JP2000515010A - 微生物を用いてｄ―プロリン誘導体を調製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般式（Ｖ） （ここでＲ¹は水素または水酸基であり、Ｒ²はハロゲン原子または−ＮＨ₂である）のグアニジン吉草酸誘導体を唯一の窒素源として利用することができる新規の微生物に関する。本発明は、さらにアミジノヒドロラーゼ活性を有する新規の酵素、およびＬ−アルギニン誘導体からＤ−プロリン誘導体を調製する新規の方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物を用いてＤ−プロリン誘導体を調製する方法 本発明は、アミジノヒドロラーゼ活性を有する新規酵素、当該アミジノヒドロ ラーゼを含む新規微生物、および当該微生物またはアミジノヒドロラーゼを用い てＤ−プロリン誘導体を調製する新規方法に関する。 Ｄ−プロリン誘導体は、薬剤調製のための重要な中間体である（J.Org Chem., 1994,59,7496-7498）。 多くの方法が、Ｄ−プロリンの調製法として公知である。 JP-A 92183399は、カンジダ（Candida）属またはトリコスポラ（Trichospora） 属の微生物を用いて、（ＤＬ）−プロリンから出発してＤ−プロリンを調製する 方法を記載している。この方法の不利な点は、変換時間が非常に長く、Ｄ−プロ リンの収率が低いことである。 JP-A 07127354は、プロテウス・ミタジリ（Proteus mitajiri）種の微生物を用 いて、オルニチンから出発してＤ−プロリンを調製する方法を記載している。こ の方法の不利な点は、一方で、オルニチンが出発材料として非常に高価であるこ と、他方で、Ｄ−プロリンの収率が低いことである。 さらに、JP-A 07289275は、Ｌ−プロリンから出発してＤ−プロリンを調製する 方法を記載している。ここで、ラセマーゼ活性を有するエシエリシア（Escheric hia）属の微生物によりＬ−プロリンを（ＤＬ）−プロリンにラセミ化し、次い で（ＤＬ）−プロリンをＬ−プロリン−分解性微生物と増殖してＤ−プロリンを 得た。この方法の不利な点は、得られたＤ−プロリンがさらに精製を必要とし、 これが高い収率損失を伴うことである。 本発明の目的は、Ｄ−プロリンが高収率で得られる、Ｄ−プロリン誘導体の安 価な調製方法に使用することが双方とも可能であるアミジノヒドロラーゼまたは 当該酵素を含む微生物を提供することである。 この目的は、請求項１記載の微生物、請求項４記載のアミジノヒドロラーゼお よび請求項５記載の方法により達成される。 本発明による微生物は、慣用的な微生物学的方法を使用して、土サンプル、軟 泥または排水から単離することができる。本発明によれば、当該微生物は、唯一 の窒素源として、一般式 （ここで、Ｒ¹は水素または水酸基、およびＲ²はハロゲン原子または−ＮＨ₂で ある）のグアニジン吉草酸誘導体を適切な炭素源と共に含む培地で微生物を増殖 させる方法で単離される。 一般式Ｖの適切なグアニジン吉草酸誘導体の例は、Ｌ-α-クロロ-δ-グアニジン 吉草酸、Ｄ-α-クロロ-δ-グアニジン吉草酸、（ＤＬ）-α-クロロ-δ-グアニジ ン吉草酸、Ｌ-α-ブロモ-δ-グアニジン吉草酸、Ｄ-α-ブロモ-δ-グアニジン吉 草酸、（ＤＬ）-α-ブロモ-δ-グアニジン吉草酸、Ｌ-α-クロロ-γ-ヒドロキシ -δ-グアニジン吉草酸、Ｄ-α-ブロモ-ｙ-ヒドロキシ-δ-グアニジン吉草酸、お よびＬ-、Ｄ-もしくは（ＤＬ）-アルキニンである。 この時、唯一の窒素源としてＬ-α-クロロ-δ-グアニジン吉草酸（Ｒ¹＝Ｈ、 Ｒ²＝Ｃｌ）またはL-アルギニン（Ｒ¹＝Ｈ、Ｒ²＝ＮＨ₂）を利用する増殖により 得られた培養物から当該微生物を選択することが適切である。 当該微生物が適切な炭素源として利用することができる増殖基質の例は、糖、 糖アルコールまたはジカルボン酸である。 グルコースのような六炭糖は、糖として使用され得る。グリセロールは、使用 ざれ得る糖アルコールの一例である。使用することができるジカルボン酸の例は 、コハク酸塩である。さらに、アルギニン、アグマチン（４-アミノブチルグア ニン）、グルタミンまたはグルタミン酸が炭素源として使用され得る。 使用することができる選択培地および増殖培地は、専門家の間で慣用的に使用 されている培地、例えば表１記載の培地である。表１記載の培地が、好ましくは 使用される。 増殖および選択の間に、当該微生物の有効な酵素を誘導することが適切である 。使用することができる酵素誘導物質は、例えば、α-クロロ-δ-グアニジン吉 草酸、Ｌ-アルギニン、グアニジン、グアニジン塩酸塩またはグアニジン酢酸塩 である。しかし、活性な酵素は、誘導物質の一つを含んでいれば、例えば「栄養 酵母ブロス」（ＮＹＢ）のような完全培地でも誘導することができる。 増殖および選択は、通常２０℃から４０℃、好ましくは２５℃から４０℃の温 度で、ｐＨ５からｐＨ９．５の範囲、好ましくはｐＨ８からｐＨ９．５の範囲で 行われる。 好ましく単離されたα-クロロ-δ-グアニジン吉草酸利用性の微生物は、シュ ードモナス（Pseudomonas）属、アルトロバクター（Arthrobacter）属、アグロ バクテリウム（Agrobacterium）属またはクレブシエラ（Klebsiella）属の微生 物であり、特にアグロバクテリウム・ラディオバクター（Agrobacterium radiob acter）種、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）種、クレブシエ ラ・ニューモニア（Klebsiella pneumoniae）種ＤＳＭ 10593、シュードモナス ・アルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）種ＤＳＭ 10581またはアルトロバク ター属の種（Arthrobacter sp.）ＤＳＭ 10582、ならびにこれらと機能的に同等 の変異株および突然変異株の微生物である。クレブシエラ・ニューモニア、アル トロバクター属の種およびシュードモナス・アルギノーサの菌株を、1996年11月 ３日にブダペスト条約に従って、Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH、Mascheroderweg 1b、D-38124 Braunschweigに寄託した。 「機能的に同等の変異株および突然変異株」は、もとの微生物と同じ特性およ び機能を本質的に有する微生物を意味すると理解すべきである。このような変異 株および突然変異株は、例えばＵＶ照射、または突然変異誘発化学物質によりラ ンダムに形成され得る。 クレブシエラ・ニューモニア（ＤＳＭ 10593）の分類学的記述 菌株の特性 細胞の形状 杆状体 幅（μｍ） 1.0−1.2 長さ（μｍ） 1.2−2.0 運動性 − グラム染色反応 − ３％ＫＯＨによる溶菌 ＋ アミノペプチダーゼ（Cerny） ＋ 胞子 − オキシダーゼ − カタラーゼ ＋ 増殖、嫌気性 ＋ グルコースからの気体 ＋ グルコースからの酸(ASA) ＋ フルクトースからの酸(ASA) ＋ キシロースからの酸(ASA) ＋ エリトリトールからの酸(ASA) − アドニトールからの酸(ASA) − Ｄ−マンノースからの酸(ASA) ＋ Ｌ−ラムノースからの酸(ASA) ＋ イノシトールからの酸(ASA) ＋ ソルビトールからの酸(ASA) ＋ α-メチル-Ｄ-グルコシドからの酸(ASA) ＋ セロビオースからの酸(ASA) ＋ マルトースからの酸(ASA) ＋ ラクトースからの酸(ASA) ＋ Ｄ−アラビトールからの酸(ASA) ＋ ＯＮＰＧ ＋ ＡＤＨ − ＬＤＣ − ＯＤＣ − ＶＰ ＋ インドール − Ｈ₂Ｓ生成 − シモンズクエン酸塩 ＋ ウレアーゼ ＋ メチルレッド − ゼラチンの加水分解 − ＤＮＡの加水分解 − Tween 80の加水分解 − 略語： ＡＳＡ：アセチルサリチル酸 ＯＰＮＧ：O-ニトロフェニルガラクトシダーゼ ＡＤＨ：アルコールデヒドロゲナーゼ ＬＤＣ：乳酸デカルボキシラーゼ ＯＤＣ：オルニチンデカルボキシラーゼ ＶＰ：フォゲスプロスカウアー アルトロバクター属の種（ＤＳＭ 10582）の分類学的記述 特性 グラム陽性、コリネ型杆状体、老齢の培養物において球菌様 （coccoid）、絶対好気性、グルコースからの酸または気体 の生成なし 運動性 − 胞子 − カタラーゼ ＋ 細胞壁におけるメソージアミノピメリン酸：なし ペプチドグリカンのタイプ：n.d. 本発明によるアミジノヒドロラーゼは、上記の微生物から得ることができ、一 般式Ｖの化合物の中から選択されたグアニジン吉草酸誘導体から尿素を遊離させ ることができる。 アミジノヒドロラーゼは、適切には、クレブシエラ属、シュードモナス属、ア グロバクテリウム属またはアルトロバクター属の微生物、特にアグロバクテリウ ム・ラディオバクター種、シュードモナス・セバシア種、クレブシエラ・ニュー モニア種ＤＳＭ 10593、アルトロバクター属の種ＤＳＭ 10582またはシュードモ ナス・アルギノーサ種ＤＳＭ 10581の微生物から得られる。 本発明に従ってアミジノヒドロラーゼを得るために、炭素源、窒素源、無機塩 およびビタミン源を含む水性栄養培地において慣例的方法で、前記微生物を増殖 させた（培養した）。前記微生物は、適切には、２０℃から４０℃の温度で、ｐ Ｈ５から８で培養した。次いで、前記微生物の細胞を、例えば、超音波、フレン チプレスまたはリゾチーム法により破裂させた後、アミジノヒドロラーゼをそれ 自体公知の酵素精製の方法により単離することができる。 アミジノヒドロラーゼは、適切には以下の特性を有する： ａ）最適ｐＨ ｐＨ８.５±１、 ｂ）ｐＨ７から８における最適温度 約３７℃、 ｃ）基質Ｌ-α-クロロ-δ-グアニジン吉草酸に対するＫ_M値（１００ｍＭリン酸 緩衝液；３７℃）８５.２ｍＭ±５、 さらに、アミジノヒドロラーゼは、 ｄ）Ｌ-α-クロロ-δ-グアニジン吉草酸、Ｌ−アルギニン、グアニジン塩酸塩、 グアニジンおよび／またはグアニジン酢酸塩により誘導され、 ｅ）Ｌ-α-クロロ-δ-グアニジン吉草酸により阻害され、 ｆ）基質アルギニン、Ｌ-α-クロロ-δ-グアニジン吉草酸およびＬ-α-ブロモ- δ-グアニジン吉草酸を、対応するＬ-アミノ吉草酸誘導体に加水分解する、 という特性を有する。 Ｄ−プロリン誘導体の本発明による調製において、第一の工程で、一般式 （ここでＲ¹は上記の意味である）のＬ−アルギニン誘導体またはその塩を、そ れ自体公知の方法で、一般式（ここでＲ¹は上記の意味であり、Ｒ³はハロゲン原子である）のＬ−グアニジン 吉草酸誘導体またはその塩に変換することが適切である。対応するジアゾニウム 塩は中間体として形成される。 Ｌ−アルギニンまたはＬ−ν−ヒドロキシアルギニンは、Ｌ−アルギニン誘導 体として使用され得る。 使用することができるＬ−アルギニン誘導体の塩およびＬ−グアニジン吉草酸 誘導体の塩は、これらの塩酸塩または臭化水素酸塩である。 ジアゾ化反応の第一工程は、亜硝酸塩溶液または硝酸で通常行われる。亜硝酸 ナトリウムまたは亜硝酸カリウム溶液は、亜硝酸塩溶液として使用され得る。硝 酸、特に５０〜６５％強度の硝酸を、好ましくは使用する。 この反応の第一工程は、通常、ハロゲン化水素酸（hydrohalic acid）の存在 下で行われる。塩酸または臭化水素酸がハロゲン化水素酸として使用され得、好 ましくは塩酸が使用される。 この反応の第一工程は、適切には−１０℃から１００℃の温度で、好ましくは ０℃から８０℃の温度で行われる。 本発明による第二の反応工程において、Ｌ−グアニジン吉草酸誘導体（式III ）は、請求項４記載のアミジノヒドロラーゼ、請求項１記載の微生物および／ま たはその微生物の酵素抽出液を用いて加水分解され、一般式 （ここでＲ¹およびＲ³は上記の意味である）のＬ−アミノ吉草酸誘導体を得る。 原則として、微生物学的加水分解は、上記のアミジノヒドロラーゼならびに上 記の酵素抽出液および微生物の両方を用いて行われ得る。加水分解にとって特に 適切であるのは、上記のシュードモナス属、アルトロバクター属、アグロバクテ リウム属またはクレブシエラ属の微生物、特にクレブシエラ・ニューモニア種Ｄ ＳＭ 10593、シュードモナス・アルギノーサ種ＤＳＭ 1058Lアルトロバクター属 の種ＤＳＭ 10582、アグロバクテリウム・ラディオバクター種またはシュードモ ナス・セバシア種、ならびにこれらと機能的に同等の変異株および突然変異株の 微生物である。 微生物学的加水分解は、微生物を慣用的方法で増殖させた後の休眠細胞（炭素 源およびエネルギー源を必要としない非増殖性の細胞）を用いて、または増殖中 の細胞を用いて行われ得る。この加水分解は、好ましくは休眠細胞を用いて行わ れる。 微生物学的加水分解を行うために、当業者が通常使用する培地は、例えば、低 モル濃度のリン酸緩衝液およびHepes緩衝液、例えば「栄養酵母ブロス」（ＮＹ Ｂ）のような完全培地、または表３記載の培地を使用することができる。この加 水分解は、好ましくは、低モル濃度のリン酸緩衝液またはHepes緩衝液で行われ る。 この加水分解は、適切には、Ｌ−グアニジン吉草酸をその濃度が２０重量％を 越えないように、好ましくは１重量％となるように、１回または連続して添加す ることで行われる。 第三工程において、Ｌ−アミノ吉草酸誘導体（一般式IV）を一般式 （ここでＲ¹は上記の意味である）の最終産物に環化する。 培地のｐＨ範囲は、第二工程および第三工程がＬ−アミノ吉草酸誘導体(式IV) を単離させることなく行われるように適切に選択される。この好ましい態様にお いて、培地のｐＨは、ｐＨ５からｐＨ１３、好ましくはｐＨ７からｐＨ９．５に する。この範囲において、Ｌ−アミノ吉草酸誘導体（式IV）は、Ｄ−プロリンに 自発的に環化される。この環化および加水分解は、１０℃から６０℃の温度で、 好ましくは３０℃から４０℃の温度で適切に行われる。 原則として、式IIのＬ−アルギニン誘導体またはその塩を直接上記の微生物、 酵素抽出液またはアミジノヒドロラーゼを用いて式VI （ここでＲ¹は上記の意味であり、Ｒ⁴は−ＮＨ₂である）の化合物に加水分解し 、次いで、この化合物をジアゾニウム塩を中間体として上記式IVのＬ−アミノ吉 草酸誘導体に変換して、式IVのＬ−アミノ吉草酸誘導体を所望のプロリン誘導体 に環化することにより、式ＩのＤ−プロリン誘導体は更に調製され得る。しかし 、この方法は好ましくない。 例： 例１ 微生物クレブシエラ・ニューモニア、シュードモナス・セパシア、アグロバクテ リウム・ラディオバクターおよびアルトロバクター属の種の単離 庭の堆肥またはＬＯＮＺＡ水処理ブラント（Ｖｉｓｐ）からの土サンプルを、 ３７℃で、以下の最少培地で振盪しながらインキュベートした。 グルコースまたはグリセロールを炭素源として１−２０ｇ／Ｌの濃度で供給した 。 Ｌ−アルギニン、尿素、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、Ｌ−α−クロロ−δ−グアニジン− 吉草酸を、窒素源および／または誘導物質として０.２５ｍＭ−２０ｍＭの濃度 で使用した。 酵母抽出液を０.１−１ｇ／Ｌの濃度で補充物質として添加した。 表１：Ａ）液体培地 MgCl₂×6H₂O 0.4ｇ／Ｌ CaCl₂×2H₂O 0.014ｇ／Ｌ FeCl₃×6H₂O 2.8ｍｇ／Ｌ Na₂SO₄ 0.1ｇ／Ｌ Na₂HPO₄ ２ｇ／Ｌ KH₂PO₄ １ｇ／Ｌ NaCl ２ｇ／Ｌ ビタミン溶液 １ｍＬ／Ｌ 微量成分溶液 １ｍＬ／Ｌ ｐＨ6.8−8.0Ｂ）固体培地 ２０ｇ／Ｌの寒天を添加したＡ） 微生物を上記培地上で２−３０日間のインキュベーション期間にわたって増殖 させた。これを新鮮な培地に１−３回移し、固体培地上で単離した。 単離された微生物の細胞懸濁液に活性試験を行った（参照 例３）。以下の微 生物が単離された：クレブシエラ・ニューモニア種ＤＳＭ 10593、アルトロバク ター属の種ＤＳＭ 10582、シュードモナス・セパシア種およびアグロバクテリウ ム・ラディオバクター種。 例２： 偶然突然変異体の選択 シュードモナス・アルギノーサ（P.aeruginosa）ＰＡ０１（Holloway、Ｂ.Ｗ. Bacteriol Rev.、1959、33、419-443）の野生型を、例１記載の固体または液体 培地上で、３７℃で、１−３０日間、唯一の窒素源としてのＬ−α−クロロ−δ −グアニジン吉草酸、および炭素源としてのグリセロールまたはグルコースとと もにインキュベートした。このインキュベーション期間の後、１１個の同一の薄 茶色のコロニーが固体培地上で増殖した。その一つのコロニーを再度プレートに 播き、次いで対応する液体最少培地で増殖させた。このような細胞の細胞懸濁液 を上記の酵素活性について調査した。このようにして、所望のタイプのヒドロラ ーゼを発現しているシュードモナス・アルギノーサ（ＤＳＭ 10581）を単離した 。 「ファージタイピング」およびＡＰＩテスト（20 NE bio Merieux SA,フランス ）での菌株の同定の後、この菌株は、野生型シュードモナス・アルギノーサＰＡ ０１となお同一であったが、Ｌ−α−クロロ−δ−グアニジン吉草酸アミジノヒ ドロラーゼを発現する能力の点で野生型とは本質的に異なっていた。 例３： 細菌株クレブシエラ・ニューモニアＤＳＭ 10593およびシュードモナス・アルギ ノーサＤＳＭ 10581の休眠細胞を用いた誘導およびバイオトランスフォーメーシ ョン 例１および例２記載の単離された微生物を、３７℃の温度で、１００ｍＬの液 体培地Ａ）で、炭素源としてのグリセロールまたはグルコース、ならびに誘導物 質および窒素源としてのＬ−α−クロロ−δ−グアニジン吉草酸とともに増殖さ せた。静止増殖期に達した後（０.８−１.５のＯＤ650）、細胞を遠心により収 集し、１０−２０倍の濃度のバイオトランスフォーメーション溶液に溶解した。 バイオトランスフォーメーション溶液は以下のもので構成される：１０−１００ ｍＭのリン酸緩衝液またはHepes緩衝液、１０−１５０ｍＭのα−クロロ−δ− グアニジン吉草酸（ｐＨ６.８−１１）。バイオトランスフォーメーションは、 ３７℃で静かに攪拌しながら行った。サンプルを間隔をおいて採取し、薄層クロ マトグラフィーまたはＨＰＬＣにより分析した。 Ｌ−α−クロロ−δ−グアニジン吉草酸は、濃度に応じて５−２４時問以内にＤ −プロリンに変換され、Ｄ−プロリンのｅｅ値は（ＨＰＬＣによると）９６％以 上であった。 例４： 細菌株アルトロバクター属の種ＤＳＭ 10582を用いた誘導およびバイオトランス フォーメーション 以下の培地上で当該細菌を増殖させることで、アミジノヒドロラーゼを誘導し た：ＮＹＢ（Difco）；ＮＹＢおよび１−１０ｍＭのＬ−α−クロロ−δ−グア ニジン吉草酸；２５ｍＭのグリセロールおよび窒素源として１−１０ｍＭのＬ− ア ルギニンを補充した培地（Ａ）。細胞を２４時間にわたって３７℃で１００ｍＬ の培地中で増殖させた。細胞を例３に記載したように収集し、バイオトランスフ ォーメーションのために使用した。この細胞を洗った後、１０−２００ｍＭのリ ン酸緩衝液またはHepes緩衝液（ｐＨ５−１０）中で、バイオトランスフォーメ ーションを行った。Ｌ−α−クロロ−δ−グアニジン吉草酸は、濃度に応じて５ −24時間にわたってＤ−プロリンに定量的に変換され、Ｄ−プロリンのｅｅ値は （ＨＰＬＣによると）９６％以上であった。 例５： シュードモナス・アルギノーサＤＳＭ 10581を用いた誘導およびバイオトランス フォーメーション 当該菌株をバッフル付き１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中で、３７℃で 攪拌しながら、以下の培地上で増殖させた：以下の表２に記載の補充物質を含む 最少培地（Ａ）、および１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの「肉エキス」、５ ｇ／ＬのＮａＣｌを含むＮＹＢ完全培地。この細胞を例３に記載したようにバイ オトランスフォーメーションのために調製した。 表２ Gluc＝グルコース、Arg＝アルギニン、Gly＝グリセロール、Glu＝グルタミン酸 、Gln＝グルタミン、Cl−Arg＝L-α-クロロ-δ-グアニジン吉草酸、Ornit＝オル ニチン、Citrul＝シトルリン Ｌ-α-クロロ-δ-グアニジン吉草酸は、濃度に応じて、５−24時間にわたって Ｄ−プロリンに定量的に変換され、Ｄ−プロリンのｅｅ値は（ＨＰＬＣによると ）９６％以上であった。このようにして、（ＨＰＬＣによると）１３ｇ／ＬのＤ −プロリンが生成された。最高の結果は、Gluc 20ｍＭ、Arg １ｍＭおよびCl−A rg ４ｍＭを補充した上記の培地において達成された（参照 表２）。 例６: Ｌ−α−クロロ−δ−グアニジン吉草酸の調製 この目的のために、100g（0.475mol）のＬ−アルギニン−塩酸塩を150ｍＬの 濃塩酸に溶解し、この溶液を65℃に温めた。75ｍＬの65％強度のＨＮＯ₃を30分 にわたって滴下したところ、この滴下に伴って最初から激しい気体の発生が起こ った；65℃でさらに30分後、気体の発生は停止し、この鮮やかな淡黄色の反応溶 液を真空中で濃縮した。得られた残渣をさらに２回、各々200ｍＬの濃HClに溶解 し、真空中で乾燥するまで蒸発させた。これにより、112.2ｇの淡黄色の固形物 を得た。この固形物を60℃で750ｍＬの濃HClに溶解し、この溶液を０℃に冷却す ることで結晶化させた。この沈殿を濾過し、２回、各々100ｍＬの冷却６Ｎ HCl で洗い、真空中で乾燥させた。これにより、72.9ｇの無色の結晶状固形物を得た 。これは66.7％の収率に相当する。 m.p.149℃ α_D ²⁵（Ｈ₂Ｏ中Ｃ＝10％）＝−7.87°¹ Ｈ−ＮＭＲ in ppm（400ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ中）；4.55（dd、１Ｈ、Ｈ−１）；3.25 （ｔ、２Ｈ、Ｈ−４）；2.15−1.95（br、ｍ、２Ｈ）；1.8−1.7（br、ｍ、２Ｈ ）コンテント（Content）100.8％ 例７： ａ）3.5 1発酵槽でのＤ−プロリンの調製 シュードモナス・アルギノーサ（ＤＳＭ 10581）菌株の細胞を、前培養物の１ ０％を用いて表３記載の培地に対して接種し、ＯＤ₆₀₀が１３まで２４時間増殖 させた。バイオマスを遠心により取り出し、１０ｍＭ Hepes（ｐＨ8.5）で洗い 、後者に再懸濁した。３７℃におけるｐＨを8.5に一定に制御し、ＯＤ₆₀₀におけ る細胞密度は10−20である１１個のアプリコン（Applikon）発酵槽中でバイオト ランスフォーメーションを行った。バイオトランスフォーメーションの間のα− クロロ−δ−グアニジン−吉草酸の濃度は、常に25ｍＭを越えていた。全体で11 0ｍＭの基質を加えた。４０時間後、（ＨＰＬＣによると）98.3％のｅｅ値を有 する106ｍＭのＤ−プロリンが生成された（図１）。 ４０時間後、細胞を遠心により取り出した。粗溶液をセライト（Celite）535 で精製した；過塩素酸でタンパク質を沈殿させ、次いでＫＯＨで中和した後、バ イオトランスフォーメーション溶液を活性炭で処理し、セライト535で濾過した 。その生成物を蒸発乾固させた。 ｂ）無細胞（cell-free）抽出液を用いたＤ−プロリンの調製 シュードモナス・アルギノーサ（ＤＳＭ 10581）細胞をフレンチプレスを用い て破壊した（３分；120Mpa）。１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７−８）中の１ ｍＬの５０ｍＭＬ−α−クロロ−δ−グアニジン吉草酸を、１ｍＬの無細胞抽出 液に加え、その混合物を３７℃でインキュベートした。全ての方法を比較理由の ためにインタクトな細胞についても行った。サンプルを採取して、ＨＰＬＣによ り分析した。無細胞抽出液の活性は、対応する非破壊細胞の活性と比べて２倍以 上高いという事実が現れた（図２）。 表３ MgCl₂×6H₂O 0.8ｇ／Ｌ CaCl₂×2H₂O 0.16ｇ／Ｌ FeO₄×7H₂O 20ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡを除く微量成分 １ｍＬ／Ｌ ポリプロピレングリコール2000 １ｍＬ グルコース 10ｇ／Ｌ（30ｇ／Ｌまで「グルコース供給」） Na₂HPO₄ ２ｇ／Ｌ KH₂PO₄ １ｇ／Ｌ NaCl ２ｇ／Ｌ 誘導物質 α-クロロ-δ-グアニジン吉草酸10ｍＭ（供給） Ｎ−供給源 （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、3.1ｇ／Ｌ ｃ）Ｄ−プロリンのＤ−Ｚ−プロリンへの誘導体化 上記のように単離した4.6ｇのＤ−プロリンを20ｍＬのＨ₂Ｏに溶解した。ベン ジルクロロホルメート（Ｚ−Cl）を、11.5−12の一定ｐＨで滴下した（４Ｎ Ｎ ａＯＨ）。合計９．３ｇのＺ−Clを滴下した。この反応の後、混合物をＨＣｌで 中 和した。この溶液を酢酸ブチルで抽出した。その有機相を捨てた。水相にさらに ＨＣｌを加えることでｐＨを２にし、その混合物を酢酸ブチルで攪拌することに より再度抽出した。有機相を一つにして濃縮した。この生成物を2.5ｍＬの酢酸 エチルおよび1.5ｍＬのヘキサンの溶液から結晶化させた。これにより3.6ｇのＺ −Ｄ−プロリンを得た。 融点：68.5℃ コンテント（Content）：97.86％ ［α_D ²⁰］（氷酢酸中ｃ＝２）＝＋55.766° ［α₅₄₆ ²⁰］（氷酢酸中ｃ＝２）＝＋66.251° （ＨＰＬＣによる）ｅｅ 95.4％¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ中400Mnz）；δin ppm： ７.３５（ｍ、５Ｈ）、 ５.１（ｍ、２Ｈ）、 ４.３（ｍ、１Ｈ）、 ３.６−３.４（ｍ、２Ｈ）、 ２.３−２.２（ｍ、１Ｈ）、 ２.１−１.９（ｍ、３Ｈ） 例８： 酵素の精製 シュードモナス・アルギノーサ ＤＳＭ 10581の細胞を例１に記載したとおり 増殖させた。後期−指数増殖期において、これら細胞を遠心により収集し、0.85 ％のＮａＣｌまたは30−200ｍＭのHepes緩衝液（ｐＨ７−９）で洗った。その細 胞をフレンチプレスを用いて破壊した（３回；120Mpa）。細胞抽出液を30分間30 ,000ｇの速心により取り出した。無細胞の上清を濾過し（0.4μｍ）、MonoＱ− ＦＰＬＣカラム（ファルマシア(Pharmacia)）で精製した。使用した移動相は、1 0ｍＭのHepes緩衝液（ｐＨ８）であった。カラムから酵素を溶出するためにNa₂S O₄の勾配を確立した。この酵素は、120ｍＭの塩濃度でカラムから溶出された。2 5ｍＭのＬ−α−クロロ−δグアニジン吉草酸を過剰の酵素と一晩反応させてＤ −プロリ ンを得た。 MonoＱ−ＦＰＬＣ精製による活性分画を一つに合わせ、フェニルセファロース カラム（ファルマシア）を用いてさらに精製した。使用した移動相は、50ｍＭの Hepes緩衝液（ｐＨ８）、1.7Ｍ(NH₄)₂SO₄であった。50ｍＭのHepes緩衝液（ｐＨ ８）を用いて、ヒドロラーゼをカラムから溶出した。精製された酵素により、25 ｍＭのＬ−α−クロロ−δ−グアニジン吉草酸は、２４時間で完全にＬ−α−ク ロロ−δ−グアニジン吉草酸に変換され、次いでこれは培地の塩基性のためＤ− プロリンに環化された。 例９： 酵素の特性決定 酵素の特性決定をシュードモナス・アルギノーサ（ＤＳＭ 10581）のインタク トな細胞について行った。細胞懸濁液の光学密度は、ＯＤ₆₀₀＝１７であった。 温度効果を、100ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７−８）中、24ｍＭのＬ−α−クロロ −δ−グアニジン吉草酸の基質濃度で測定した。３７℃において３０℃のときよ り４０％高い活性が得られるという事実を得た。ｐＨの効果は、同じ緩衝液中、 同じ基質濃度および３７℃の温度で測定した。ｐＨ７、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０ およびｐＨ８．５で活性を測定した。最適ｐＨはｐＨ８．５であるという事実を 得た。種々の濃度のＬ−α−クロロ−δ−グアニジン吉草酸を用いることにより 、Ｋ_M値およびＶmaxを３7℃の温度で100ｍＭリン酸緩液（ｐＨ８．５）中で測定 した。Ｋ_M値は、85.2ｍｍｏｌ／Ｌ、およびＶmaxは、0.38ｍｍｏｌ／分であった (図３)。 種々の濃度の（例６と同様にしてオルニチンから調製した）Ｌ−α−クロロ− δ−グアニジン吉草酸を加えることにより阻害を検出した。図４から確認できる ように、完全な阻害は５０ｍＭの濃度で起こる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ゴステリ、ジャック スイス国、シーエイチ―4059 バーゼル、 アンビラーシュトラーセ 10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式 （ここでＲ¹は水素または水酸基であり、Ｒ²はハロゲン原子または−ＮＨ₂であ る）の化合物の中から選択されるグアニジン吉草酸誘導体を唯一の窒素源として 利用できることを特徴とする微生物、および該微生物の酵素抽出液。 ２．クレブシエラ（Klebsiella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ア グロバクテリウム（Agrobacterium）属またはアルトロバクター（Arthrobacter ）属に属する請求項１記載の微生物。 ３．クレブシエラ・ニューモニア（Klebsie1la Pneumoniae）種ＤＳＭ 10593 、アルトロバクターの種（Arthrobacter sp.）ＤＳＭ 10582、アグロバクテリウ ム・ラデイオバクター（Agrobacterium radiobacter）種、シュードモナス・セ パシア（Pseudomonas cepacia）種またはシュードモナス・アルギノーサ（Pseud omonas aeruginosa）種ＤＳＭ 10581、ならびにこれらと機能的に同等な変異体 および突然変異体に属する請求項１または２記載の微生物。 ４．請求項１ないし３のいずれか１項記載の微生物であって、一般式 （ここでＲ¹は水素または水酸基であり、Ｒ²はハロゲン原子または−ＮＨ₂であ る）の化合物の中から選択される唯一の窒素源としてのグアニジン吉草酸誘導体 から尿素を遊離することができる微生物、ならびに該微生物と機能的に同等な変 異体および突然変異体がら得られるアミジノヒドロラーゼ活性を示す酵素。 ５．一般式（ここでＲ¹は水素または水酸基である）のＤ−プロリン誘導体を調製する方法 であって、一般式 （ここでＲ¹は上記の意味であり、Ｒ³はハロゲン原子である）のＬ−グアニジン 吉草酸誘導体または該誘導体の塩を、請求項１記載の微生物もしくは酵素抽出液 または請求項４記載のアミジノヒドロラーゼを用いて、一般式 （ここでＲ¹およびＲ³は上記の意味である）のＬ−アミノ吉草酸誘導体に加水分 解し、前記一般式ＩＶのＬ−アミノ吉草酸誘導体を式Ｉの最終産物に環化するこ とを特徴とする方法。 ６．第一の工程において、一般式 （ここでＲ¹は上記の意味である）のＬ−アルギニン誘導体または該誘導体の塩 を反応させることにより、式IIIのＬ−グアニジン吉草酸誘導体または該誘導体 の塩を調製する請求項５記載の方法。 ７．Ｌ−アルギニン誘導体または該誘導体の塩を−１０℃から１００℃までの 温度で反応させる請求項６記載の方法。 ８．式IIIのＬ−グアニジン吉草酸誘導体または該誘導体の塩を、クレブシエ ラ属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属またはアルトロバクター属の微 生物を用いて加水分解する請求項５ないし７のいずれか１項記載の方法。 ９．クレブシエラ・ニューモニア種ＤＳＭ 10593、アルトロバクターの種ＤＳ Ｍ 10582、アグロバクテリウム・ラディオバクター種、シュードモナス・セパシ ア種もしくはシュードモナス・アルギノーサ種ＤＳＭ 10581、またはこれらと機 能的に同等な変異体および突然変異体の微生物を用いて加水分解を行う請求項８ 記載の方法。 １０．加水分解をｐＨ５からｐＨ１３で行う請求項５ないし９のいずれか１項 記載の方法。 １１．式ＩＶのＬ−アミノ吉草酸誘導体を単離することなく環化を行う請求項 ５ないし１０のいずれか１項記載の方法。