EA008600B1

EA008600B1 - Микроорганизмы rhodococcus sp., способные превращать ацетонитрил в амид, полученный из этих микроорганизмов фермент с нитрилгидратазной активностью и способ их применения

Info

Publication number: EA008600B1
Application number: EA200300749A
Authority: EA
Inventors: Карен Трейси Робинс; Тору Нагасава
Original assignee: Лонца Аг
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2002-01-08
Publication date: 2007-06-29
Also published as: EA200300749A1; MXPA03006149A; IL155996A0; KR20040012707A; KR100880143B1; KR100903756B1; MX268424B; EP1352050A1; CN1486363A; JP2004516849A; PL208060B1; HU229283B1; EP1352050B1; US20040142447A1; CN1316010C; US20070148743A1; IL155996A; ATE417919T1; PT1352050E; SK288061B6

Abstract

В изобретении описаны новые микроорганизмы, которые способны оставаться толерантными к ацетонитрилу при его присутствии по меньшей мере в трехмолярной концентрации, а также новый способ получения амидов общей формулы (III)в которой Rобозначает Салкильный остаток, Салкенильную группу или группу общей формулы (IV)в которой X обозначает атом азота или группу -СН=, a Rи Rнезависимо друг от друга обозначают атом водорода, атом галогена, Салкильную группу или Салкенильную группу, из соответствующих нитрилов с помощью таких микроорганизмов. В изобретении описано также применение этих микроорганизмов для уничтожения или утилизации отходов ацетонитрила.

Description

Настоящее изобретение относится к микроорганизмам, которые способны оставаться толерантными к ацетонитрилу при его присутствии по меньшей мере в 3-молярных концентрациях, к ферменту с нитрилгидратазной активностью, к способу получения амидов с применением таких микроорганизмов, соответственно фермента, а также к применению этих микроорганизмов для уничтожения (утилизации) отходов ацетонитрила.

В настоящее время известно уже достаточно большое число биотехнологических методов получения амидов, таких, например, как амид никотиновой кислоты, который представляет собой незаменимый для животных и человека витамин из семейства витаминов В.

Так, например, в ЕР-А 0307926 описан способ превращения 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты с помощью микроорганизмов КЕобососсик йюбосйтоик Л. Недостаток этого способа состоит в том, что микроорганизмы КЕобососсик гйобосйтоик Л имеют красный цвет, и поэтому конечный продукт также приобретает соответствующую окраску. Помимо этого такой микроорганизм характеризуется высоким К_т-значением (константа Михаэлиса) для используемого в качестве субстрата 3-цианпиридина, а также обладает низкой толерантностью к температуре и низкой толерантностью к 3-цианпиридину.

Помимо этого в заявке \¥О 99/05306 описан способ получения амида никотиновой кислоты, исходя из соответствующего нитрила с помощью микроорганизмов родов КЕобососсик, Лтусо1а1ор818 и Лсйиотабига. Недостаток этого известного способа состоит в том, что используемые при его осуществлении микроорганизмы рода Лтусо1а1ор818 инактивируются при повышенных температурах. Эти микроорганизмы обладают, кроме того, низкой толерантностью к 3-цианпиридину и амиду никотиновой кислоты. Микроорганизмы рода Кбюбососсик характеризуются высоким К_т-значением для 3-цианпиридина и малой теплостойкостью. Поэтому реализация описанного в указанной заявке способа в промышленном масштабе представляется экономически нецелесообразной.

В основу настоящего изобретения была положена задача предложить микроорганизмы, которые были бы более устойчивыми, характеризовались бы более низким К_т-значением для такого субстрата, как, например, 3-цианпиридин, и в соответствии с этим обеспечивали бы рентабельное получение амидов способом, при осуществлении которого соответствующий амид можно было бы выделять с исключительно высоким выходом и с высокой степенью чистоты.

Указанная задача решается с помощью микроорганизмов согласно п.1 формулы изобретения, с помощью фермента согласно п.5 или 7 и с помощью способа согласно п.8.

Предлагаемые в изобретении микроорганизмы получают путем соответствующего отбора, например, из образцов почвы, из ила (шлама) или сточных вод с помощью традиционных микробиологических методов. Подобный отбор микроорганизмов целесообразно проводить путем их выращивания или культивирования в присутствии пиридинальдоксима общей формулы

или нитрилов в качестве источника углерода и в присутствии ионов кобальта и, например, дрожжевого экстракта и/или аммониевых солей. Затем из полученных культур отбирают те микроорганизмы, которые способны оставаться толерантными к ацетонитрилу при его присутствии по меньшей мере в 3-молярной концентрации и которые способны превращать нитрилы, такие, например, как 3-цианпиридин и ацетонитрил, в соответствующий амид.

В качестве пиридинальдоксимов можно использовать пиридин-2-, пиридин-3- или пиридин-4альдоксим.

Для отбора соответствующих микроорганизмов могут использоваться также прежде всего те нитрилы, которые при последующей биотрансформации должны использоваться в качестве субстрата, например ацетонитрил (нитрил уксусной кислоты), пропионитрил, бутиронитрил, нитрил кротоновой кислоты, нитрил адипиновой кислоты и нитрил малоновой кислоты.

В качестве источника ионов кобальта предпочтительно использовать так называемые генерирующие ионы кобальта кобальтовые соединения, например Со²⁺- или Со³⁺-соли, такие как хлориды кобальта, сульфаты кобальта и ацетаты кобальта. Предпочтительно в качестве кобальтового соединения использовать Со²⁺-соль, такую, например, как СоС1₂. Вместе с тем микроорганизмы можно культивировать и совместно с металлическим кобальтом или иными его соединениями. Обычно кобальт или его соединения добавляют в среду для выращивания в количестве от 1 до 30 мг/л, предпочтительно от 1 до 20 мг/л.

В качестве аммониевых солей можно использовать, например, фосфаты аммония, такие как (ΝΗ₄)₂ΗΡΟ₄ или (ΝΗ₄)₂ΡΟ₄.

Микроорганизмы перед использованием их собственно в процессе биотрансформации культивируют в соответствующих средах. Составы пригодных для этой цели культуральных сред приведены, например, ниже в настоящем описании в табл. 3 или 5.

Обычно микроорганизмы выращивают при температуре от 20 до 40°С и при значении рН от 5 до 8, предпочтительно при температуре от 25 до 35°С и значении рН от 6 до 7,5.

В процессе выращивания микроорганизмов целесообразно индуцировать активные ферменты, т.е.

- 1 008600 нитрилгидратазы, добавлением соответствующего индуктора ферментов.

В качестве таких индукторов ферментов могут использоваться насыщенные или ненасыщенные алифатические нитрилы или соответствующие амиды. В качестве алифатических нитрилов можно применять все Сг^алканнитрилы, такие, например, как бутиронитрил, изобутиронитрил, нитрил валериановой кислоты либо нитрил изовалериановой кислоты, или С_3--алкеннитрилы. такие, например, как метакрилнитрил или нитрил кротоновой кислоты. В качестве алифатических амидов можно применять все Сг^алканамиды, такие, например, как бутирамид, изобутирамид, амид валериановой кислоты или амид пропионовой кислоты, или С_3-7алкенамиды, такие, например, как метакриламид или амид кротоновой кислоты. Предпочтительными индукторами ферментов являются метакриламид, бутирамид, изобутирамид, амид валериановой кислоты, метакрилнитрил, амид кротоновой кислоты, бутиронитрил и изобутиронитрил. Наиболее предпочтительно использовать в качестве индуктора ферментов метакрилнитрил.

Как уже указывалось выше, предлагаемые в изобретении микроорганизмы остаются толерантными к ацетонитрилу при его присутствии по меньшей мере в 3-молярной концентрации. Подобная способность сохранять толерантность к ацетонитрилу проявляется в том, что ферментативная активность остается стабильной после 1-часовой инкубации с 3-молярным ацетонитрилом в 0,1-молярном калийфосфатном буфере при рН, равном 7,0, и температуре 20°С, т.е. снижается максимум на 10%. Предпочтительные микроорганизмы в течение 1 ч остаются в описанных выше условиях толерантными к ацетонитрилу при его присутствии по меньшей мере в 6-молярной концентрации при уменьшении ферментативной активности максимум на 50%. Наиболее предпочтительные микроорганизмы в течение 1 ч остаются в описанных выше условиях толерантными к ацетонитрилу при его присутствии по меньшей мере в 9молярной концентрации при уменьшении ферментативной активности максимум на 70%.

У особо предпочтительных микроорганизмов их ферментативная активность остается стабильной даже после инкубации в течение нескольких минут с 15- и 19-молярным ацетонитрилом (соответственно с чистым ацетонитрилом). Так, в частности, снижение ферментативной активности при инкубации с 15молярным ацетонитрилом составляет по истечении 10 мин менее 10%.

Предлагаемые в изобретении микроорганизмы обладают высокой термостабильностью, т. е. повышенной стабильностью при высоких температурах по сравнению с известными до настоящего времени микроорганизмами. Снижение ферментативной активности предлагаемых в изобретении микроорганизмов после 1-часовой инкубации в 0,1-молярном калийфосфатном буфере с рН 7,0 при 60°С предпочтительно составляет максимум 10%, а снижение ферментативной активности после 2-часовой инкубации в указанных выше условиях составляет максимум 40%.

Под ферментативной активностью в контексте настоящего изобретения подразумевается нитрилгидратазная активность, прежде всего нитрилгидратазная активность в отношении 3-цианпиридина, служащего субстратом.

К числу других положительных свойств предлагаемых в изобретении микроорганизмов относятся высокая толерантность к 3-цианпиридину, который является предпочтительным для применения субстратом, и к образующемуся из него продукту, которым является амид никотиновой кислоты, а также низкое К_т-значение для 3-цианпиридина. Еще одним положительным свойством предлагаемых в изобретении микроорганизмов, которое следует отметить особо, является их способность аккумулировать ацетамид в более высокой концентрации по сравнению с концентрацией, соответствующей насыщенному при 30°С раствору ацетамида (примерно 220-230 г ацетамида в 100 мл воды).

Предпочтительные микроорганизмы относятся к роду ККобососсик. К наиболее предпочтительным микроорганизмам относятся штаммы Кйобососсик §р. ΕΖ4 и их функционально эквивалентные варианты и мутанты. Под функционально эквивалентными вариантами и мутантами при этом имеются в виду таковые, которые остаются толерантными к ацетонитрилу при его присутствии по меньшей мере в 3молярных концентрациях. Особо предпочтительны непигментированные штаммы Кйобососсик, т.е. штаммы, не имеющие красной окраски, которая может привести к соответствующему изменению цвета целевого продукта. При необходимости подобные штаммы можно достаточно легко получить из пигментообразующих микроорганизмов в результате мутагенеза, инициируемого воздействием УФ-излучения или химических мутагенов.

В соответствии с Будапештским договором штамм ККобососсик §р. ΕΖ4 был депонирован 11 июля 2000 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Эеи15с11е 8атт1ипд уоп Мткгоогдапктеп ипб ΖсIIки1(и^сη ОтЬН (Ό8ΜΖ)), Максйегобег \Усд 1Ь, Ό-38124 Вгаип8сй^е1д, под регистрационным номером Ό8Μ 13597. Этот микроорганизм на основе его идентификационных данных не удалось отнести ни к одному известному до настоящего времени виду ККобососсик, и поэтому он был выделен в новый вид.

Функционально эквивалентные варианты и мутанты штамма Кйобососсик §р. ΕΖ4 могут возникать в результате спонтанного мутагенеза либо их можно создавать искусственно воздействием УФ-излучения или химических мутагенов. Предпочтительные варианты и мутанты штамма ККобососсик §р. ΕΖ4 являются непигментированными, т.е. не имеют собственной красной окраски, которая может привести к соответствующему изменению цвета целевого продукта.

Ферментативный экстракт можно получать, например, путем лизиса микроорганизмов, в частности

- 2 008600 с помощью ультразвука, устройства типа френч-пресс либо метода, основанного на использовании лизоцима.

Предлагаемые в изобретении ферменты с нитрилгидратазной активностью получают из описанных выше микроорганизмов. Предпочтительно при этом получать их из микроорганизмов рода Кйобососсик, прежде всего из микроорганизмов Кйобососсик кр. ΕΖ4 (Ό8Μ 13597).

Такие ферменты обладают, в частности, следующими свойствами:

а) их К_т-значение для являющегося субстратом ацетонитрила составляет 2,84±1,00 мМ, а для являющегося субстратом 3-цианпиридина - 80,5±15,0 мМ, в каждом случае в 0,05-молярном калийфосфатном буфере с рН 7,0 при 20°С;

б) оптимальное для них значение рН составляет 6,5±1,0 при 20°С в 0,05-молярном калийфосфатном буфере.

Такие ферменты прежде всего имеют

в) естественную молекулярную массу, составляющую по данным ЖХВР-анализа 465±50 кДа.

Собственно процесс биотрансформации можно проводить с использованием описанных выше микроорганизмов, полученного из этих микроорганизмов ферментативного экстракта или выделенного фермента. Предпочтительно проводить биотрансформацию с использованием микроорганизмов Кйобососсик кр. ΤΖ4.

В качестве субстратов для биотрансформации могут использоваться нитрилы общей формулы К’-СЫ II.

В этой общей формуле II заместитель К¹ представляет собой С1_-6алкильную группу, С_2-6алкенильную группу или группу общей формулы IV

В такой общей формуле IV X обозначает атом азота или группу -СН=, а заместители К² и К³ независимо друг от друга обозначают атом водорода, атом галогена, С1_-6алкильную группу или С2-6алкенильную группу.

В качестве С1-6алкильной группы может использоваться метил, этил, пропил, изопропил, бутил, трет-бутил, изобутил, пентил и его изомеры, а также гексил и его изомеры. В качестве С2-6алкенильной группы может использоваться, например, винил, аллил, 1-пропен-1-ил или 1-пропен-2-ил.

В качестве атома галогена может использоваться атом Т, С1, Вг или I.

Предпочтительными представителями нитрилов общей формулы II являются ацетонитрил, бутиронитрил, акрилонитрил, пропионитрил, нитрил кротоновой кислоты, 2-цианпиридин, 3-цианпиридин, 4цианпиридин, бензонитрил, фторбензонитрил, хлорбензонитрил и бромбензонитрил. Предпочтительными в большинстве случаев субстратами являются ацетонитрил и 3-цианпиридин.

Процесс биотрансформации предпочтительно проводить при однократном или непрерывном добавлении субстрата. Концентрация используемого субстрата зависит от его растворимости, что хорошо известно специалистам в данной области техники.

Процесс биотрансформации предпочтительно далее проводить с использованием покоящихся (не растущих) клеток.

В качестве сред в процессе биотрансформации могут использоваться обычно применяемые в этих целях среды, например низкомолярный фосфатный буфер, ΗΕΡΕδ-буфер (НЕРЕ8 = Ν-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота), цитратный буфер и боратный буфер. Под низкомолярным фосфатным буфером имеется в виду предпочтительно 0,01-0,5-молярный фосфатный буфер, наиболее предпочтительно 0,05-0,25-молярный фосфатный буфер.

Процесс биотрансформации предпочтительно проводить при температуре от 5 до 50°С, наиболее предпочтительно при температуре от 20 до 40°С. Предпочтительное значение рН составляет от 5 до 10, наиболее предпочтительно от 6 до 7,5.

По завершении процесса превращения нитрила общей формулы II соответствующие образовавшиеся из него амиды общей формулы

К’-СОЫН₂ III, в которой К¹ имеет указанные выше значения, можно выделять, при необходимости после отделения клеток, переработкой по обычным методам, таким, например, как кристаллизация или распылительная сушка.

Еще одним объектом настоящего изобретения является применение вышеописанных микроорганизмов, прежде всего рода Кйобососсик, для уничтожения отработанного ацетонитрила.

Ацетонитрил представляет собой растворитель, который находит применение, например, в жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР), и поэтому после его использования и направления в отход подлежит утилизации. Максимальная концентрация ацетонитрила, который после его использования в тех или иных целях и направления в отход подлежит утилизации с применением предлагаемых в изобретении микроорганизмов, может достигать 19М, что соответствует чистому ацетонитрилу. Пред

- 3 008600 почтительно, однако, использовать раствор, соответственно суспензию ацетонитрила 0,25-15,0-молярной, более предпочтительно 1-10-молярной, концентрации.

Процесс утилизации отработанного ацетонитрила с применением предлагаемых в изобретении микроорганизмов предпочтительно проводить при температуре от 5 до 50°С, более предпочтительно при температуре от 20 до 40°С. В ходе этого процесса значение рН предпочтительно должно составлять от 5 до 10, более предпочтительно от 6 до 8.

Продолжительность переработки отработанного ацетонитрила, в ходе которой ацетонитрил превращается в ацетамид, зависит от концентрации утилизуемого ацетонитрила. Так, например, при получении раствора или суспензии ацетамида 9,5-молярной концентрации это превращение длится примерно 2 ч при значении рН, равном 7,0, и температуре около 20°С.

Идентификация штамма ΤΖ4 (Ό8Μ 13597)

A) Хемотаксономические признаки (маркеры).

1. Диагностическая аминокислота пептидогликана: мезодиаминопимелиновая кислота.

2. Миколовые кислоты: присутствуют миколовые кислоты с цепью длиной от С₄₀ до С₄₈.

3. Набор жирных кислот: присутствуют линейные, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, а также характерно высокое содержание туберкулостеариновой кислоты. На основе набора жирных кислот штамм ΤΖ4 был идентифицирован как относящийся к роду КБобососсик.

Б) Обычные признаки (маркеры).

Клетки штамма ΤΖ4 по их макроскопическому внешнему виду и морфологии были сходны с КБобососсик тБобосйтоик. Колонии штамма ΤΖ4 имеют розоватую окраску (КАЬ 3022), а в молодых культурах развивались ветвящиеся гифы, которые развивались в палочки и кокки.

Штамм ΤΖ4 на основе хемотаксономических и обычных признаков был идентифицирован как принадлежащий к виду КБобососсик гБобосБгоик, хотя и с малым коэффициентом корреляции.

B) Анализ первых 500 оснований 168 рДНК.

Сходство последовательности первых 500 оснований 168 рДНК с аналогичной последовательностью штамма КБобососсик гБобосБгоик Ό8Μ 43241, являющегося типичным представителем вида КБобососсик тБобосйтоик, составляет лишь 97,7%, а сходство с аналогичной последовательностью другого эталонного штамма КБобососсик гБобосБгоик составляет 99,1%. Поскольку сходство между последовательностями первых 500 оснований 168 рДНК штамма ΤΖ4 и штамма КБобососсик тБобосйтоик Ό8Μ 43241 составляло менее 99,5%, штамм ΤΖ4 не удалось идентифицировать как принадлежащий к виду КБобососсик тБобосйтоик. Поэтому штамм ΤΖ4 был выделен в новый вид в роде КБобососсик.

Чертежи

На прилагаемых к описанию чертежах показано на фиг. 1 - диаграмма, иллюстрирующая процесс биотрансформации ацетонитрила в ацетамид покоящимися клетками штамма КБобососсик кр. ΤΖ4, на фиг. 2 - диаграмма, отражающая влияние температуры на нитрилгидратазную активность штамма КБобососсик кр. ΤΖ4 в покоящихся клетках и позволяющая определить оптимальное значение температуры, на фиг. 3 - диаграмма, отражающая термостабильность нитрилгидратазной активности штамма КБобососсик кр. ΤΖ4 в покоящихся клетках, на фиг. 4 - диаграмма, отражающая влияние величины рН на нитрилгидратазную активность штамма КБобососсик кр. ΤΖ4 в покоящихся клетках и позволяющая определить оптимальное значение рН, на фиг. 5 - диаграмма, отражающая рН-стабильность нитрилгидратазной активности штамма КБобососсик кр. ΤΖ4 в покоящихся клетках, на фиг. 6 - диаграмма, отражающая толерантность нитрилгидратазной активности штамма КБобососсик кр. ΤΖ4 в покоящихся клетках к 3-цианпиридину, на фиг. 7 - диаграмма, отражающая толерантность нитрилгидратазной активности штамма КБобососсик кр. ΤΖ4 в покоящихся клетках к амиду никотиновой кислоты, на фиг. 8 - диаграмма, отражающая влияние концентрации ацетонитрила на нитрилгидратазную активность штамма КБобососсик кр. ΤΖ4 в покоящихся клетках в процессе биотрансформации ацетонитрила в ацетамид, на фиг. 9 - диаграмма, отражающая влияние концентрации ацетонитрила на нитрилгидратазную активность штамма КБобососсик кр. ΤΖ4 в покоящихся клетках, на фиг. 10 - диаграмма, отражающая зависимость нитрилгидратазной активности штамма КБобососсик кр. ΤΖ4 в покоящихся клетках от концентрации 3-цианпиридина, на фиг. 11 - диаграмма, отражающая взаимосвязь между отложенными на логарифмической шкале молекулярными массами нитрилгидратазы и эталонных белков и соответствующим временем удерживания при ЖХВР, на фиг. 12 - диаграмма, отражающая взаимосвязь между отложенными на логарифмической шкале молекулярными массами субъединиц нитрилгидратазы и эталонных белков и соответствующим КТзначением при электрофорезе в ПААГ-ДСН, на фиг. 13 - график, отражающий зависимость активности очищенной нитрилгидратазы из штамма

- 4 008600

Кйобососси8 8р. ΡΖ4 от концентрации 3-цианпиридина, на фиг. 14 - график, отражающий зависимость активности очищенной нитрилгидратазы из штамма Кйойососси8 8р. ΡΖ4 от концентрации ацетонитрила, на фиг. 15 - график, отражающий термостабильность очищенной нитрилгидратазы из штамма Кйобососси8 8р. ΡΖ4, на фиг. 16 - диаграмма, на которой представлено оптимальное значение рН для очищенной нитрилгидратазы из штамма Кйобососси8 8р. ΡΖ4, и на фиг. 17 - диаграмма, на которой представлена рН-стабильность очищенной нитрилгидратазы из штамма Кйобососси8 8р. ΡΖ4.

Пример 1. Определение нитрилгидратазной активности.

Для определения нитрилгидратазной активности реакционную смесь, содержащую 3-цианпиридин (1,0М; 1,0 мл), калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 0,5 мл) и суспензию клеток (0,5 мл), инкубировали при перемешивании и при 20°С в течение 5 мин. Реакцию прекращали добавлением НС1 (5М; 0,1 мл). После фильтрации реакционной смеси (через фильтр с размером пор 0,2 мкм) количество образовавшегося амида никотиновой кислоты определяли с помощью ЖХВР (колонка \Уа1сг8 8р11еп8огЬ 5 μ ΘΌ82 (4,6x150 мм); КН₂РО₄/Н₃РО₄ (10 мМ; рН 2,8)/ацетонитрил в соотношении 9:1 (об./об.); 1 мл/мин; 230 нм). Общую активность выражали как количество образовавшегося амида никотиновой кислоты в мкмолях/(минхмл), а удельную активность выражали как количество образовавшегося амида никотиновой кислоты в мкмолях/(минхмлхОП₆1_0нм).

Пример 2. Выделение штамма Кйобососси8 8р. ΡΖ4 (Ό8Μ 13597).

Как описано в Агсй. МюгоЫо1. 170 (1998), сс. 85-90, штамм Кйобососси8 8р. ΥΗ3-3 (ТРИ 3453) метаболизирует 3-пиридинальдоксим через 3-цианпиридин и амид никотиновой кислоты до никотиновой кислоты. В этом случае альдоксимдегидратазную активность, а также нитрилгидратазную и амидазную активность штамма Кйобососси8 8р. ΥΗ3-3 (ТРИ 3453) индуцировали различными альдоксимами и нитрилами.

Различные образцы почвы вносили в обогатительную среду, состав которой указан ниже в табл. 1, и инкубировали в течение 7-10 дней при 37°С. Полученные таким путем культуры пересевали в среду того же состава и инкубировали еще в течение 7-10 дней при 37°С. Эту процедуру повторяли трижды. Затем культуры разбавляли и высевали на чашки. После 5-дневной инкубации содержимого чашек при 37°С получали отдельные колонии. Эти отдельные колонии исследовали согласно примеру 1 на наличие нитрилгидратазной активности. Таким путем выделили штамм Кйобососси8 8р. ΡΖ4 (Ό8Μ 13597). Вместо 3пиридинальдоксима в качестве источника углерода можно также использовать такие нитрилы, как ацетонитрил, пропионитрил, бутиронитрил, нитрил кротоновой кислоты, нитрил адипиновой кислоты и нитрил малоновой кислоты.

Таблица 1 Состав обогатительной среды

Компоненты	Концентрация [г/л]
3 -пиридинальдоксим	3,0 или 1,0
(ΝΗ₄)₂ΗΡΟ₄	2,0
КН₂РО₄	2,0
ЫаС!	1,0
Μβ8Ο₄χ7Η₂0	0,2
СоС1₂х6Н₂О	0,01
дрожжевой экстракт	0,2

Объем среды добавлением воды доводят до 1 л (рН 7,0).

Пример 3. Влияние кофакторов на нитрилгидратазную активность штамма Кйойососси8 8р. ΡΖ4 в процессе выращивания.

Штамм Кйобососси8 8р. ΡΖ4 (Ό8Μ 13597) вносили в среду для выращивания предварительных культур, состав которой указан в табл. 2, и при встряхивании инкубировали в течение 1-2 дней при 28°С. Полученную предварительную культуру пересевали в базальную среду, состав которой указан в табл. 3 и которая содержала либо СоС1₂, либо Ре8О₄, и при встряхивании инкубировали в течение 2-3 дней при 28°С. Нитрилгидратазную активность определяли согласно примеру 1. Полученные результаты приведены в табл. 4. Нитрилгидратазная активность проявлялась только при культивировании штамма Кйобососси8 8р. ΡΖ4 в присутствии кобальта.

- 5 008600

Таблица 2 Состав среды для выращивания предварительных культур

Компоненты	Концентрация [г/л]
пептон	5,0
мясной экстракт	5,0
ИаС1	2,0
дрожжевой экстракт	0,5

Таблица 3

Состав базальной среды

Компоненты	Концентрация [г/л]
дрожжевой экстракт	2,0
пептон	0,2
Ь-глутамат, натриевая соль	15,0
М88О₄х7Н₂О	0,5
СоС1₂х6Н₂О (или Ре8О₄х7Н₂О)	0,004
амид кротоновой кислоты	5,0

Объем среды добавлением воды доводят до 1 л (рН 6,8).

Таблица 4

Влияние кофакторов на нитрилгидратазную активность штамма в процессе выращивания

Кофактор	Рост [ОПыонм]	Общая активность [мкмоль/(минхмл)	Удельная активность [мкмоль/(миихмлхОПыонм)]
Ре8О₄	2,86	0,989	0,346
СоС1₂	2,79	38,1	13,1

Пример 4. Влияние индукторов на нитрилгидратазную активность штамма КРюбососсик кр. ΡΖ4 в процессе выращивания.

Штамм РНобососсик кр. ΡΖ4 (Ό8Μ 13597) вносили в среду для выращивания предварительных культур, состав которой указан в табл. 2, и при встряхивании инкубировали в течение 1-2 дней при 28°С. Полученную предварительную культуру пересевали в культуральную среду, состав которой указан в табл. 5 и которая содержала различные индукторы, и при встряхивании инкубировали в течение 3 дней при 28°С. Нитрилгидратазную активность определяли согласно примеру 1. Полученные результаты приведены в табл. 5. Экспрессия нитрилгидратазы штамма Вйобососсик кр. ΡΖ4 происходила в процессе выращивания только в присутствии одного индуктора.

Таблица 5 Состав культуральной среды

Компоненты	Концентрация [г/л]
дрожжевой экстракт	1,0
цитрат натрия	10,0
солодовый экстракт	15,0
индуктор	0,2% (мас./об.)
КН₂РО₄	2,0
М₅8О₄х7Н₂О	0,5
СоС1₂х6Н₂О	0,015

- 6 008600

Таблица 6

Влияние индукторов на нитрилгидратазную активность

Индуктор	Рост [ОПбЮим]	Общая активность [мкмоль/(минхмл)	Удельная активность [мкмоль/(минхмлхОПбю_нм)]
метакриламид	4,55	569	125
изобутир амид	3,55	387	109
бутирамид	4,7	344	73,2
метакрилнитрил	4,61	330	71,5
амид кротоновой кислоты	9,32	558	59,9
бутиронитрил	5,26	307	58,4
амид валериановой кислоты	5,61	322	57,5
изобутиронитрил	5,24	273	52,1
нитрил кротоновой кислоты	8,24	407	49,4
амид пропионовой кислоты	5,17	149	28,7
валеронитрил	3,70	120	32,4
нитрил изокапроновой кислоты	4,72	134	28,5
изовалеронитрил	3,22	74,7	23,2
нитрил капроновой кислоты	4,54	104	23,0
пропионитрил	4,72	95,8	20,3
акрилоамид	5,17	60,5	11,7
3-пентеннитрил	4,62	62	13,4
Индуктор	Рост [ОПбЮим]	Общая активность [мкмоль/(минхмл)	Удельная активность [мкмоль/(минхмлхОПйю_им)]
ε-капролактам	4,44	40,3	9,08
бензонитрил	5,62	40,3	7,17
амид пиколиновой кислоты	3,80	26,1	6,87
-	4,2	27,7	6,59
цианацетамид	4,75	30,9	6,50
ацетамид	4,37	21,6	4,98
ацетонитрил	4,46	18,4	4,13
3 -цианпиридин	5,54	12,3	2,21
амид изоникотиновой кислоты	5,03	10,9	2,17
бензамид	3,88	8,24	2,12
акрилонитрил	3,27	5,91	1,81
амид никотиновой кислоты	3,55	4,94	1,39
мочевина	6,16	5,66	0,918

Пример 5. Выращивание штамма КРоБососсик кр. ΡΖ4.

Штамм ВНоБососсик кр. ΡΖ4 вносили в среду для выращивания предварительных культур, состав которой указан в табл. 2, и при встряхивании инкубировали в течение 1-2 дней при 28°С. Полученную предварительную культуру пересевали в культуральную среду, состав которой указан в табл. 5 и которая содержала в качестве индуктора метакриламид в концентрации 6 г/л, и при встряхивании инкубировали в течение 3 дней при 28°С. Через 48 ч дополнительно добавляли метакриламид (0,2% (об./об.)).

В описанных ниже примерах 6-13 использовали покоящиеся клетки штамма КРоБососсик кр. ΡΖ4.

Пример 6. Субстратная специфичность нитрилгидратазной активности штамма КРоБососсик кр. ΡΖ4.

Нитрилгидратазную активность штамма КРоБососсик кр. ΡΖ4 при использовании различных субстратов определяли согласно примеру 1, применяя вместо 3-цианпиридина соответствующий субстрат и соответственно изменяя условия проведения ЖХВР в зависимости от используемого субстрата. Данные о субстратной специфичности нитрилгидратазной активности штамма КРоБососсик кр. ΡΖ4 в сравнении с субстратной специфичностью нитрилгидратазной активности штамма КРоБососсик йюБосРгоик П приведены в табл. 7.

- 7 008600

Таблица 7

Сравнение субстратной специфичности нитрилгидратазной активности штамма Вйобососсиа ар. ΡΖ4 и штамма ВЬобососсиа тЬобосйтоиа Л

Субстрат	Относительная активность Г%1
Кко^ососсиз зр. ΡΖ4	НкоАососсиз гкоАоскгоиз Л
ацетонитрил	646	0 (нитрилгидратаза А) 115 (нитрилгидратаза В)
акрилонитрил	498	478
бутиронитрил	466	26
пропионитрил	412	435
3-цианпиридин	100	100
4-цианпиридин	98,4	70
нитрил кротоновой кислоты	92,1	78
бензонитрил	41,7	27
2-цианпиридин	39,3	45
.ч-хлорбензонитрил	39,3	43
и-хлорбензонитрил	8,25	13
метакрилнитрил	3,64	87
о-хлорбензонитрил	0	2,8

Пример 7. Оптимальная температура для нитрилгидратазной активности штамма Вйобососсиа ар. ΡΖ4 и ее термостабильность.

Нитрилгидратазную активность определяли согласно примеру 1 при различных температурах в интервале от 20 до 70°С. Оптимальное значение температуры для нитрилгидратазной активности приходилось на 60°С (фиг. 2).

Для определения термостабильности нитрилгидратазной активности суспензию клеток инкубировали в течение 15 мин при различных температурах в интервале от 40 до 70°С. После этого нитрилгидратазную активность определяли согласно примеру 1 при 20°С. После 15-минутной инкубации при температурах в интервале от 40 до 60°С нитрилгидратазная активность соответствовала исходному уровню (фиг. 3).

Пример 8. Оптимальное значение рН для нитрилгидратазной активности штамма Вйобососсиа ар. ΡΖ4 и ее рН-стабильность.

Нитрилгидратазную активность определяли согласно примеру 1 при различных значениях рН в интервале от 3 до 12 с использованием различных буферов (0,1-молярных). Оптимальные значения рН для нитрилгидратазной активности приходились на интервал значений от 6 до 7 (фиг. 4).

Для определения рН-стабильности нитрилгидратазной активности суспензию клеток инкубировали при 20°С в течение 24 ч при различных значениях рН в интервале от 4 до 10. После этого суспензию клеток центрифугировали. Отделенные клетки промывали и ресуспендировали в калийфосфатном буфере (0,1М, рН 7,0). Нитрилгидратазную активность определяли согласно примеру 1. После 24-часовой инкубации при различных значениях рН в интервале от 5 до 10 нитрилгидратазная активность примерно соответствовала исходному уровню (фиг. 5).

Пример 9. Влияние концентрации 3-цианпиридина на нитрилгидратазную активность штамма Вйобососсиа ар. ΡΖ4.

Суспензию клеток инкубировали в течение 60 мин при 20°С в присутствии различных концентраций 3-цианпиридина в интервале от 0 до 10% (мас./об.). Затем клетки отделяли, промывали и ресуспендировали в калийфосфатном буфере (0,1М, рН 7,0). Нитрилгидратазную активность определяли согласно примеру 1. После 60-минутной инкубации в присутствии различных концентраций 3-цианпиридина в интервале от 0 до 20% (мас./об.) нитрилгидратазная активность примерно соответствовала исходному уровню (фиг. 6).

Пример 10. Влияние концентрации амида никотиновой кислоты на нитрилгидратазную активность штамма Вйобососсиа ар. ΡΖ4.

Суспензию клеток инкубировали в течение 24 ч при 20°С в присутствии различных концентраций амида никотиновой кислоты в интервале от 0 до 20% (мас./об.). Затем клетки отделяли, промывали и ресуспендировали в 0,1-молярном калийфосфатном буфере (0,1М, рН 7,0). Нитрилгидратазную активность определяли согласно примеру 1. После 24-часовой инкубации в присутствии различных концентраций амида никотиновой кислоты в интервале от 0 до 20% (мас./об.) нитрилгидратазная активность примерно соответствовала исходному уровню (фиг. 7).

Пример 11. Определение К_т-значения для 3-цианпиридина у нитрилгидратазы штамма Вйобососсиа ар. ΡΖ4.

Реакционную смесь, содержащую 3-цианпиридин (0,1-1,0М; 1,0-1,8 мл), водный раствор №1С1 (0,85%-ный (мас./об.); 0,7-0,1 мл), калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 0,3 мл) и суспензию клеток (0,01 мл), при встряхивании инкубировали в течение 10 мин при 30°С. Общий объем реакционной смеси составлял в зависимости от концентрации 3-цианпиридина от 2,0 до 2,2 мл. Реакцию прекращали добавлением НС1 (2М; 0,1 мл). После центрифугирования реакционной смеси (при 12000 об./мин в течение 5

- 8 008600 мин) количество образовавшегося амида никотиновой кислоты определяли с помощью ЖХВР согласно примеру 1. Определенное таким путем К_т-значение составляло 160мМ (фиг. 10).

Пример 12. Сравнение уровней нитрилгидратазной активности штамма КБобобоссик кр. ΡΖ4 с уровнями нитрилгидратазной активности известных микроорганизмов Атусо1а1орк1к кр. ΝΑ40, КБобососсик §р. ОР270 и Ейобососсик гйобосйтоик П.

К_т-значения для служащего субстратом 3-цианпиридина у нитрилгидратазной активности штаммов КБобобососсик кр. ΡΖ4, КБобососсик кр. ОР270 (Ό8Μ 12211, XVО 99/05306), Атусо1а1орк1к кр. ΝΑ40 (Ό8Μ 11617, νθ 99/05306) и КБобососсик гйобосйтоик П определяли согласно примеру 11 с использованием соответствующего микроорганизма.

К_т-значения, полученные для штаммов Атусо1а1орк1к φ.ΝΑ40 и КБобососсик кр. ΡΖ4, меньше значений, полученных для других микроорганизмов (табл. 8).

Таблица 8

Сравнение К_т-значений для служащего субстратом 3-цианпиридина

	[мМ]
Кко<3ососсиз зр. ΡΖ4	Якодососсиз зр. ОР270	Атусо1а1орз1з зр. ΝΑ40	ЯкоАососсиз гкоАоскгоиз Л
160	>200	41,7	200

Термостабильность нитрилгидратазной активности штаммов КБобобососсик кр. ΡΖ4, КБобососсик кр. ОР270, Атусо1а1орк1к кр. ΝΑ40 и КБобососсик гйобосБтоик П определяли согласно примеру 7 с использованием соответствующего микроорганизма и указанных в табл. 9 условий инкубации. Нитрилгидратазная активность штамма КБобососсик кр. ΡΖ4 проявляла наивысшую термостабильность по сравнению с нитрилгидратазной активностью других микроорганизмов.

Таблица 9

Сравнение термостабильности нитрилгидратазной активности

Условия инкубации	Относительная активность [%]
КкоАососсиз зр. ΡΖ4	ЯкоАососсиз зр. ОР270	Атусо1а1орз1з зр. ΝΑ40	ЯкоАососсиз гкоАоскгоизЛ
15 мин при 50°С	100	100	а Н.О.	100
60°С	93	95	а Н.О.	80
70°С	2	5	н.о?	0
60 мин при 20°С	100	100	100	н.о/
30°С	100	100	95	н.о/
40°С	100	100	80	н.о/
50°С	100	100	32	н.о?
60°С	100	89	0	а Н.О.
70’С	6	0	0	а Н.О.
60°С в течение 0 мин	100	100	а Н.О.	а Н.О.
30 мин	100	67-80	н.о/	н.о/
60 мин	92-100	52-68	н.о?	н.о/
120 мин	72-87	29-47	н.о/	н.о/

Примечание:

^а не определяли.

Влияние концентрации 3-цианпиридина на нитрилгидратазную активность штаммов КБобобососсик кр. ΡΖ4, КБобососсик кр. ОР270, Атусо1а1орк1к кр. ΝΑ40 и КБобососсик гБобосБгоик П определяли согласно примеру 9 с использованием соответствующего микроорганизма и указанных в табл. 10 концентраций 3-цианпиридина. Нитрилгидратазная активность штаммов КБобососсик кр. ΡΖ4 и КБобососсик кр. ОР270 проявляла наивысшую толерантность к 3-цианпиридину.

- 9 008600

и.о.

Таблица 10

Сравнение влияния различных концентраций 3-цианпиридина на нитрилгидратазную активность 3-цианпиридин [% (мас./об.)]

2.5 56“

7.5

10,0

Ккодососсиз зр. ΡΖ4 100^а100^я100^а100“ 100^а

Относительная активность [%]_____________

ИкоЛососсиз гкоЛоскгоиз Л

Ϊ00⁵ _Λ В

86® „ _Λ В

КкоАососсиз зр. СР270 100^а100^а100^я100^а100^а

Атусо1а!орз1з зр. ΝΑ40 Ϊ00® А 5б

1?

н.о.

Примечание:

^а инкубация в течение 60 мин, ^б инкубация в течение 15 мин, ^в не определяли.

Влияние концентрации амида никотиновой кислоты на нитрилгидратазную активность штаммов Кбобобососсиз §р. ΡΖ4, Кбобососсиз зр. СТ270, Ашусо1а!орз1з зр. ΝΑ40 и Кбобососсиз гбобосбтоиз Л определяли согласно примеру 9 с использованием соответствующего микроорганизма и указанных в табл. 11 концентраций амида никотиновой кислоты. Нитрилгидратазная активность штаммов Кбобососсиз зр. ΤΖ4 и Кбобососсиз зр. СТ270 проявляла наивысшую толерантность к амиду никотиновой кислоты (табл. 11).

Таблица 11

Сравнение влияния различных концентраций амида никотиновой кислоты на нитрилгидратазную активность

Амид никотиновой кислоты [% (мас./об.)]	Относительная активность [%]
Ккодососсиз зр. ΡΖ4	Ккос1ососсиз зр. ОР270	А тусо!а1орз1з зр. ΝΑ40	Кко^ососсиз гкоЛоскгоиз Л
0	100	100	100	а Н.О.
10	100	100	55	н.о.^а
20	100	100	0	и.о.^а
30	100	100	0	н.о.^а

Примечание:

^а не определяли.

Пример 13. Биотрансформация 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты штаммом Кбобососсиз зр. ΡΖ4.

Раствор 3-цианпиридина добавляли 42 порциями (42x0,52 г = 21,8 г; 0,21 моль) к предварительно приготовленной смеси, содержащей суспензию клеток (13,7 мг в пересчете на сухую массу клеток, 4 мл) и калийфосфатный буфер (0,1М, рН 6,0; 16 мл). Каждую следующую порцию 3-цианпиридина добавляли к реакционной смеси после количественного превращения в ней 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты. Реакционная смесь оставалась в ходе реакции густой, соответственно плотной. Общее количество образовавшегося амида никотиновой кислоты составило 25,7 г (количественный выход).

Пример 14. Биотрансформация ацетонитрила в ацетамид штаммом Кбобососсиз зр. ΡΖ4.

К реакционной смеси, содержащей калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 4,5 мл) и суспензию клеток (4,88 мг в пересчете на сухую массу клеток; 0,5 мл), в течение 80 мин при 20°С по каплям добавляли ацетонитрил (5 мл; 95 ммоль). Последующая реакция протекала при 20°С и при встряхивании. Образование ацетамида в ходе реакции отслеживали с помощью ЖХВР (колонка \Уа1сгз 8рбепзотр 5 μ ΟΌ82 (4,6x150 мм); КН₂РО₄ (10мМ; рН 2,5)/ацетонитрил в соотношении 99/1 (об./об.); 1,0 мл/мин; 210 нм). В течение 120 мин образовалось 6,14 г (количественный выход) ацетамида, который накапливался в реакционной среде (фиг. 1).

Пример 15. Влияние концентрации ацетонитрила на нитрилгидратазную активность штамма Кбобососсиз зр. ΡΖ4 в процессе биотрансформации ацетонитрила в ацетамид.

Реакционную смесь, содержащую ацетонитрил (0,2-19,0М; 1,0-1,6 мл), водный раствор Ναί,Ί (0,85%-ный (мас./об.); 0,6-0,0 мл), калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 0,3 мл) и суспензию клеток (0,1 мл), при встряхивании инкубировали в течение 10 мин при 20°С. Общий объем реакционной смеси составлял 2,0 мл. Реакцию прекращали добавлением МеОН. Затем реакционную смесь центрифугировали (при 12000 об./мин в течение 5 мин) и с помощью ЖХВР согласно примеру 14 определяли количество образовавшегося ацетамида.

При концентрации ацетонитрила в интервале от 0,1 до 15М нитрилгидратазная активность оставалась практически постоянной (фиг. 8).

Пример 16. Влияние концентрации ацетонитрила на нитрилгидратазную активность штамма

- 10 008600

Кйобососсиз зр. ΕΖ4.

Клетки в течение 1 ч инкубировали в присутствии ацетонитрила (0,0-15,0М) в калийфосфатном буфере (0,1М, рН 7,0) при 20°С. Затем суспензию клеток центрифугировали (при 12000 об./мин в течение 5 мин) и клетки ресуспендировали в водном растворе ЫаС1 (0,85%-ном (мас./об.)). Далее реакционную смесь, содержащую эту суспензию клеток (0,1 мл), 3-цианпиридин (0,5 М; 1,0 мл), водный раствор ЫаС1 (0,85%-ный (мас./об.); 0,6 мл) и калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 0,3 мл), при встряхивании инкубировали в течение 5 мин при 30°С. Реакцию прекращали добавлением МеОН. Реакционную смесь центрифугировали (при 12000 об./мин в течение 5 мин) и с помощью ЖХВР согласно примеру 14 определяли количество образовавшегося ацетамида.

После 1-часовой инкубации в присутствии ацетонитрила в интервале концентраций от 0 до 3М нитрилгидратазная активность оставалась практически неизменной. После 1-часовой инкубации в присутствии 6-молярного ацетонитрила нитрилгидратазная активность все еще составляла 60% от исходного уровня. После 1-часовой инкубации в присутствии 9-молярного ацетонитрила нитрилгидратазная активность все еще составляла порядка 35% от исходного уровня (фиг. 9).

Пример 17. Создание непигментированных мутантов штамма Кйобососсиз зр. ΕΖ4.

Штамм Кйобососсиз зр. ΕΖ4 вносили в среду типа питательного бульона (50 мл) и инкубировали при встряхивании и при 28°С до достижения оптической плотности ОП₆ю_нм, равной 6,29. Затем эту предварительную культуру (10 мл) пересевали на среду типа питательного бульона (25 мл) и при встряхивании инкубировали при 28°С до достижения оптической плотности ОП₆₁онм, равной 1,90. Полученную таким путем культуру (10 мл) центрифугировали (при 8000 об./мин в течение 5 мин). Надосадочную жидкость отбрасывали, а содержащий клетки осадок суспендировали в забуференном фосфатом растворе поваренной соли. Полученную суспензию клеток центрифугировали (при 8000 об./мин в течение 5 мин). Надосадочную жидкость отбрасывали, а содержащий клетки осадок суспендировали в забуференном фосфатом растворе поваренной соли (5 мл). Эту суспензию клеток переносили в стеклянную чашку Петри (диаметром 90 мм). Далее клетки в течение 17 мин облучали УФ-лампой (15 Вт, 254 нм) с расстояния 25 см. После этого клетки при встряхивании инкубировали в течение 4 дней при 28°С в среде типа питательного бульона двойной концентрации. Полученную таким путем культуру разбавляли в 100 раз и 100-микролитровые аликвоты такой разбавленной культуры высевали на агар для чашечного подсчета и инкубировали при 28°С. В каждой чашке вырастало почти по 150 отдельных колоний. Чашки помещали в доступное для дневного света место с целью индуцировать образование красных пигментов. Колонии непигментированных мутантов можно было легко отличить от колоний окрашенных мутантов и колоний имеющих красную окраску микроорганизмов дикого типа.

Пример 18. Очистка нитрилгидратазы из Кйобососсиз зр. ΕΖ4.

Штамм Кйобососсиз зр. ΕΖ4 выращивали согласно примеру 3 в 2-литровом ферментере. Полученную культуру центрифугировали и содержащий клетки осадок ресуспендировали в водном растворе №С1 (0,85%-ном (мас./об.)). Далее суспензию клеток переносили в калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0), содержащий масляную кислоту (44 мМ), и обрабатывали ультразвуком. Остатки клеток, образовавшиеся в результате их разрушения, удаляли центрифугированием. Надосадочную жидкость использовали для очистки нитрилгидратазы в соответствии с приведенными в табл. 12 условиями. Нитрилгидратазную активность определяли согласно примеру 1, однако, вместо суспензии клеток использовали соответствующие экстракты.

Таблица 12

Очистка нитрилгидратазы из КЬобососсиз зр. ΕΖ4

Стадия очистки	Содержание белка [мг]	Общая активность [мкмоль/мин]	Удельная активность [мкмоль/(минхмг)1
бесклеточный экстракт	335	5881	17,6
осаждение	198	6087	28,4
ДЭАЭ-сефацел	73,0	3553	48,7
бутил-Тоуореаг1	66,2	2035	30,7
Стадия очистки	Содержание белка [мг]	Общая активность [мкмоль/мин]	Удельная активность [мкмоль/(миихмг)1
фенил-сефароза	26,2	890	34,0

Пример 19. Определение молекулярной массы очищенной нитрилгидратазы.

Молекулярную массу определяли с помощью ЖХВР (колонка Т8К де1 О 300 8\У (0,75x60 см); калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,5) и хлорид калия (0,2М); 0,7 мл/мин; 280 нм). Молекулярная масса нитрилгидратазы составляла 465 кДа (фиг. 11). Нитрилгидратаза состоит из α-субъединицы с молекулярной массой 27,7 кДа и β-субъединицы с молекулярной массой 31,2 кДа (фиг. 12).

Пример 20. Термостабильность очищенной нитрилгидратазы.

Раствор, содержащий раствор нитрилгидратазы (0,697 мкмоль/мин; 0,025 мл) и калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 0,475 мл), инкубировали в течение 60 мин при различных температурах в интервале

- 11 008600 от 20 до 70°С. После этого раствор охлаждали с помощью ледяной бани до 20°С и добавляли 3цианпиридин (0,5М; 0,500 мл). Затем реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при 20°С. Реакцию прекращали добавлением МеОН. Количество образовавшегося амида никотиновой кислоты определяли с помощью ЖХВР согласно примеру 1. После 60-минутной инкубации при температурах выше 40°С нитрилгидратазная активность значительно снижалась, при этом после 60-минутной инкубации при 50°С нитрилгидратазная активность составляла лишь около 25% от исходного уровня (фиг. 15).

Пример 21. Оптимальное значение рН для очищенной нитрилгидратазы.

Реакционную смесь, содержащую 3-цианпиридин (0,5М; 0,500 мл), раствор нитрилгидратазы (0,697 мкмоль/мин; 0,025 мл) и различные буферы с рН в интервале от 4 до 11 (0,1; 0,0475 мл), инкубировали в течение 10 мин при 20°С. Реакцию прекращали добавлением МеОН. Количество образовавшегося амида никотиновой кислоты определяли с помощью ЖХВР согласно примеру 1. Оптимальное значение рН для нитрилгидратазы приходилось на интервал от 6,0 до 6,5 (фиг. 16).

Пример 22. рН-Стабильность очищенной нитрилгидратазы.

Раствор, содержащий раствор нитрилгидратазы (8,36 мкмоль/мин; 0,47 мл), различные буферы с рН в интервале от 4,0 до 11,0 (0,3М; 0,10 мл) и дистиллированную воду (0,03 мл), инкубировали в течение 30 мин при 20°С. Затем реакционную смесь, содержащую аликвотное количество инкубированного на предыдущей стадии раствора нитрилгидратазы (0,05 мл), 3-цианпиридин (0,5М; 0,5 мл) и соответствующий буфер (0,1М; 0,45 мл), инкубировали в течение 10 мин при 20°С. Реакцию прекращали добавлением МеОН. Количество образовавшегося амида никотиновой кислоты определяли с помощью ЖХВР согласно примеру 1. После 60-минутной инкубации при значении рН в интервале от 6 до 8 нитрилгидратазная активность примерно соответствовала исходному уровню (фиг. 17).

Пример 23. Субстратная специфичность очищенной нитрилгидратазы.

Реакционную смесь, содержащую раствор нитрилгидратазы (0,695 мкмоль/мин; 0,025 мл), различные субстраты (0,500 мл) и калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 0,475 мл), инкубировали в течение 510 мин при 20°С. Субстраты использовали в концентрациях от 0,015 до 0,250М. Реакцию прекращали добавлением МеОН. Количество образовавшегося амида кислоты определяли с помощью ЖХВР. Полученные результаты приведены в табл. 13. Среди всех протестированных субстратов наивысшую активность нитрилгидратаза проявляет в отношении ацетонитрила.

Таблица 13 Субстратная специфичность очищенной нитрилгидратазы

Субстрат	Концентрация [М]	Относительная активность [%]
ацетонитрил	0,2	1008
акрилонитрил	0,2	774
пропионитрил	0,2	693
бутиронитрил	0,2	578
нитрил кротоновой кислоты	0,2	114
3-цианпиридин	0,25	100^а
4-циаппиридин	0,125	92,8
бензонитрил	0,015	75,6
лг-хлорбензонитрил	0,015	66,5
2-цианпиридин	0,125	36,7
и-хлорбензонитрил	0,015	8,31
метакриламид	0,2	1,39
Субстрат	Концентрация ГМ]	Относительная активность [%]
о-хлорбензонитрил	0,015	0

Примечание:

^а общая активность: 4164 мкмоль/(минхмл).

Пример 24. Влияние потенциальных ингибиторов на очищенную нитрилгидратазу.

Раствор, содержащий раствор нитрилгидратазы (0,695 мкмоль/мин; 0,025 мл), калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 0,475 мл), дистиллированную воду (0,150 мл) и различные потенциальные ингибиторы (0,100 мл), инкубировали в течение 5 мин при 20°С. После этого добавляли 3-цианпиридин (1,0М; 0,250 мл). Концентрация ингибиторов в реакционной смеси составляла 1,0мМ. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при 20°С. Реакцию прекращали добавлением МеОН. Количество образовавшегося амида никотиновой кислоты определяли с помощью ЖХВР согласно примеру 1. Полученные результаты представлены в табл. 14. Среди всех протестированных потенциальных ингибиторов наибольшее ингибирующее действие проявляют гидроксиламин и цианид калия.

- 12 008600

Таблица 14 Влияние потенциальных ингибиторов на очищенную нитрилгидратазу

Потенциальный ингибитор	Относительная активность [%]
η-хлормеркурбензойная кислота³	187
тирон	114
фенилметансульфонилфторид	110
1,10-феиантролин	106
мочевина	106
дитиотреитол	103
эдтк⁰	100
-	100“
цистеамин	99,1
8-гидроксихинолин	97,8
2,2'-бипиридил	97,8
иодацетат	96,7
Ν-этилмалеинимид	95,3
азид натрия	93,5
5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота)³	93,4
диэтилдитиокарбамат	93,3
Ώ-циклосерин	86,3
фенилгидразин	84,6
Потенциальный ингибитор	Относительная активность [%]
2 -меркаптоэтанол	76,3
гидроксиламин	1,34
цианид калия	0

Примечания:

^а0,1мМ, ⁶ этилендиаминтетрауксусная кислота, “общая активность: 3776 мкмоль/(минхмл).

Пример 25. Влияние ионов металлов на активность очищенной нитрилгидратазы.

Влияние ионов металлов на активность очищенной нитрилгидратазы определяли согласно примеру 24, но с использованием ионов металлов вместо потенциальных ингибиторов. Концентрация ионов металлов в реакционной смеси составляла 1,0мМ. Полученные результаты представлены в табл. 15. Среди всех протестированных ионов металлов ингибирующее действие проявляют только катионы серебра и двухзарядные катионы ртути.

Таблица 15

В лияние ионов металлов на активность очищенной нитрилгидратазы

Ионы металлов	Относительная активность [%]
Си8О₄	177
МпС1₂	123
ΝΐΟ1₂	123
Ζη8Ο₄	121
Ре8О₄	113
СаС1₂	ИЗ
СоС1₂	110
РеС1₃	105
-	100“
ΑβΝΟ₃	0
НёС1₂ ⁶	0

Примечания:

“общая активность: 3375 мкмоль/(минхмл), ^б0,1мМ.

Пример 26. Определение К_т-значения для 3-цианпиридинау очищенной нитрилгидратазы.

К раствору, содержащему раствор нитрилгидратазы (0,0697 мкмоль/мин; 0,025 мл) и калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 0,475 мл), добавляли 3-цианпиридин в различных концентрациях (3,1-800мМ; 0,500 мл). Реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при 20°С. Реакцию прекращали добавлением метанола и количество образовавшегося амида никотиновой кислоты определяли с помощью ЖХВР согласно примеру 1. К_т-значение для 3-цианпиридина составило 80,5мМ (фиг. 13).

Пример 27. Определение К_т-значения для ацетонитрила у очищенной нитрилгидратазы.

К раствору, содержащему раствор нитрилгидратазы (0,0697 мкмоль/мин; 0,025 мл) и калийфосфатный буфер (0,1М, рН 7,0; 0,475 мл), добавляли ацетонитрил в различных концентрациях (2,5-80мМ; 0,500

-13 008600 мл). Реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при 20°С. Реакцию прекращали добавлением метанола и количество образовавшегося ацетамида определяли с помощью ЖХВР согласно примеру 14. К_т-значение для ацетонитрила составило 2,84мМ (фиг. 14).

Claims

1. Микроорганизм, представляющий собой штамм КЕобососсик кр. ΡΖ4, депонированный под регистрационным номером ИБМ 13597, и его функционально эквивалентные варианты и мутанты, способные превращать ацетонитрил в амид.

2. Нитрилгидратаза, полученная из микроорганизма по п.1 и характеризующаяся:

а) К_т 2,84±1,00 мМ при использовании в качестве субстрата ацетонитрила и К_т 80,5±15,0 мМ при использовании в качестве субстрата 3-цианпиридина;

б) оптимальным значением рН 6,5±1,0.

3. Экстракт, содержащий нитрилгидратазу по п.2.

4. Способ получения амидов общей формулы

Ρ/^ΟΝΗ₂ III, в которой К¹ обозначает С1-6алкильный остаток, С2-6алкенильную группу или группу общей формулы в которой X обозначает атом азота или группу -СН=, а К² и К³ независимо друг от друга обозначают атом водорода, атом галогена, С1-6алкильную группу или С2-6алкенильную группу, отличающийся тем, что нитрил общей формулы

Ρ/^Ν II, в которой К¹ имеет указанные выше значения, подвергают превращению с помощью микроорганизма по п.1, экстракта по п.3 или фермента по п.2.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве нитрила используют 3-цианпиридин или ацетонитрил.

6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что превращение проводят при температуре от 5 до 50°С и значении рН от 5 до 10.

7. Применение микроорганизма по п.1 для уничтожения или утилизации отходов ацетонитрила.

- 14 008600

Термостабильность

Температура [°С]

Фиг. 3

Относительная активность

Фиг. 6

Фиг. 5

Относительная активность [%]

Амид никотиновой кислоты [% (мас./об.)]

Фиг. 7

- 15 008600

600- 500 - -^- 400 - Общая активность 300 - [мкм о л ь/(мин х мл)] 200- 100 - о4 1 ί ί

О 5 10 15

Ацетонитрил [М]

Фиг. 8

- 16 008600

Фиг. 13

- 17 008600 [%]

Общая активность [мкмоль/(минхмл)1

Относительная активность

Температура [°С]

Фиг. 15

Оптимальное значение рН

Относительная активность рн —ιίτ— Ацетатный буфер

Цитратный буфер

Калнйфосфатный буфер

Трис-НС1-буфер

-О- Натрийгидрокарбонатный буфер

Фиг. 16

- 18008600 [%]

Относительная активность —Δ— Ацетатный буфер

Цитратный буфер

Калийфосфатный буфер

Трис-НС1-буфер

-О- Натрийгидрокарбонатный буфер