CN110184219B - 一株腈化物降解菌及其在生产丙烯酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域,特别涉及一株腈化物降解和丙烯酸生产菌的应用。本发明提供了一种腈化物生物降解方法，获得了一株可转化丙烯腈合成丙烯酸的细菌，结合形态、生理生化特性以及16S rDNA测序分析,将其鉴定为辛芳芳菌Xinfangfangia sp.DLY26。该菌已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心。其保藏编号为CCTCC No：M 2019001。在腈类化合物为唯一碳源的培养基中，该菌能够降解丙烯腈、3‑氰基吡啶、4‑氯丁腈、己二腈、正戊腈和二甲基戊二腈。对于丙烯腈的转化率可达79.4％。在2‑8个小时内,丙烯酸的生产效率约为167mg‑323mg每小时每克干细胞。本发明对于相关化工领域、环境污染治理领域等，具有重大的应用前景。

Description

一株腈化物降解菌及其在生产丙烯酸中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株腈化物降解菌及其在生产丙烯酸中的应用。
背景技术
腈类化合物是一种重要的有机化工原料，同时也是一种有刺激性气味的有毒物质。在合成橡胶、石油炼制过程的污水中含有众多不同种类的腈类化合物，丙烯腈就是其中的一种重要有毒成分。相比于物理法、化学法在处理腈类化合物过程中的副产物，人们更倾向于采用对环境无害的生物法处理污水中的腈类化合物。生物法相较于物理法和化学法而言，具有反应条件温和、运行稳定且成本低廉的特点。自19世纪以来，利用生物法处理废水中的有机物已成为世界各国的主要方法。利用微生物的代谢功能将废水中的腈类和酚类等有机物降解为水和二氧化碳等，从而达到废水的净化效果。
作为一种重要的有机原料，丙烯腈在工业生产和使用过程中造成了严重的环境污染，这使得微生物在转化腈类物质的领域得到了快速发展。国内外学者不断发现并分离出一系列能够利用腈类物质的细菌、真菌等，应用于生物合成、污染物降解等领域。迄今为止，未见有辛芳芳菌降解腈类化物的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一种腈化物降解菌。
本发明的另一目的是提供该菌在生产丙烯酸中的应用。
本发明提供的腈化物降解菌株是一株革兰氏染色反应阴性菌，已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)。分类命名为辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)DLY26。保藏编号为CCTCC No：M 2019001。
腈化物降解菌主要生物学特性为：无鞭毛，棒状，无运动性，最适生长pH为7.0，最适生长温度为30℃，最适NaCl生长浓度范围为1％(w/v)。
腈化物降解菌菌落在TSA培养基(青岛海博生物，中国)表面呈现乳黄色，菌落表面光滑、粘稠、颜色均一。
本发明提供了所述腈化物降解菌降解：丙烯腈、3-氰基吡啶、4-氯丁腈、己二腈、正戊腈和二甲基戊二腈的方法。
本发明还提供了一种所述腈化物降解菌生产丙烯酸的方法,包括如下步骤：制备种子液：按10％接种量接种辛芳芳菌DLY26至含10mM丙烯腈(作为唯一氮源)的腈化物降解用基础培养基，振荡培养48h，收集菌体沉淀；利用丙烯腈生产丙烯酸：取20mM丙烯腈的基础培养基，加入种子液，30℃、150rpm振荡培养104h。0-8h每隔2h取样一次，9-32h每隔12h取样一次，33-104h每隔24h取样一次；每次取样5mL；每次取样后在培养体系中加入20mM丙烯腈，用气相色谱法检测丙烯腈的产量。
本发明对于相关化工领域、环境污染治理领域等，具有重大的应用前景。
附图说明
图1为菌株DLY26的照片。
图2为系统发生树。
图3为细菌生长曲线。
图4为气相色谱法检测的色谱图。
图5为振荡培养的各个时间点丙烯腈的降解率。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、辛芳芳菌DLY26的分离、鉴定和保藏
二、分离
取约1ml活性污泥样品(取自石化炼油化污水处理系统)，用无菌蒸馏水依次稀释至10倍体积、20倍体积、50倍体积、100倍体积和1000倍体积。采用涂布平板法将100μl稀释后样本涂布于固体培养基表面，30℃培养，每天观察表面菌落的生长情况。挑取颜色不同、形态差异的菌落，通过三区划线法进行纯化和培养，直至在培养基表面生长出能够观察到形态、大小等特征都相同的单菌落为止。经纯化得到单一菌落。菌落在TSA培养基(青岛海博生物，中国)表面呈现乳黄色，菌落表面光滑、粘稠、颜色均一。
二、鉴定
将纯化获得的菌株接种于TSA平板，30℃培养24h，然后使用透射电子显微镜观察细胞的形态、大小等特征(菌株DLY26的照片见图1)。从培养24h的TSA平板表面挑取单菌落，按照标准方法进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。制备半固体培养基TSB(青岛海博生物，中国)，采用穿刺接种法观察细菌的运动性和好氧性情况。
以液体培养基TSB为基础：配制不同NaCl浓度的培养基体系(NaCl梯度为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0g/100mL)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，使用UV-2450分光光度计在OD600处检测细菌的其生长情况，以确定最佳盐度生长范围；配制pH值不同的液体培养基(pH梯度设置为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，以培养条件相同的不接菌培养基作为空白对照，以确定最佳生长pH范围；设置温度梯度为4℃、20℃、28℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃，以确定最佳生长温度范围。
以液体碳源培养基为基础，添加浓度的不同碳水化合物作为唯一的碳源，检测细菌的同化作用。
参照常见细菌系统鉴定手册中的方法，检测细菌的硝酸盐还原、亚硝酸盐还原能力，反硝化能力以及脂酶、接触酶的有无。使用海博革兰氏阴性细菌鉴定系统(青岛海博生物，中国)进行细菌的Voges-Proskauer测试(VP测试)，检测细菌的硫化氢(H2S)产生、脲酶(URE)、明胶(GEL)水解情况。也可以用于评价其他生理生化特征的有无，例如通过对精氨酸(ADH)、山梨醇(SOR)、蔗糖(SAC)等的降解情况，以检验精氨酸酶、山梨醇脱氢酶、蔗糖酶的存在情况。
以X.soli ZQBWT、R.megalophilus JA194T和Fal.halotolerans JA744T作为参考菌株。菌株DLY26和参考菌株的结果见表2和表3和表4。
表2
生化特征 DLY26 ZQBW<sup>T</sup> JA194<sup>T</sup> JA744<sup>T</sup>
革兰氏染色 - - - -
温度范围 4-45 26-35 4-45 4-40
最适温度 30 30 30 30
pH范围 5-11 6-12 3-11 3-11
最适pH 7.0 7.0 7.0 7.0
盐度范围(％) 0-5.0 0-5.0 0-5.0 0-5.0
最适盐度(％) 1.0 0 0 0
细胞大小(μm) 1.2-2.0*,0.4-0.6 1.5-2.6*,0.7-0.9 1.2-1.0*,1.5-2.0 2.0-5.0*,1.0-1.2
鞭毛 - - - +
细胞外形 Rod Rod Oval Rod Oval Rod
运动性 - - - +
表3
Figure GDA0002935920920000031
Figure GDA0002935920920000041
表4
ONPG ADH LDH ODC CIT H<sub>2</sub>S URE IND VP GEL RHA MEL AMY OX
DLY26 + + + + + W + - - - - - - +
DLY30 + + - - + W + - - + - - - +
JA194<sup>T</sup> - + + + + W + - - - - - - +
JA744<sup>T</sup> + + + + + W + - - - - - - +
注：ONPG：β-半乳糖苷酶；ADH：精氨酸；LDH：赖氨酸；ODC：鸟氨酸；CIT：柠檬酸盐；H2S：产硫化氢试验；URE：脲酶；IND：吲哚；GEL：明胶；RHA：鼠李糖；MEL：蜜二糖；AMY：苦杏仁甙；OX：氧化酶。
利用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取菌株DLY26的基因组DNA，并采用通用引物27F和1492R进行16S rDNA扩增。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法分析产物条带，获得目标条带并使用天根DNA纯化试剂盒DP209进行纯化。将纯化产物连接到载体pMD19-T中，利用pMD19-T克隆试剂盒，将目的载体转化至大肠杆菌DH5α。将重组菌送往青岛擎科生物技术有限公司进行测序，获得16S rRNA序列1371bp。利用GenBank数据库检索每个相关基因的16SrRNA的序列，使用MEGA版本7.0构建菌株的系统发育树。使用近邻连接法(NJ)进行细菌的系统发育分析。基于1000次重复，使用Bootstrap分析确定系统发生树的拓扑结构。见图2。
以上鉴定结果表明，菌株DLY26属于红细菌科(Rhodobacteraceae)，辛芳芳菌属(Xinfangfangia)。
三、保藏
辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)DLY26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC No：M 2019001。
实施例2、辛芳芳菌DLY26对丙烯腈的降解和生产丙烯酸
Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液的配方：磷酸氢二钠14.2g、磷酸二氢钠12.2g，溶于800mLddH2O，用ddH2O定容至1L，调pH至7.0。
活化培养基的配方：胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)30g，用ddH2O溶解并定容至1L，调pH至7.0。
腈化物降解用基础培养基：磷酸氢二钠2.0g、磷酸二氢钾1.0g、酵母粉0.5g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.03g，溶于800mL Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，然后加入甘油3.25mL并混匀，然后用Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液定容至1L。
一、制备种子液
将辛芳芳菌DLY26接种至活化培养基，30℃、150rpm振荡培养，获得种子液。种子液的OD600nm值＝0.6-0.8。
二、制作细胞干重标准曲线
1、取步骤一制备的种子液，按10％接种量接种至活化培养基，然后30℃、150rpm振荡培养48h。
2、完成步骤1后，取样40mL，用活化培养基调整OD600nm值，得到OD600nm值不同的各个菌液。
3、取步骤2得到的菌液，8000rpm离心15min，收集菌体沉淀。
4、取步骤3得到的菌体沉淀，用生理盐水充分洗涤，然后60℃烘干，测量干重。
5、制作OD600nm值与生物量(以细胞干重计)的标准曲线。标准曲线方程：y＝2.895x-0.036；R2＝0.9988；x为OD600nm值，y为细胞干重(单位：g/L)。
三、制作细菌生长曲线以及检测丙烯腈的降解率
1、取步骤一制备的种子液，按10％接种量接种至含10mM丙烯腈(作为唯一氮源)的腈化物降解用基础培养基，然后30℃、150rpm振荡培养，每隔12h检测OD600nm值。结果表明，振荡培养48h后OD600nm值达到最大值。
2、取步骤1中振荡培养48h的培养体系，8000rpm离心15min，收集菌体沉淀，洗涤2-3次(每次洗涤的方法均为：用Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液悬浮菌体，然后8000rpm离心15min，收集菌体)，用Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液悬浮菌体，得到OD600nm值＝0.43的菌悬液。
3、取100mL含20mM丙烯腈的腈化物降解用基础培养基，加入5mL步骤2制备的菌悬液，然后30℃、150rpm振荡培养104h。0-8h每隔2h取样一次，9-32h每隔12h取样一次，33-104h每隔24h取样一次；每次取样5mL；每次取样后在培养体系中加入20mM的丙烯腈。
4、制作细菌生长曲线
从步骤3的取样样本中取3mL，测OD600nm值，根据步骤二的标准曲线，计算振荡培养的各个时间点每升培养体系中的生物量(生物量以细胞干重计)。
结果见图3。在培养期间，细菌的生物量先升高后降低。培养4h时达到了最大值。培养4h以后，随着培养时间的延长，菌体生物量呈现降低的趋势(原因应该在于：随着丙烯腈产物丙烯酸的逐渐积累，对细菌的危害毒力也越来越大，细菌的死亡率逐渐大于生长率)。
5、检测丙烯腈的降解率
从步骤3的取样样本中取1mL，8000rpm离心2min，取上清液，向上清液中加入0.1mL2M盐酸水溶液终止反应，然后取200μL，加入800μL乙酸乙酯并混匀，然后静置30min，收集乙酸乙酯相。
采用气相色谱法检测乙酸乙酯相中的丙烯酸含量。气相色谱法相关参数：色谱柱为极性HP-FFAP毛细管柱(30m×320μm×0.25μm)，进样口温度为260℃，柱箱温度为190℃，FID检测器温度为260℃，氢气流速为40mL/min，空气流速为450mL/min，氮气尾吹气流速为40mL/min，进样量为0.2μL，分流比为50:1。
采用乙酸乙酯作为溶剂，配制各个浓度的丙烯酸标准品溶液。采用气相色谱法(参数同上)检测丙烯酸标准品溶液。制作峰面积与丙烯酸浓度的标准曲线。Y＝2.9507X+6.9485，相关系数R2＝99.17％；Y代表峰面积，X代表丙烯酸浓度(单位为mmol/L)。
将乙酸乙酯标准品、丙烯腈标准品和丙烯酸标准品按照以上参数进行气相色谱法检测，色谱图见图4。乙酸乙酯的出峰时间为1.387min、丙烯腈的出峰时间为2.187min、丙烯酸的出峰时间为4.522min。
根据标准曲线和峰面积计算丙烯酸的产量，进一步计算振荡培养的各个时间点丙烯腈的降解率，结果见图5。培养时间为0-32小时，丙烯腈的降解率逐步提高。培养时间为32-104小时，丙烯腈的降解率基本不变，维持在79.4％左右。经计算，在前2个小时内丙烯酸的生产效率为：约167mg每小时每克干细胞；在前4个小时内丙烯酸的生产效率为：约233mg每小时每克干细胞；在前6个小时内丙烯酸的生产效率为：约281mg每小时每克干细胞。在前8个小时内丙烯酸的生产效率为：约323mg每小时每克干细胞。
实施例3、辛芳芳菌DLY26对其他腈化物的降解作用
腈化物降解培养基：将实施例2中丙烯腈替换为：3-氰基吡啶、4-氯丁腈、己二腈、正戊腈、二甲基戊二腈和苯乙腈(各20mM)。培养条件为：在转速为150rpm的摇床中于30℃培养2-8h。
采用苯酚-次氯酸钠法测定对不同腈化物的降解率：取样1mL进行显色反应；取10mL离心管，依次加入取样液1mL、苯酚钠溶液2mL、亚硝基铁氰化钠溶液3mL、次氯酸钠溶液3mL，然后用水补足至10mL，37℃反应15min，然后测定OD630nm值。每隔2h取样一次。
辛芳芳菌DLY26对3-氰基吡啶和4-氯丁腈降解率为30％左右，对己二腈、正戊腈、二甲基戊二腈和苯乙腈的降解率分别为1.2％、0.9％、0。这说明细菌DLY26T对某些脂肪族腈类具有良好的降解效果，对芳香腈类和酰基乙腈类的降解效果较差。

Claims (3)

1.一株腈化物降解和丙烯酸生产菌辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)DLY26，其特征在于：该菌已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072；其保藏编号为CCTCC No：M 2019001。
2.权利要求1所述的辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)DLY26在腈化物降解中的应用，其特征在于：
腈化物降解用基础培养基配制方法、降解底物和培养条件分别为：
(1)腈化物降解用基础培养基的配制方法为：将磷酸氢二钠2.0g、磷酸二氢钾1.0g、酵母粉0.5g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.03g，溶于800mLNa2HPO4/NaH2PO4缓冲液，然后加入甘油3.25mL并混匀，然后用Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液定容至1L；
(2)降解底物为：丙烯腈、4-氯丁腈、己二腈、二甲基戊二腈、正戊腈和3-氰基吡啶中的任意一种，所述底物的加入量为20mM；
(3)培养条件：在转速为150rpm的摇床中于30℃培养2-8h。
3.权利要求1所述的辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)DLY26生产丙烯酸的方法，其特征在于：
(1)制备菌悬液：按10％接种量接种辛芳芳菌DLY26的种子液至含10mM丙烯腈的权利要求2中所述腈化物降解用基础培养基，振荡培养48h，收集菌体沉淀并制备菌悬液；
(2)利用丙烯腈生产丙烯酸：取含20mM丙烯腈的权利要求2中所述腈化物降解用基础培养基，加入菌悬液，30℃、150rpm振荡培养104h，0-8h每隔2h取样一次，9-32h每隔12h取样一次，33-104h每隔24h取样一次，每次取样5mL，每次取样后在原培养体系中加入20mM丙烯腈。
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