발 및 건조시킨다. 60.55 g 의 생성물을 수득한다. 수득율은 사용한 (±)-2-부티릴-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 기준으로 80 % 이다.

융점 71 ~ 72 ℃

¹H-NMR (CDCl₃): δ [ppm] 0.98 (t, J=8.5 Hz, 3H);

400 MHz 1.40-1.50 (1H);

1.58-1.68 (2H);

2.10-2.18 (2H);

2.42-2.55 (1H);

2.85 (m, 1H);

3.62 (AB syst., 2H);

4.98 (m, 1H);

5.78-5.82 (2H);

6.38 (m, 1H).

실시예 9

(±)-1-페닐아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐의 제조

67 g 의 조 (±)-2-페닐아세틸-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 에탄올 (450 ml) 에 용해하고 -10 ℃ 로 냉각한다. 13.2 g 의 소듐 보로히드리드를 1 시간에 걸쳐 부분에 가한다. 실온에서 3.5 시간동안 교반하고 나서, 진한 황산으로 pH 를 3.8 로 조절한다. 혼합물을 완전히 증발시킨다. 잔류물을 건조하고 실리카겔 여과 (헥산:에틸 아세테이트=1:9) 로 정제한다. 에틸 아세테이트로부터 재결정화한 후, 54.6 g 의 백색 고체를 수득한다. 수득율은 사용한 (±)-2-페닐아세틸-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 기준으로 80 % 이다.

¹H-NMR (CDCl₃): δ [ppm] 1.28-1.35 (1H);

400 MHz 1.40 (m, 1H);

2.38-2.45 (1H);

2.79 (m, 1H);

3.50 (AB syst., 2H);

3.52 (s, 3H);

4.98 (m, 1H);

5.75 (m, 2H);

5.98 (m, 1H).

7.20-7.38 (5H).

실시예 10

(±)-1-BOC-아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐의 제조

15 g 의 조 (±)-1-아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐 히드로클로리드를 질소하, 실온에서 150 ml 의 물 및 150 ml 의 디옥산의 혼합물에 용해한다. 1 N NaOH 로 용액의 pH 를 14 로 조절하고 나서, tert-부틸옥시카르보닐 플루오리드 (BOC-F, 20 % 과량) 의 디에틸 에테르 용액을 가하고, 그 혼합물을 실온에서 추가로 3 시간동안 교반한다 (Synthesis 1975, 599 에서 설명한 바와 같이 제조된 BOC-F). 진한 HCl 로 pH 를 2 로 조절한다. 유기 용매를 증류한 후, 50 ml 의 물을 잔류물에 가하고, 혼합물을 3 × 100 ml 의 에틸 아세테이트로 추출한다. 혼합된 유상을 완전히 증발시킨다. 잔류물을 110 ml 의 디이소프로필 에테르 및 80 ml 의 n-헥산의 혼합물 내에서 결정화한다. 11.95 g 의 표제 화합물을 수득한다. 수득율은 56 % 이다.

융점: 68 ~ 70 ℃

¹H-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm] 1.18 (m, 1H);

400 MHz 1.38 (s, 9H);

2.26 (m, 1H);

2.65 (m, 1H);

3.33 (t, 2H);

4.45 (m, 1H);

4.55 (t, 1H);

5.62 (m, 1H);

5.79 (m, 1H);

6.73 (d, 1H).

실시예 11

(±)-1-프로피오닐아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐의 제조

16.6 g 의 (±)-2-프로피오닐-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 물 (140 ml) 및 2-부탄올 (66 ml) 에 용해하고 -5 ℃ 로 냉각시킨다. 3 g 의 소듐 보로히드리드를 2 시간에 걸쳐 부분에 가한다. 혼합물을 10 ℃ 에서 2.5 시간동안 교반하고 나서, 진한 염산 및 물 (1/1) 의 혼합물로 pH 를 2.2 로 조절한다. 용액을 증발시켜 40 g 으로 하고 2N NaOH 로 pH 를 6.2 로 조절한다. 혼합물을 5 × 50 ml 의 디클로로메탄으로 추출한다. 혼합된 유상을 완전히 증발시키고, 잔류물을 톨루엔 (150 ml) 내에서 재결정화한다. 11.1 g 의 표제 화합물을 수득한다. 수득율은 65 % 이다.

융점 : 67 ~ 68 ℃

¹H-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm] 0.96 (t, 3H);

400 MHz 1.16 (quint., 1H);

2.04 (quart., 2H);

2.26 (m, 1H);

2.66 (m, 1H);

3.34 (m, 2H);

4.58 (t, 1H);

4.72 (m, 1H);

5.61 (m, 1H);

5.84 (m, 1H);

7.72 (d, 1H).

실시예 12

(±)-1-이소부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐의 제조

9 g 의 (±)-2-이소부티릴-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온을 질소 하에서 물 (32 ml) 및 2-부탄올 (84 ml) 에 용해하고 0 ℃ 로 냉각한다. 1.37 g 의 소듐 보로히드리드를 3.5 시간에 걸쳐 부분에 가한다. 혼합물을 20 ℃ 에서 추가로 3 시간 동안 교반하고 나서, 진한 염산 및 물 (1/1) 의 혼합물로 pH 를 2.5 로 조절하고 그 후, 2N NaOH 로 중화한다. 용액을 증발시켜 40 g 으로 한다. 잔류물을 3 × 80 ml 의 디클로로메탄으로 추출한다. 혼합된 유상을 완전히 증발시킨다. 수득한 고체를 25 ml 의 톨루엔 내에서 결정화한다. 6.8 g 의 표제 화합물을 수득한다. 수득율은 73.6 % 이다.

융점 : 80 ~ 81 ℃

¹H-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm] 0.98 (d, 6H);

400 MHz 1.16 (quint., 1H);

2.30 (m, 2H);

2.68 (m, 1H);

3.32 (t, 2H);

4.58 (t, 1H);

4.70 (m, 1H);

5.61 (m, 1H);

5.82 (m, 1H);

7.68 (d, 1H).

실시예 13

페니실린 G 아실라아제를 사용한 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐의 제조

생체변환 용으로 E.coli 로부터 나온 페니실린 G 아실라아제 EC 3.5.1.11 (Boehringer Mannheim) 165 U (units)/g 또는 바실루스 메가테리움으로부터 나온 페니실린 G 아실라아제 EC 3.5.1.11 을 사용한다.

이를 위해, 50 mM 의 인산 나트륨 완충액 (pH 5 ~ 9; 4 ml) 를 1 중량 % 의 비라세미성 1-페닐아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐 및 400 mg 의 적절한 페니실린 G 아실라아제와 함께 37 ℃ 에서 배양한다.

정해진 시간 간격 후에 샘플을 취하고 박막 크로마토그래피 (실리카 겔 60, 부탄올:물:빙초산 = 3:1:1; 닌히드린으로 검출), 가스 크로마토그래피 (모세관 칼럼, HP-5, 5 % 페닐메틸실록산) 또는 HPLC 로 분석한다. 효소는 높은 활성을 가진 페닐아세틸기를 제거하고 그리하여 대응하는 아미노 알코올의 40 % 까지 유리시킨다. 유리 아미노 알코올은 80 % 의 ee 로 수득한다.

실시예 14

미생물을 사용한 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐의 제조

14.1 비스프 (Visp) 의 ARA 수분 처리 식물로부터 나온 폐 슬러지 (20 %) 를 37 ℃ 에서 흔들어 주면서 0.5 중량 % 의 1-아세틸-, 1-프로피오닐-, 1-이소부티릴- 또는 1-부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐을 함유하는 A + N 배지 (표 1 참조) 에서 배양한다. (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐을 형성한 후 박막 크로마토그래피를 한다.

1-3 전이는 1 % 의 이러한 부유 물질로 수행되고, 분리는 고체 배지 (표 1 의 배지내 플레이트 카운트 아가 (plate count agar); 20 g/ℓ) 상에서 일어난다.

이런 식으로 미생물 알칼리겐스/보르데텔라 FB 188 (DSM 1172), 로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101 (DSM 10686), 고르도나 sp. CB 100 (DSM 10687) 및 로도코쿠스 sp. FB 387 (DSM 11291) 을 분리한다.

14.2 이런 식으로 분리된 미생물을 0.5 % 의 1-아세틸-, 1-프로피오닐-, 1-이소부티릴- 또는 1-부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐을 함유하는 배지 (표 1) 에서 배양한다. 그들은 24 내지 36 시간 내에 성장하여 2 내지 3 의 광학 밀도 (optical density: OD) 가 된다. 이렇게 수득한 세포를 성장의 후기 지수기에 수집하고 10 mM 인산 완충액으로 수세한다.

그 후에 일어나는 생체변환은 1 중량 % 의 1-아세틸-, 1-이소부티릴- 또는 1-부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐을 함유하는 50 mM 의 인산 완충액 (pH 4.5 ~ 9) 내에서 수행된다. 박막 크로마토그래피에 의해 50 % 의 기질이 (1R,4S)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐으로 가수분해 됨을 알아냈다. HPLC 분석은 ee 값이 80 내지 93 % 임을 나타낸다.

1-부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐을 기질로 사용하는 경우, 생체변환율은 A + N 배지 상에서 배양하면 균주 DSM 10686 에 대해 0.14 (g/ℓ/h/OD) 이고, 1-부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐을 함유하는 NYB (nutrient yeast broth) 상에서 배양하면 0.03 (g/ℓ/h/OD) 이다.

동일한 전환이 200 mM 의 기질 농도 (1-부티릴아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐)에서 균주 DSM 10687 에서 일어나면, 생체변환율은 0.161 (g/ℓ/h/OD) 이다.

표 1 A + N 배지

MgCl₂ 0.4 g/ℓ

CaCl₂ 0.014 g/ℓ

FeCl₃ 0.8 mg/ℓ

Na₂SO₄ 0.1 g/ℓ

KH₂PO₄ 1 g/ℓ

Na₂HPO₄ 2.5 g/ℓ

NaCl 3 g/ℓ

비타민 용액 1 ㎖/ℓ

미량 원소 용액 1 ㎖/ℓ

pH 7.5

14.3 로도코쿠스 에리스로폴리스 DSM 10686 을 30 ℃, 6 ℓ 의 발효기에서 탄소 및 질소 공급원으로서 암모늄 아세테이트 (3 g/ℓ) 와 함께 최소 배지 (표 2 참조) 에서 배양하여 세포 밀도를 OD 650 ＞ 25 가 되도록 한다. 세포가 성장하는 동안, 50 % 아세트산을 추가 C 공급원으로서 계속해서 가한다. 그리고 나서 효소 활성을 유도하기 위해, 60 g 의 (+/-)-1-아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐을 가하고, 몇시간 동안 계속해서 배양한다. 마지막으로, 추가 40 g 의 (+/-)-1-아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐을 가하고, 추가 10 시간 동안 배양한다. 생체변환의 진행 과정은 HPLC 로 직결된다. 사용된 라세미성 기질을 기준으로 분석 수율이 40 % 이고, ee 가 85 % 에 도달하면, 산을 가함으로서 발효를 중지시킨다.

표 2

배지 조성물

성분 농도

효모추출물 0.5 g/ℓ

펩톤 M66 0.5 g/ℓ

KH₂PO₄ 4.0 g/ℓ

Na₂HPO₄2H₂O 0.5 g/ℓ

K₂SO₄ 2.0 g/ℓ

NH₄ 아세테이트 3.0 g/ℓ

CaCl₂ 0.2 g/ℓ

MgCl₂·6H₂O 1.0 g/ℓ

미량 원소 용액 1.5 ml/ℓ

(하기 참조)

PPG (폴리프로필렌 글리콜) 0.1 g/ℓ

미량 원소 용액

KOH 15.1 g/ℓ

EDTA·Na₂·2H₂O 100.0 g/ℓ

ZnSO₄·7H₂O 9.0 g/ℓ

MnCl₂·4H₂O 4.0 g/ℓ

H₃BO₃ 2.7 g/ℓ

CoCl₂·6H₂O 1.8 g/ℓ

CuCl₂·2H₂O 1.5 g/ℓ

NiCl₂·6H₂O 0.18 g/ℓ

Na₂MoO₄·2H₂O 0.27 g/ℓ

14.4 실시예 14.3 과 유사하게, 미생물 아트로박터 sp. HSZ 5 (DSM 10328), 로도코쿠스 sp. FB387 (DSM 11291), 알칼리겐스 자일로속시단스 ssp. 데니트리피칸스 HSZ 17 (DSM 10329), 아그로박테리움/리조비움 HSZ 30, 바실루스 심플렉스 K2 및 슈도모나스 푸티다 K32 를 1-아세틸-, 1-프로피오닐-, 1-이소부티릴- 또는 1-부티릴-아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐 (이후 아미노 알코올로 약칭) 이 있는 배지 및 없는 배지 (표 1) 에서 아세트산 나트륨 상에서 배양한다.

하기 결과는 아미노 알코올없이 배양된 지수기 세포에서 수득된다 (HPLC 분석):

균주 비율 [mmol/OD.h] ee/변환 [%]

HSZ 5 (DSM 10328) 0.05 88.7/16

HSZ 17 (DSM 10329) 0.005 95/23

K32 0.05 54/1

CB101 (DSM 10686) 0.1 84/39

균주 K2 및 K17 을 배양하고, 수집하고, 60 시간의 생체변환을 수행한다.

균주 비율 [mmol/OD.h] ee/변환 [%]

K2 - 92/10

HSZ 30 - 93/3.5

지수기 및 정체기 세포를 모든 배치로부터 수집하고 생체변환용 정지 세포로 사용한다. 아미노 알코올로 유도되거나 또는 유도되지 않는 세포의 초기 비율에서 TLC 분석으로부터 관찰되는 차이점은 없다.

실시예 15

로도코쿠스 에리스로폴리스 CB101 (DSM 10686) 으로부터 나온 N-아세틸아미노-알코올 히드롤라제의 정제

SDS-PAGE (Pharmacia Phast gel, 10-15% 구배) 에서 단백질 밴드 (band) 가 분자량 50 kD 위치에 단 하나만 존재할 때까지 하기에서 기술한대로 효소를 정제한다.

로도코쿠스 에리스로폴리스 CB101 (DSM 10686) 의 세포를 50 mM 트리스 완충액 (pH 6.2) 으로 수세하고 광학 밀도 OD_{650 nm} 가 190 이 되도록 농축한다. 최종 농도 1 mM DNAse 에 페닐메탄술포닐 플루오리드 (PMSF) 를 가한 후에, 조추출물을 수득하기 위해 프렌치 압축으로 세포를 처리한다. 원심분리로 단백질 농도가 4.8 mg ml^-1 인 무세포 추출물 200 ml 를 수득한다.

960 mg 의 무세포 추출물을 1 mM 의 디티오트레이톨 (dithiothreitol: DTT) 을 함유하는 50 mM 의 트리스 완충액 (pH 8.0) 과 평형인 HiLoad 26/10 Q-세파로스 (Sepharose) 이온 교환 크로마토그래피 칼럼 (Pharmacia) 에 로딩한다.

칼럼을 동등한 완충액으로 수세한 후에, 단백질을 선형 완충액 구배 (1500 ml; 구배: 1 mM DTT 를 함유하는 50 mM 트리스 완충액 (pH 8.0) - 1 mM DTT 및 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.0)) 로 용리한다. 효소는 370 내지 430 mM NaCl 사이 및 pH 7.6 에서 칼럼으로부터 용리된다.

활성 분획은 수집하여 9 ml 로 농축한다. 단백질 함량은 41 mg 이다.

추가 정제를 위해, 단백질 용액을 50 mM NaCl 및 1 mM DTT 를 함유하는 50 mM 트리스 완충액과 평형인 HiLoad 26/60 수퍼덱스 (Superdex) 75 겔 여과 크로마토그래피 칼럼 (Pharmacia) 에 로딩한다. 활성 분획은 혼합되고 전체 단백질 함량은 10.9 mg 이다.

이 단백질 용액을 1 mM DTT 를 함유하는 50 mM 트리스 완충액 (pH 8.5) 과 평형인 Mono Q HR5/5 칼럼 (Pharmacia) 에 로딩한다. 단백질은 1 mM DTT 를 함유하는 50 mM 트리스 완충액 (pH 8.5) - 1 mM DTT 및 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 완충액 (pH 8.5) 의 선형 기울기 (40 ml) 로 용리된다. 효소는 390 mM NaCl 및 440 mM NaCl 사이에서 용리된다. 활성 분획은 1.4 mg 의 단백질을 함유한다.

마지막 정제 단계에서, 동일한 칼럼을 사용하고, 동일한 완충액으로 평형을 이룬다. 사용된 용리 기울기는 0 ~ 500 mM NaCl 및 pH 7.0 ~ 8.5 의 동일한 완충액이다. 이런 방법으로 430 ㎍ 의 순수 효소를 분리하는 것이 가능하다.

효소의 N-말단 서열은 단백질 블롯 (blot) 으로부터 직접 측정된다. 하기 20 아미노산의 서열을 얻어냈다: Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala- Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn.

이 서열은 공지의 단백질과 동일함을 보이지 않는다.

실시예 16

효소 특성의 규명

효소 특성의 규명은 정제된 효소 및 세파덱스 (Sephadex) G-25 칼럼 (PD-10, Pharmacia) 을 사용하여 탈염된 무세포 추출물, 이 둘에 의해 수행된다.

무세포 추출물 내 단백질의 농도는 7.3 mg ml^-1 이고 정제된 효소의 단백질 농도는 135 ㎍ ml^-1 이다. PMSF 는 이 무세포 추출물에 첨가하지 않는다.

16.1 K_m 측정

K_m 측정은 무세포 추출물에서 이루어진다. pH 7.0 및 30 ℃ 에서의 반응에 대한 K_m 은 1-아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐에 있어 22.5 mM 이다.

16.2 최적 pH

1-아세틸아미노-4-히드록시메틸-2-시클로펜텐 (25 mM) 의 가수분해에 대한 최적 pH 는 하기 완충 용액 중 pH 6.2 ~ 9.0 의 pH 범위에서 정제된 효소 및 무세포 추출물로 측정한다.

트리스 완충액 100 mM pH 9.0; 8.5; 8.0; 7.5; 7.0

시트르산/인산 완충액 100 mM pH 7.0; 6.55; 6.2

활성도는 24 시간 동안 측정한다.

반응에 대한 최적 pH 는 1R,4S 및 1S,4R 호변이성질체의 생성에 있어 pH 7.0 내지 pH 7.5 이다.

무세포 추출물내 활성을 위한 최적 pH 는 pH 7.0 이다. 그러나, 선택성은 pH 6.0 내지 pH 7.0 이 더 좋다.

도 1 은 pH 의 함수로서 로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101(DSM 10686) 으로부터 나온 N-아세틸아미노알코올 히드롤라제(무세포 추출물)의 활성도를 나타낸다.

16.3 실시예 16.2 에서 지시된 반응에 대한 최적 온도는 25 내지 30 ℃ 이다.

도 2 는 온도의 함수로서 로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101 (DSM 10686) 으로부터 나온 N-아세틸아미노알코올 히드롤라제 (무세포 추출물) 의 활성도를 나타낸다.

서열 목차

Claims (12)

1. 하기 화학식의 화합물로부터 선택된 시클로펜텐 유도체를 유일한 질소 공급원, 유일한 탄소 공급원 또는 유일한 탄소 및 질소 공급원으로 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는, 로도코쿠스, 고르도나, 아트로박터, 알칼리겐스, 아그로박테리움/리조비움, 바실루스, 슈도모나스 또는 알칼리겐스/보르데텔라 속으로부터 선택되는 미생물:

   (상기 식에서, R¹ 은 C₁-C₄-알킬, C₁-C₄-알콕시, 아릴 또는 아릴옥시를 나타낸다).
2. 제 1 항에 있어서, 미생물이 알칼리겐스/보르데텔라 FB 188 (DSM 11172), 로도코쿠스 에리스로폴리스 CB 101 (DSM 10686), 아트로박터 sp. HSZ 5 (DSM 10328), 로도코쿠스 sp. FB 387 (DSM 11291), 알칼리겐스 자일로속시단스 ssp. 데니트리피칸스 HSZ 17 (DSM 10329), 아그로박테리움/리조비움 HSZ 30, 바실루스 심플렉스 K2, 슈도모나스 푸티다 K32 또는 고르도나 sp. CB 100 (DSM 10687)에서 선택된 미생물.
3. 하기 화학식 I 및 II 의 (1R,4S)- 및/또는 (1S,4R)-1-아미노-4-(히드록시메틸)-2-시클로펜텐 및/또는 하기 화학식 III 및 IV 의 (1S,4R)- 및/또는 (1R, 4S)-아미노 알코올 유도체의 제조 방법에 있어서:

   (상기 식에서, R¹ 은 C₁-C₄-알킬, C₁-C₄-알콕시, 아릴 또는 아릴옥시를 나타낸다) 제 1 항에 따른 미생물을 이용하여 하기식의 시클로펜텐 유도체:

   (상기 식에서, R¹ 은 일정한 의미를 갖는다) 를 화학식 I 및/또는 II 의 화합물의 변환, 및 적합한 경우 상기 변환의 결과로 상기 화합물 및/또는 화학식 III 및/또는 IV 의 아미노 알코올 유도체의 단리가 포함되는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 하기 화학식의 시클로펜텐 유도체:

   (상기 식에서, R¹ 은 일정한 의미를 갖는다) 가 첫 번째 단계에서, 하기 화학식의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온:

   을 아실화하여 하기 화학식의 (±)-2-아자비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온 유도체:

   (상기 식에서, R¹ 은 일정한 의미를 갖는다) 를 수득하고, 두 번째 단계에서, 이 화합물을 화학식 VII 의 시클로펜텐 유도체로 환원함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 첫 번째 단계의 아실화가 하기 화학식의 카르보닐 할라이드:

   (상기 식에서, X 는 할로겐 원자를 나타내고, R¹ 은 일정한 의미를 갖는다) 또는 하기 화학식의 카르복실산 무수물:

   (상기 식에서, R¹ 은 일정한 의미를 갖는다) 과 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 첫 번째 단계의 아실화가 비양성자성 용매에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 두 번째 단계의 환원이 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 보로히드리드, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 알루미늄 히드리드 및/또는 비트리드와 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 두 번째 단계의 환원이 양성자성 용매에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 VII 의 시클로펜텐 유도체의 반응이 로도코쿠스, 고르도나, 아트로박터, 알칼리겐스, 아그로박테리움/리조비움, 바실루스, 슈도모나스 또는 알칼리겐스/보르데텔라 속의 미생물을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 VII 의 시클로펜텐 유도체의 반응이 바실루스 메가테리움 또는 대장균 종의 미생물에서 나온 페니실린 G 아실라아제를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세 번째 단계의 반응이 20 내지 40 ℃ 의 온도, pH 5 내지 9 에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물로부터 나온 무세포 (효소) 추출물.