JP3694065B2 - 環状Ｓ−α−アミノカルボン酸およびＲ−α−アミノカルボキサミドの生物工学的製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、一般式
【０００２】
【化６】

【０００３】
〔式中、Ａは、−ＮＨおよび−ＣＨ−とともに、場合により置換された、５員または６員の飽和複素環式環を形成する。〕
のラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態の、α−アミノカルボキサミドを唯一の窒素源として利用することができ、かつ、上に定義した式Ｉの（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミドを、一般式
【０００４】
【化７】

【０００５】
〔式中、Ａは前述した意味をもつ。〕
のＳ−α−アミノカルボン酸に転化する能力を有する新規な微生物に関する。
これらの微生物およびそれらの細胞を除いた酵素は、Ｓ−α−アミノカルボン酸（式II）および（または）一般式
【０００６】
【化８】

【０００７】
〔式中、Ａは前述した意味をもつ。〕
のＲ−α−アミノカルボキサミドを製造する新規な方法に使用される。
【０００８】
式IIのＳ−α−アミノカルボン酸、たとえばＳ−α−ピペコール酸は、多数の生物活性化合物、たとえば、チオリダジンまたはピプラドール（Ng-Youn-Chen et al., J. Org. Chem., Vol.59, No.8, 1994）を製造するための、重要な中間体である。
【０００９】
（ＲＳ）−ピペコール酸およびその誘導体のラセミ化合物の分割について、多数の化学的な方法に加えて、生物工学的なラセミ化合物分割法も知られている。たとえば、Huh et al.（Biosci., Biotech. Biochem., 56(12), 2081-2082)が、（ＲＳ）−ピペコール酸のラセミ化合物を、Ｒ−アミノ酸オキシダーゼを用いて分割する方法を記述している。 これは、Ｒ−異性体のΔ¹ −ピペリジン−２−カルボン酸への特殊な酸化、結果的としてＳ−ピペコール酸を与える酸化を意味する。 Δ¹−ピペリジン−２−カルボン酸の（ＲＳ)−ピペコール酸への化学的な還元の後、Ｒ−アミノ酸オキシダーゼを作用させれば、結果的に再びＳ−ピペコール酸になる。 これはＲ−ピペコール酸の含有量がたえず減少することを伴う。 これに類似のＳ−プロリンの製造方法が、J. Ferm. Bioeng., 74, 189-190, 1992 に記述されている。 しかしながら、これら二つの方法には、工業的な規模では実施可能でない、という不利益がある。 もうひとつの不利益は、精製したＲ−アミノ酸オキシダーゼを用いなければならないということである。
【００１０】
さらに、ラセミ体のピペコールエステルは、アスペルギルス・ニゲルから得られるリパーゼの作用により、Ｓ−ピペコール酸およびＲ−ピペコールエステル（Ng-Youn-Chenet al., 1994, ibid）に転化される。 しかしながら、この方法には、Ｓ−ピペコール酸がｅｅ＝９３％のエナンチオマー純度でしか得られないという不利益がある。
【００１１】
本発明の目的は、環状Ｓ−α−アミノカルボン酸を製造することができる、簡単で、工業的に実施可能な生物工学的製法であって、高いエナンチオマー純度で生成物を分離することができる製造方法を提供することにある。
【００１２】
この目的は、請求項１に記載の微生物を使用し、請求項５の方法を用いることにより達成される。
【００１３】
本発明の微生物は、土壌サンプル、汚泥または廃水から、常用の微生物学的技術の助けを借りて単離することができる。 これらの微生物は、本発明に従ってａ）α−アミノカルボキサミド（式Ｉ）をラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態で、唯一の窒素源として、適当な炭素源とともに含む培養基中で、常用の方法に従ってそれらの微生物を培養し、
ｂ）その後、培養により得られた培養物から、安定であって（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミド（式Ｉ）をＳ−α−アミノカルボン酸（式II）へ転化することができる微生物を選択すること、
によって単離される。
【００１４】
従って、これらとくにＳ−アミノ酸アミダーゼを含む微生物を、すべて使用することができる。 ピペラジンカルボキサミドまたはピペコールアミドを、ラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態で、唯一の窒素源として利用する微生物を選択することが望ましい。 とくに、Ｓ−ピペラジンカルボキサミドまたはＳ−ピペコールアミドを唯一の窒素源として利用する微生物を選択することが好ましい。
【００１５】
これら微生物は、炭素源として、たとえば、糖、シュガーアルコール、カルボン酸またはアルコールを、成長基として利用することができる。 使用できる糖は、ヘキソースたとえばグルコース、またはペントースである。 使用できるカルボン酸は、ジカルボン酸またはトリカルボン酸またはそれらの塩、たとえば、クエン酸またはコハク酸またはそれらの塩である。 アルコールとしては、三価アルコール、たとえばグリセロールを使用することができる。 グリセロールのような三価アルコールを炭素源として使用することが好ましい。
【００１６】
選択用培養基および培養基は、当業者が通常使用しているもの、たとえば、 Kulla et al（Arch. Microbiol., 135, 1-7, 1983)のミネラル塩基や、後に示す表１に掲げたものが使用可能である。 表１に掲げたものを使用することが好ましい。
【００１７】
微生物の活性酵素は、培養および選択の間に誘導されるのが好都合である。 酵素誘導物としては、たとえば、ピペラジンカルボキサミド、ピペコールアミドまたはアセトアミドを使用することができる。
【００１８】
培養および選択が好都合に行なわれるのは、温度は１５℃〜５０℃の範囲であって、２０℃〜４５℃が好ましく、ｐＨは５〜１０の間、とくに６〜９の間が好ましい。
【００１９】
特定のＳ−アミノ酸アミダーゼ活性をもつ好ましい微生物は、ピペラジンカルボキサミドを利用するクレブシエラ属の微生物で、とくに寄託番号ＤＳＭ９１７５およびＤＳＭ９１７６のクレブシエラ・ニューモニア種または寄託番号ＤＳＭ９１７４のクレブシエラ・テリゲナ種、ならびにそれらの機能的に等価の変種および突然変異種である。 これらの微生物は、ブダペスト条約に従い、ブラウンシュヴァイク Ｄ−３８１２４ マシェロダーヴェク １ｂ の、ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルトゥレン・ＧｍｂＨに、１９９４年４月２５日に寄託された。
【００２０】
さらに好適な微生物は、ピペコールアミドを利用するシュードモナス属の微生物で、とくに寄託番号ＤＳＭ９９２３のシュードモナス・プチダ種または寄託番号ＤＳＭ９９２４のシュードモナス・フルオレセンス種、ならびにそれらの機能的に等価の変種および突然変異種である。 これらの微生物は、ブダペスト条約に従い、ブラウンシュヴァイク Ｄ−３８１２４ マシェロダーヴェク １ｂ の、ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルトゥレン・ＧｍｂＨ に、１９９４年４月２０日に寄託された。
【００２１】
「機能的に等価の変種および突然変異種」の語句は、もとの微生物と同じ特性および機能を本質的にもつ微生物を意味する。 このタイプの変種および突然変異種は、偶然に、たとえばＵＶ照射によって生じる。
【００２２】
クレブシエラ・ニューモニアとして同定された微生物ＤＳＭ９１７５の科学的
な記述

【００２３】
クレブシエラ・ニューモニアとして同定された微生物ＤＳＭ９１７６の科学的
な記述

【００２４】
クレブシエラ・テリゲナとして同定された微生物ＤＳＭ９１７４の科学的な記
述

【００２５】
本発明の、一般式
【００２６】
【化９】

【００２７】
〔式中、Ａは前述した意味をもつ。〕
のＳ−α−アミノカルボン酸のおよび（または）一般式
【００２８】
【化１０】

【００２９】
〔式中、Ａは前述した意味をもつ。〕
のＲ−α−アミノカルボキサミドの製造方法は、一般式
【００３０】
【化１１】

【００３１】
〔式中、Ａは前述した意味をもつ。〕
の（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミド中のＳ−α−アミノカルボキサミドを、上に記述した特定の微生物を利用して、またはこれらの微生物からの細胞を除いた酵素を利用して、Ｓ−α−アミノカルボン酸に転化させ、生物的転換の結果である、Ｓ−α−アミノカルボン酸のみならず適切であれば単離されるＲ−α−アミノカルボキサミドをも含む生成物を分離することによって行なわれる。
【００３２】
一般式
【００３３】
【化１２】

【００３４】
〔式中、Ａは、−ＮＨおよび−ＣＨとともに、場合により置換された、５員または６員の飽和複素環式環を形成する。〕
の前駆体（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミドは、対応する芳香族アミドから、当業者には知られている水素化によって得ることができる。
【００３５】
使用することができる、一般式Ｉの５員または６員の飽和複素環式環をもつアミノカルボキサミドは、場合により置換されたプロリンアミド、ピラゾリジンカルボキサミド、イミダゾリジンカルボキサミド、オキサゾリジンカルボキサミド、イソキサゾリジンカルボキサミド、チアゾリジンカルボキサミドまたはトリアゾリジンカルボキサミドである。 インドリンアミドは、たとえば、置換されたプロリンアミドとして使用することができる。
【００３６】
使用することができる、一般式Ｉの５員または６員の飽和複素環式環をもつアミノカルボキサミドは、ピペラジンカルボキサミド、ピペコールアミド、モルフォリンカルボキサミド、パーヒドロキノリンカルボキサミド（キノリナンカルボキサミド）、パーヒドロイソキノリンカルボキサミド（イソキノリナンカルボキサミド）、パーヒドロキノキサリンカルボキサミド（キノキサリナンカルボキサミド）であり、それらは同様に場合により置換されている。 置換された５員または６員の飽和複素環式環をもつアミノカルボキサミドの代表例としては、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル置換、たとえば４−メチルピペコールアミド、Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂−置換、たとえば４−アミノメチルピペコールアミド、または４−シアノピペコールアミドのようなＣＮ置換が可能である。 ピペラジンカルボキサミド、ピペコールアミドまたは４−メチルピペコールアミドを使用することが好ましい。
【００３７】
細胞を含まないシステムの酵素は、当業者によく知られた微生物の破壊によって得ることができる。 この目的のために、たとえば、超音波、フレンチプレスまたはリゾチーム法を使用することが可能である。 これらの細胞を除いた酵素を、適切な担体上に固定することも可能である。
【００３８】
前述した特定の微生物でこの工程にとくに適切なものは、クレブシエラ・テリゲナ種（ＤＳＭ９１７４）、クレブシエラ・ニューモニア種（ＤＳＭ９１７５およびＤＳＭ９１７６）、シュードモナス・プチダ種（ＤＳＭ９９２３）およびシュードモナス・フルオレセンス種（ＤＳＭ９９２４）ならびにそれらの細胞を除いた酵素である。 この工程はとくに、クレブシエラ・テリゲナ種（ＤＳＭ９１７４)、クレブシエラ・ニューモニア種（ＤＳＭ９１７５およびＤＳＭ９１７６)で実施される。 同様に適切なのは、前述の微生物の機能的に等価な変種および突然変異種である。
【００３９】
生物的転換は、常法に従った微生物の培養の後で、休眠細胞（成長せず、また、もはや炭素またはエネルギー源を必要としなくなった細胞）または成長細胞を用いて実施される。
【００４０】
休眠細胞を用いる本プロセスの培養基としては、当業者に知られたもの、たとえば、前述の Kulla et al., 1983 (ibid)のミネラル塩、低モルリン酸塩緩衝液、HEPES 緩衝液または表１に記述した培養基を使用することができる。 通常、炭素源および窒素源を含む培養基、たとえば市場で手に入る培養基、または表１に掲げる培養基が、成長細胞を用いる本プロセスのために使用されている。 本プロセスは、表１に示した培養基で実施することが好ましい。
【００４１】
生物的転換は、（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミドを、培養基中の（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミドの濃度が２０％重量を超えないように、好ましくは１０％重量を超えないように、１回で、または連続的に添加して実施することが好ましい。
【００４２】
培養基のｐＨは、ｐＨ５〜１０の範囲で可能であり、好ましくはｐＨ７〜１０である。
【００４３】
生物的転換は、温度２５〜６５℃で実施するのが好都合であり、３０〜６０℃が好ましい。
【００４４】
通常の反応時間１〜１００時間の後、式ＩのＳ−α−アミノカルボキサミドは、完全にＳ−α−アミノカルボン酸に転化され、同様に生成するＲ−α−アミノカルボキサミドがこれに伴う。
【００４５】
この方法で得られるＳ−α−アミノカルボン酸および（または）Ｒ−α−アミノカルボキサミドは、常用の仕上げ方法、たとえば、酸性化、クロマトグラフィーまたは抽出によって分離することができる。
【００４６】
〔実施例〕
〔実施例１〕
ａ）ピペラジンカルボキサミドのラセミ体を唯一の窒素源として利用することができる微生物の単離
表１に示した組成の培養基１を使用し、ラセミピペラジンカルボキサミドを唯一の窒素源として利用することができる微生物を単離した。 この培養基１００mlを３００mlのエルレンマイヤーフラスコに容れ、ロンザＡＧの工場があるスイス国内のヴィスプ地域からの、種々の土壌サンプル（２ｇ）を加えた。 このフラスコを撹拌せずに５日間３０℃で培養した。 その後、この培養基Ａ１mlを、同じ培養基を容れた新しいフラスコに接種した。 このフラスコを引き続き同じ条件のもとで培養した。 この富化サイクルは、合計５回繰り返した。 富化物を寒天培養基（培養基Ａに１６ｇ／ｌ寒天培養基を添加したもの）上で画線培養し、ひとつのコロニーを得た。
【００４７】
単離した微生物を、立体選択的アミダーゼのための、下記の定量試験にかけてしらべた。 １箇のコロニーを使用して、３００mlのエルレンマイヤーフラスコ中の培養基Ａ１００mlに接種した。 これらのフラスコを、シェーカー上で３日間、３０℃で培養し、そのわずか１日後に培養物を完全に展開した。 細胞を除いた培養上澄み液は薄層クロマトグラフィーにかけて（シリカゲル、移動相：エタノール１１部、ＣＨＣｌ₃６部、ＮＨ₄ＯＨ（２５％）６部、ニンヒドリンを用いた検出）、ピペラジンカルボン酸およびピペラジンカルボキサミドの量を求めた。（ＲＳ）−ピペラジンカルボキサミドの使用量の半分を転化した微生物を生化学的な調査に使用し、どの株がＳ−特化アミダーゼを含むかを確認した。
【００４８】
ｂ）Ｓ−特化アミダーゼを与える微生物を同定する生化学的調査
タンパク質の粗生成抽出物を製造するために、細胞を１リットルの培養基Ａ中で３０℃で成長させ、採取して洗浄した。 細胞５ｇ（湿重量）を１０mlの６９ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０中に再懸濁し、ＦＲＥＮＣＨ（登録商標）プレスを用いて破壊した。 粗生成抽出物を、４０，０００Ｇで２時間、遠心分離機にかけ、いくつかの部分に分けて−２０℃で冷凍した。 立体選択性を決定するために、Ｒ−プロリンアミドおよびＳ−プロリンアミドの加水分解速度を比較した。 つぎの酵素分析をこの目的のために使用した：分析量１ml、６９ｍＭリン酸塩を含み、ｐＨ７．０、１００〜８００μｍのタンパク質粗生成抽出物、２mgのＳ−またはＲ−プロリンアミド・ＨＣｌ、培養時間１〜２４時間、培養温度３０℃、薄層クロマトグラフィー（上記参照）後のニンヒドリンを用いた検出。 これらＤＳＭ９１７４株、ＤＳＭ９１７５株およびＤＳＭ９１７６株のアミダーゼは、Ｒ−プロリンアミドをごくゆっくりと加水分解することがわかった。 これらの株を使用して、光学活性な環状α−アミノ酸誘導体を製造した。
【００４９】
ＤＳＭ９１７５株およびＤＳＭ９１７６株の粗生成抽出物が、同じ条件の下で、（ＲＳ）−ピペラジンカルボキサミドおよび（ＲＳ）−ピペコールアミドを加水分解した。 分析溶液の培養温度およびｐＨを変えることによって、アミダーゼの特定の活性は、温度３０〜６０℃およびｐＨ７〜１０の間で最高であったことが見出された。
【００５０】
表 １
培養基Ａ：
この培養基は、下記の最小限培養基を、２ｇ／ｌの（ＲＳ）−ピペラジンカルボキサミドおよび１０ｇの１０ｇ／ｌのグリセロールに加え混合することにより調整した。
培養基Ｂ：
この培養基は、下記の最小限培養基を、１ｇ／ｌの（ＲＳ）−ピペコールアミドおよび４ｇ／ｌのグルコースに加え混合することによって調整した。
最小限培養基：

【００５１】
〔実施例２〜４〕
Ｓ−ピペラジンカルボン酸の製造
ＤＳＭ９１７４株、ＤＳＭ９１７５株およびＤＳＭ９１７６株を用い、つぎの条件を選んでＳ−ピペラジンカルボン酸を製造した。 ｐＨコントロールユニットを備えた、作業容積が１リットルで容量が１．５リットルの発酵容器を使用して、生物的転換を行なった。 培養基Ａ中の発酵に当っては、グリセロールの量を３０ｇ／ｌに増加し、（ＲＳ）−ピペラジンカルボキサミドの量を２０ｇ／ｌに増加した。 細胞をｐＨ７．０、温度３０℃、通気率０．５ｌ／minで成長させた。 一例では（実施例４）、細胞を初めにこれらの条件のもとで１６時間成長させ、温度を４０℃に高め、培養基のｐＨを８．０まで高めた。 所定の時間が経過した後、生成したＳ−ピペラジンカルボン酸の量を薄層クロマトグラフィーで概算し、使用したおよそ半分のピペラジンカルボキサミドが反応したところで、発酵を３６〜７２時間後に停止した。 この時点では、細胞懸濁液の６５０ｎｍにおける光学密度は、６から１０の間であった。 Ｓ−ピペラジンカルボン酸を単離するために、細胞を除いた溶液を、減圧下に１００mlに濃縮した。 その溶液を、濃ＨＣｌを用いてｐＨ１．０まで酸性化し、酸をジハイドロクロライドとして沈殿させた。 単離した酸を０．１ＭＨＣｌ中で再結晶し、乾燥した。
生成した酸のｅｅ（エナンチオマーエクセス）を測定するために、酸を、はじめに２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアン酸塩を用いて誘導体にし、毛管電気泳動（毛管電気泳動の条件については表２を参照）によって分析した。 結果は表３に記載した。
【００５２】
表 ２
毛管電気泳動の条件

【００５３】
表 ３
実例例の株 粗生成物 再結晶物 収率 ｅｅ価
No.2 DSM9175 １２.８２ｇ １０.７４ｇ ６８.３％ ９９.６
No.3 DSM9174 １５.５３ｇ １３.１ ｇ ８３.３％ ９９.４
No.4 DSM9176 ２１.２３ｇ １１.３２ｇ ７２.０％ ９９.６。
【００５４】
〔実施例５〕
クレブシエラを用いたＳ−ピペコール酸の製造
ＤＳＭ９１７５およびＤＳＭ９１７６のクレブシエラ・ニューモニア株の休眠細胞は、２０ｇ／ｌの（ＲＳ）−ピペコールアミドを、４７℃、ｐＨ８.０で、（Ｓ）−酸に６時間以内に転化した。
【００５５】
この転化をクレブシエラ・ニューモニア株（ＤＳＭ９１７５）を用いて実施した場合には、Ｓ−ピペコール酸がｅｅ９６．５％で得られた。
【００５６】
〔実施例６〕
Ｓ−４−メチルピペコール酸の製造
この転化のために、ラセミ体の４−メチルピペコールアミド（基体物質）を、ＤＳＭ９１７５のクレブシエラ・ニューモニアまたはＤＳＭ９１７４のクレブシエラ・テリジナから得られるタンパク質粗生成抽出物を利用して、実施例１ｂに類似の方法で転化した。 ｐＨ８．０および４７℃で２４時間培養した後、０．２％濃度の培養基溶液中の、使用されたアミドの約５０％が転化した（ＴＬＣ分析で測定）。
【００５７】
〔実施例７〕
ピペコールアミドを唯一の窒素源として利用する微生物の単離
培養基Ｂ１００mlを３００mlのエルレンマイヤーフラスコに容れ、土壌サンプルをおよそ２ｇ加えた。 このフラスコを、撹拌せずに室温で３日間培養した。
【００５８】
その後、同じ培養基を容れた新しいフラスコに、上述の培養基のうち２mlを移し、撹拌せずに３０℃で４日間培養した。 この富化サイクルを、合計３回繰り返し、最後の２回のサイクルは滅菌条件のもとで実施した。 最終の工程を、シェーカー上で１４０ｒｐｍで、追加的に実施した。 その後、その富化物を、寒天培養基（培養基Ｂに１６ｇ／ｌ寒天培養基を添加したもの）上で画線培養し、ひとつのコロニーを得た。 （ＲＳ）−ピペコールアミドをピペコール酸に転化する特性が安定しているコロニーを選択した。 この目的のために、培養物を栄養寒天培養基上で画線培養し、２〜３日間成長させた後、再び栄養寒天培養基板からピペコールアミド／グルコース板上に画線培養した。 グラム染色および２０ＮＥ−ＡＰＩ片を用いたオキシダーゼ試験の後、所要の安定した特性を見せた二つの株を特定した。 二つのシュードモナス種が特定された：ＤＳＭ９９２３のシュードモナス・プチダおよびＤＳＭ９９２４のシュードモナス・フルオレセンス。
【００５９】
〔実施例８〕
Ｓ−ピペコール酸の製造
実施例７で単離した株を使用して、１％のピペコールアミドの生物的転換（培養基濃度１％）を、０．１ｍＭリン酸塩緩衝液中で、ｐＨ７．０、３０℃、１３０ｒｐｍで実施した。 前培養物のバイオマスを濃縮し、ｐＨ７.０の０.１Ｍリン酸塩緩衝液中に取り入れ、バイオマス濃度ＯＤ_650nm ＝１０を得た。 その混合物を、シェーカー上１３０ｒｐｍで、３０℃において培養し、種々の時間においてサンプルを取り出した。 細胞を除いた上澄み液は薄層クロマトグラフィーにかけ（シリカゲル、移動相：エタノール１１部、ＣＨＣｌ₃６部、２５％ＮＨ₄ＯＨ６部）、残りのアミドおよび形成されたピペコール酸の量を測定した。 その後、細胞を除いた上澄み液は、ＨＰＣＬ測定（イソチオシアン酸塩誘導）にかけ、生成したピペコール酸のエナンチオマー純度を調べた。 シュードモナス・プチダおよびシュードモナス・フルオレセンスが、Ｓ−ピペコール酸を９０％以上の光学的純度で産出した、という結果が得られた。 シュードモナス・プチダの生物的転換の最適条件は、ｐＨ８．０、温度３０℃、また、シュードモナス・フルオレセンスはｐＨ８．０で５０℃であった。 シュードモナス・プチダで生物的転換を実施したとき、Ｓ−ピペコール酸がｅｅ９５％で得られ、シュードモナス・フルオレセンスで生物的転換を実施したときは、Ｓ−ピペコール酸がｅｅ９７．３％で得られた。
【００６０】
〔実施例９〕
Ｓ−ピペラジンカルボン酸の製造
実施例７で記述した、ピペコールアミド生産のための２種の単離された株を使用して、１％のピペラジンカルボキサミドの生物的転換を、ｐＨ７．０、３０℃、１３０ｒｐｍで実施した。 細胞を除いた上澄み液を同様に薄層クロマトグラフィーにかけて、残存するピペラジンカルボキサミドおよび生成したピペラジンカルボン酸の量を測定した。 ＨＰＣＬ分析でピペラジンカルボン酸の光学的純度を調べた。 シュードモナス・プチダで生物的転換を実施した場合は、Ｓ−ピペラジンカルボン酸がｅｅ７３．９％で得られ、シュードモナス・フルオレセンスで生物的転換を実施した場合は、Ｓ−ピペラジンカルボン酸がｅｅ５９．５％で得られた。

Claims (9)

1. 一般式
   

   

   ［式中、Ａは、−ＮＨおよび−ＣＨとともに、５員または６員の飽和複素環式環を形成する。］のラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態のα−アミノカルボキサミドを唯一の窒素源として利用することができ、かつ、上に定義した式Ｉの（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミドを、一般式
   

   

   ［式中、Ａは前述の意味をもつ。］のＳ−α−アミノカルボン酸に転化する能力を有することを特徴とする微生物であって、シュードモナス・プチダ種、シュードモナス・フルオレセンス種、クレブシエラ・テリゲナ種、およびクレブシエラ・ニューモニア種からなる群より選択される微生物。
2. ラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態のピペコールアミドまたはピペラジンカルボキサミドを、唯一の窒素源として利用することができる請求項１の微生物。
3. 一般式
   

   

   ［式中、Ａは前述した意味をもつ。］のＳ−α−アミノカルボン酸および（または）一般式
   

   

   ［式中、Ａは前述した意味をもつ。］のＲ−α−アミノカルボキサミドの製造方法であって、
   一般式
   

   

   ［式中、Ａは前述した意味をもつ。］の（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミド中のＳ−α−アミノカルボキサミドを、請求項１に記載の微生物を利用して、またはそれら微生物からの細胞を除いた酵素を利用して、Ｓ−α−アミノカルボン酸に転化させ、Ｓ−α−アミノカルボン酸および（または）Ｒ−α−アミノカルボキサミドを分離することを特徴とする製造方法。
4. （ＲＳ）−ピペコールアミド、（ＲＳ）−ピペラジンカルボキサミド、（ＲＳ）−４−メチルピぺコールアミドまたは（ＲＳ）−プロリンアミドを、（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミドとして使用することを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
5. 生物的転換を、（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミドを、培養基中の（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミドの濃度が２０％重量を超えないように、１回で、または連続的に添加して実施することを特徴とする請求項３または４に記載の製造方法。
6. 生物的転換をｐＨ７〜１０、温度３０〜６０℃で実施することを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. ａ）一般式
   

   

   ［式中、Ａは、−ＮＨおよび−ＣＨとともに、５員または６員の飽和複素環式環を形成する。］のラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態のα−アミノカルボキサミドを、唯一の窒素源として、適当な炭素源とともに含む培養基中で、天然源由来の微生物を培養し
   、
   ｂ）その後、培養により得られた培養物から、上に定義した式Ｉの（ＲＳ）−α−アミノカルボキサミドを、一般式
   

   

   ［式中、Ａは前述の意味をもつ。］のＳ−α−アミノカルボン酸に転化することができる微生物を選択すること
   によって単離される微生物であって、シュードモナス・プチダ種、シュードモナス・フルオレセンス種、クレブシエラ・テリゲナ種、およびクレブシエラ・ニューモニア種から成る群より選択される微生物。
8. ラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態のピペコールアミドまたはピペラジンカルボキサミドを、唯一の窒素源として利用することができ、かつ安定である、請求項７に記載の微生物。
9. シュードモナス・プチダ種（受託番号ＤＳＭ９９２３）、シュードモナス・フルオレセンス種（受託番号ＤＳＭ９９２４）、クレブシエラ・テリゲナ種（受託番号ＤＳＭ９１７４）、およびクレブシエラ・ニューモニア種（受託番号ＤＳＭ９１７５および９１７６）からなる群より選択される、請求項１または７に記載の微生物。