JP3694065B2 - 環状S−α−アミノカルボン酸およびR−α−アミノカルボキサミドの生物工学的製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、一般式
【0002】
【化6】
【0003】
〔式中、Aは、−NHおよび−CH−とともに、場合により置換された、5員または6員の飽和複素環式環を形成する。〕
のラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態の、α−アミノカルボキサミドを唯一の窒素源として利用することができ、かつ、上に定義した式Iの(RS)−α−アミノカルボキサミドを、一般式
【0004】
【化7】
【0005】
〔式中、Aは前述した意味をもつ。〕
のS−α−アミノカルボン酸に転化する能力を有する新規な微生物に関する。
これらの微生物およびそれらの細胞を除いた酵素は、S−α−アミノカルボン酸(式II)および(または)一般式
【0006】
【化8】
【0007】
〔式中、Aは前述した意味をもつ。〕
のR−α−アミノカルボキサミドを製造する新規な方法に使用される。
【0008】
式IIのS−α−アミノカルボン酸、たとえばS−α−ピペコール酸は、多数の生物活性化合物、たとえば、チオリダジンまたはピプラドール(Ng-Youn-Chen et al., J. Org. Chem., Vol.59, No.8, 1994)を製造するための、重要な中間体である。
【0009】
(RS)−ピペコール酸およびその誘導体のラセミ化合物の分割について、多数の化学的な方法に加えて、生物工学的なラセミ化合物分割法も知られている。たとえば、Huh et al.(Biosci., Biotech. Biochem., 56(12), 2081-2082)が、(RS)−ピペコール酸のラセミ化合物を、R−アミノ酸オキシダーゼを用いて分割する方法を記述している。 これは、R−異性体のΔ1 −ピペリジン−2−カルボン酸への特殊な酸化、結果的としてS−ピペコール酸を与える酸化を意味する。 Δ1−ピペリジン−2−カルボン酸の(RS)−ピペコール酸への化学的な還元の後、R−アミノ酸オキシダーゼを作用させれば、結果的に再びS−ピペコール酸になる。 これはR−ピペコール酸の含有量がたえず減少することを伴う。 これに類似のS−プロリンの製造方法が、J. Ferm. Bioeng., 74, 189-190, 1992 に記述されている。 しかしながら、これら二つの方法には、工業的な規模では実施可能でない、という不利益がある。 もうひとつの不利益は、精製したR−アミノ酸オキシダーゼを用いなければならないということである。
【0010】
さらに、ラセミ体のピペコールエステルは、アスペルギルス・ニゲルから得られるリパーゼの作用により、S−ピペコール酸およびR−ピペコールエステル(Ng-Youn-Chenet al., 1994, ibid)に転化される。 しかしながら、この方法には、S−ピペコール酸がee=93%のエナンチオマー純度でしか得られないという不利益がある。
【0011】
本発明の目的は、環状S−α−アミノカルボン酸を製造することができる、簡単で、工業的に実施可能な生物工学的製法であって、高いエナンチオマー純度で生成物を分離することができる製造方法を提供することにある。
【0012】
この目的は、請求項1に記載の微生物を使用し、請求項5の方法を用いることにより達成される。
【0013】
本発明の微生物は、土壌サンプル、汚泥または廃水から、常用の微生物学的技術の助けを借りて単離することができる。 これらの微生物は、本発明に従ってa)α−アミノカルボキサミド(式I)をラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態で、唯一の窒素源として、適当な炭素源とともに含む培養基中で、常用の方法に従ってそれらの微生物を培養し、
b)その後、培養により得られた培養物から、安定であって(RS)−α−アミノカルボキサミド(式I)をS−α−アミノカルボン酸(式II)へ転化することができる微生物を選択すること、
によって単離される。
【0014】
従って、これらとくにS−アミノ酸アミダーゼを含む微生物を、すべて使用することができる。 ピペラジンカルボキサミドまたはピペコールアミドを、ラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態で、唯一の窒素源として利用する微生物を選択することが望ましい。 とくに、S−ピペラジンカルボキサミドまたはS−ピペコールアミドを唯一の窒素源として利用する微生物を選択することが好ましい。
【0015】
これら微生物は、炭素源として、たとえば、糖、シュガーアルコール、カルボン酸またはアルコールを、成長基として利用することができる。 使用できる糖は、ヘキソースたとえばグルコース、またはペントースである。 使用できるカルボン酸は、ジカルボン酸またはトリカルボン酸またはそれらの塩、たとえば、クエン酸またはコハク酸またはそれらの塩である。 アルコールとしては、三価アルコール、たとえばグリセロールを使用することができる。 グリセロールのような三価アルコールを炭素源として使用することが好ましい。
【0016】
選択用培養基および培養基は、当業者が通常使用しているもの、たとえば、 Kulla et al(Arch. Microbiol., 135, 1-7, 1983)のミネラル塩基や、後に示す表1に掲げたものが使用可能である。 表1に掲げたものを使用することが好ましい。
【0017】
微生物の活性酵素は、培養および選択の間に誘導されるのが好都合である。 酵素誘導物としては、たとえば、ピペラジンカルボキサミド、ピペコールアミドまたはアセトアミドを使用することができる。
【0018】
培養および選択が好都合に行なわれるのは、温度は15℃〜50℃の範囲であって、20℃〜45℃が好ましく、pHは5〜10の間、とくに6〜9の間が好ましい。
【0019】
特定のS−アミノ酸アミダーゼ活性をもつ好ましい微生物は、ピペラジンカルボキサミドを利用するクレブシエラ属の微生物で、とくに寄託番号DSM9175およびDSM9176のクレブシエラ・ニューモニア種または寄託番号DSM9174のクレブシエラ・テリゲナ種、ならびにそれらの機能的に等価の変種および突然変異種である。 これらの微生物は、ブダペスト条約に従い、ブラウンシュヴァイク D−38124 マシェロダーヴェク 1b の、ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルトゥレン・GmbHに、1994年4月25日に寄託された。
【0020】
さらに好適な微生物は、ピペコールアミドを利用するシュードモナス属の微生物で、とくに寄託番号DSM9923のシュードモナス・プチダ種または寄託番号DSM9924のシュードモナス・フルオレセンス種、ならびにそれらの機能的に等価の変種および突然変異種である。 これらの微生物は、ブダペスト条約に従い、ブラウンシュヴァイク D−38124 マシェロダーヴェク 1b の、ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルトゥレン・GmbH に、1994年4月20日に寄託された。
【0021】
「機能的に等価の変種および突然変異種」の語句は、もとの微生物と同じ特性および機能を本質的にもつ微生物を意味する。 このタイプの変種および突然変異種は、偶然に、たとえばUV照射によって生じる。
【0022】
クレブシエラ・ニューモニアとして同定された微生物DSM9175の科学的
な記述
【0023】
クレブシエラ・ニューモニアとして同定された微生物DSM9176の科学的
な記述
【0024】
クレブシエラ・テリゲナとして同定された微生物DSM9174の科学的な記
述
【0025】
本発明の、一般式
【0026】
【化9】
【0027】
〔式中、Aは前述した意味をもつ。〕
のS−α−アミノカルボン酸のおよび(または)一般式
【0028】
【化10】
【0029】
〔式中、Aは前述した意味をもつ。〕
のR−α−アミノカルボキサミドの製造方法は、一般式
【0030】
【化11】
【0031】
〔式中、Aは前述した意味をもつ。〕
の(RS)−α−アミノカルボキサミド中のS−α−アミノカルボキサミドを、上に記述した特定の微生物を利用して、またはこれらの微生物からの細胞を除いた酵素を利用して、S−α−アミノカルボン酸に転化させ、生物的転換の結果である、S−α−アミノカルボン酸のみならず適切であれば単離されるR−α−アミノカルボキサミドをも含む生成物を分離することによって行なわれる。
【0032】
一般式
【0033】
【化12】
【0034】
〔式中、Aは、−NHおよび−CHとともに、場合により置換された、5員または6員の飽和複素環式環を形成する。〕
の前駆体(RS)−α−アミノカルボキサミドは、対応する芳香族アミドから、当業者には知られている水素化によって得ることができる。
【0035】
使用することができる、一般式Iの5員または6員の飽和複素環式環をもつアミノカルボキサミドは、場合により置換されたプロリンアミド、ピラゾリジンカルボキサミド、イミダゾリジンカルボキサミド、オキサゾリジンカルボキサミド、イソキサゾリジンカルボキサミド、チアゾリジンカルボキサミドまたはトリアゾリジンカルボキサミドである。 インドリンアミドは、たとえば、置換されたプロリンアミドとして使用することができる。
【0036】
使用することができる、一般式Iの5員または6員の飽和複素環式環をもつアミノカルボキサミドは、ピペラジンカルボキサミド、ピペコールアミド、モルフォリンカルボキサミド、パーヒドロキノリンカルボキサミド(キノリナンカルボキサミド)、パーヒドロイソキノリンカルボキサミド(イソキノリナンカルボキサミド)、パーヒドロキノキサリンカルボキサミド(キノキサリナンカルボキサミド)であり、それらは同様に場合により置換されている。 置換された5員または6員の飽和複素環式環をもつアミノカルボキサミドの代表例としては、C1〜C4−アルキル置換、たとえば4−メチルピペコールアミド、H2N−CH2−置換、たとえば4−アミノメチルピペコールアミド、または4−シアノピペコールアミドのようなCN置換が可能である。 ピペラジンカルボキサミド、ピペコールアミドまたは4−メチルピペコールアミドを使用することが好ましい。
【0037】
細胞を含まないシステムの酵素は、当業者によく知られた微生物の破壊によって得ることができる。 この目的のために、たとえば、超音波、フレンチプレスまたはリゾチーム法を使用することが可能である。 これらの細胞を除いた酵素を、適切な担体上に固定することも可能である。
【0038】
前述した特定の微生物でこの工程にとくに適切なものは、クレブシエラ・テリゲナ種(DSM9174)、クレブシエラ・ニューモニア種(DSM9175およびDSM9176)、シュードモナス・プチダ種(DSM9923)およびシュードモナス・フルオレセンス種(DSM9924)ならびにそれらの細胞を除いた酵素である。 この工程はとくに、クレブシエラ・テリゲナ種(DSM9174)、クレブシエラ・ニューモニア種(DSM9175およびDSM9176)で実施される。 同様に適切なのは、前述の微生物の機能的に等価な変種および突然変異種である。
【0039】
生物的転換は、常法に従った微生物の培養の後で、休眠細胞(成長せず、また、もはや炭素またはエネルギー源を必要としなくなった細胞)または成長細胞を用いて実施される。
【0040】
休眠細胞を用いる本プロセスの培養基としては、当業者に知られたもの、たとえば、前述の Kulla et al., 1983 (ibid)のミネラル塩、低モルリン酸塩緩衝液、HEPES 緩衝液または表1に記述した培養基を使用することができる。 通常、炭素源および窒素源を含む培養基、たとえば市場で手に入る培養基、または表1に掲げる培養基が、成長細胞を用いる本プロセスのために使用されている。 本プロセスは、表1に示した培養基で実施することが好ましい。
【0041】
生物的転換は、(RS)−α−アミノカルボキサミドを、培養基中の(RS)−α−アミノカルボキサミドの濃度が20%重量を超えないように、好ましくは10%重量を超えないように、1回で、または連続的に添加して実施することが好ましい。
【0042】
培養基のpHは、pH5〜10の範囲で可能であり、好ましくはpH7〜10である。
【0043】
生物的転換は、温度25〜65℃で実施するのが好都合であり、30〜60℃が好ましい。
【0044】
通常の反応時間1〜100時間の後、式IのS−α−アミノカルボキサミドは、完全にS−α−アミノカルボン酸に転化され、同様に生成するR−α−アミノカルボキサミドがこれに伴う。
【0045】
この方法で得られるS−α−アミノカルボン酸および(または)R−α−アミノカルボキサミドは、常用の仕上げ方法、たとえば、酸性化、クロマトグラフィーまたは抽出によって分離することができる。
【0046】
〔実施例〕
〔実施例1〕
a)ピペラジンカルボキサミドのラセミ体を唯一の窒素源として利用することができる微生物の単離
表1に示した組成の培養基1を使用し、ラセミピペラジンカルボキサミドを唯一の窒素源として利用することができる微生物を単離した。 この培養基100mlを300mlのエルレンマイヤーフラスコに容れ、ロンザAGの工場があるスイス国内のヴィスプ地域からの、種々の土壌サンプル(2g)を加えた。 このフラスコを撹拌せずに5日間30℃で培養した。 その後、この培養基A1mlを、同じ培養基を容れた新しいフラスコに接種した。 このフラスコを引き続き同じ条件のもとで培養した。 この富化サイクルは、合計5回繰り返した。 富化物を寒天培養基(培養基Aに16g/l寒天培養基を添加したもの)上で画線培養し、ひとつのコロニーを得た。
【0047】
単離した微生物を、立体選択的アミダーゼのための、下記の定量試験にかけてしらべた。 1箇のコロニーを使用して、300mlのエルレンマイヤーフラスコ中の培養基A100mlに接種した。 これらのフラスコを、シェーカー上で3日間、30℃で培養し、そのわずか1日後に培養物を完全に展開した。 細胞を除いた培養上澄み液は薄層クロマトグラフィーにかけて(シリカゲル、移動相:エタノール11部、CHCl36部、NH4OH(25%)6部、ニンヒドリンを用いた検出)、ピペラジンカルボン酸およびピペラジンカルボキサミドの量を求めた。(RS)−ピペラジンカルボキサミドの使用量の半分を転化した微生物を生化学的な調査に使用し、どの株がS−特化アミダーゼを含むかを確認した。
【0048】
b)S−特化アミダーゼを与える微生物を同定する生化学的調査
タンパク質の粗生成抽出物を製造するために、細胞を1リットルの培養基A中で30℃で成長させ、採取して洗浄した。 細胞5g(湿重量)を10mlの69mMリン酸塩緩衝液、pH7.0中に再懸濁し、FRENCH(登録商標)プレスを用いて破壊した。 粗生成抽出物を、40,000Gで2時間、遠心分離機にかけ、いくつかの部分に分けて−20℃で冷凍した。 立体選択性を決定するために、R−プロリンアミドおよびS−プロリンアミドの加水分解速度を比較した。 つぎの酵素分析をこの目的のために使用した:分析量1ml、69mMリン酸塩を含み、pH7.0、100〜800μmのタンパク質粗生成抽出物、2mgのS−またはR−プロリンアミド・HCl、培養時間1〜24時間、培養温度30℃、薄層クロマトグラフィー(上記参照)後のニンヒドリンを用いた検出。 これらDSM9174株、DSM9175株およびDSM9176株のアミダーゼは、R−プロリンアミドをごくゆっくりと加水分解することがわかった。 これらの株を使用して、光学活性な環状α−アミノ酸誘導体を製造した。
【0049】
DSM9175株およびDSM9176株の粗生成抽出物が、同じ条件の下で、(RS)−ピペラジンカルボキサミドおよび(RS)−ピペコールアミドを加水分解した。 分析溶液の培養温度およびpHを変えることによって、アミダーゼの特定の活性は、温度30〜60℃およびpH7〜10の間で最高であったことが見出された。
【0050】
表 1
培養基A:
この培養基は、下記の最小限培養基を、2g/lの(RS)−ピペラジンカルボキサミドおよび10gの10g/lのグリセロールに加え混合することにより調整した。
培養基B:
この培養基は、下記の最小限培養基を、1g/lの(RS)−ピペコールアミドおよび4g/lのグルコースに加え混合することによって調整した。
最小限培養基:
【0051】
〔実施例2〜4〕
S−ピペラジンカルボン酸の製造
DSM9174株、DSM9175株およびDSM9176株を用い、つぎの条件を選んでS−ピペラジンカルボン酸を製造した。 pHコントロールユニットを備えた、作業容積が1リットルで容量が1.5リットルの発酵容器を使用して、生物的転換を行なった。 培養基A中の発酵に当っては、グリセロールの量を30g/lに増加し、(RS)−ピペラジンカルボキサミドの量を20g/lに増加した。 細胞をpH7.0、温度30℃、通気率0.5l/minで成長させた。 一例では(実施例4)、細胞を初めにこれらの条件のもとで16時間成長させ、温度を40℃に高め、培養基のpHを8.0まで高めた。 所定の時間が経過した後、生成したS−ピペラジンカルボン酸の量を薄層クロマトグラフィーで概算し、使用したおよそ半分のピペラジンカルボキサミドが反応したところで、発酵を36〜72時間後に停止した。 この時点では、細胞懸濁液の650nmにおける光学密度は、6から10の間であった。 S−ピペラジンカルボン酸を単離するために、細胞を除いた溶液を、減圧下に100mlに濃縮した。 その溶液を、濃HClを用いてpH1.0まで酸性化し、酸をジハイドロクロライドとして沈殿させた。 単離した酸を0.1MHCl中で再結晶し、乾燥した。
生成した酸のee(エナンチオマーエクセス)を測定するために、酸を、はじめに2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルイソチオシアン酸塩を用いて誘導体にし、毛管電気泳動(毛管電気泳動の条件については表2を参照)によって分析した。 結果は表3に記載した。
【0052】
表 2
毛管電気泳動の条件
【0053】
表 3
実例例の株 粗生成物 再結晶物 収率 ee価
No.2 DSM9175 12.82g 10.74g 68.3% 99.6
No.3 DSM9174 15.53g 13.1 g 83.3% 99.4
No.4 DSM9176 21.23g 11.32g 72.0% 99.6。
【0054】
〔実施例5〕
クレブシエラを用いたS−ピペコール酸の製造
DSM9175およびDSM9176のクレブシエラ・ニューモニア株の休眠細胞は、20g/lの(RS)−ピペコールアミドを、47℃、pH8.0で、(S)−酸に6時間以内に転化した。
【0055】
この転化をクレブシエラ・ニューモニア株(DSM9175)を用いて実施した場合には、S−ピペコール酸がee96.5%で得られた。
【0056】
〔実施例6〕
S−4−メチルピペコール酸の製造
この転化のために、ラセミ体の4−メチルピペコールアミド(基体物質)を、DSM9175のクレブシエラ・ニューモニアまたはDSM9174のクレブシエラ・テリジナから得られるタンパク質粗生成抽出物を利用して、実施例1bに類似の方法で転化した。 pH8.0および47℃で24時間培養した後、0.2%濃度の培養基溶液中の、使用されたアミドの約50%が転化した(TLC分析で測定)。
【0057】
〔実施例7〕
ピペコールアミドを唯一の窒素源として利用する微生物の単離
培養基B100mlを300mlのエルレンマイヤーフラスコに容れ、土壌サンプルをおよそ2g加えた。 このフラスコを、撹拌せずに室温で3日間培養した。
【0058】
その後、同じ培養基を容れた新しいフラスコに、上述の培養基のうち2mlを移し、撹拌せずに30℃で4日間培養した。 この富化サイクルを、合計3回繰り返し、最後の2回のサイクルは滅菌条件のもとで実施した。 最終の工程を、シェーカー上で140rpmで、追加的に実施した。 その後、その富化物を、寒天培養基(培養基Bに16g/l寒天培養基を添加したもの)上で画線培養し、ひとつのコロニーを得た。 (RS)−ピペコールアミドをピペコール酸に転化する特性が安定しているコロニーを選択した。 この目的のために、培養物を栄養寒天培養基上で画線培養し、2〜3日間成長させた後、再び栄養寒天培養基板からピペコールアミド/グルコース板上に画線培養した。 グラム染色および20NE−API片を用いたオキシダーゼ試験の後、所要の安定した特性を見せた二つの株を特定した。 二つのシュードモナス種が特定された:DSM9923のシュードモナス・プチダおよびDSM9924のシュードモナス・フルオレセンス。
【0059】
〔実施例8〕
S−ピペコール酸の製造
実施例7で単離した株を使用して、1%のピペコールアミドの生物的転換(培養基濃度1%)を、0.1mMリン酸塩緩衝液中で、pH7.0、30℃、130rpmで実施した。 前培養物のバイオマスを濃縮し、pH7.0の0.1Mリン酸塩緩衝液中に取り入れ、バイオマス濃度OD650nm =10を得た。 その混合物を、シェーカー上130rpmで、30℃において培養し、種々の時間においてサンプルを取り出した。 細胞を除いた上澄み液は薄層クロマトグラフィーにかけ(シリカゲル、移動相:エタノール11部、CHCl36部、25%NH4OH6部)、残りのアミドおよび形成されたピペコール酸の量を測定した。 その後、細胞を除いた上澄み液は、HPCL測定(イソチオシアン酸塩誘導)にかけ、生成したピペコール酸のエナンチオマー純度を調べた。 シュードモナス・プチダおよびシュードモナス・フルオレセンスが、S−ピペコール酸を90%以上の光学的純度で産出した、という結果が得られた。 シュードモナス・プチダの生物的転換の最適条件は、pH8.0、温度30℃、また、シュードモナス・フルオレセンスはpH8.0で50℃であった。 シュードモナス・プチダで生物的転換を実施したとき、S−ピペコール酸がee95%で得られ、シュードモナス・フルオレセンスで生物的転換を実施したときは、S−ピペコール酸がee97.3%で得られた。
【0060】
〔実施例9〕
S−ピペラジンカルボン酸の製造
実施例7で記述した、ピペコールアミド生産のための2種の単離された株を使用して、1%のピペラジンカルボキサミドの生物的転換を、pH7.0、30℃、130rpmで実施した。 細胞を除いた上澄み液を同様に薄層クロマトグラフィーにかけて、残存するピペラジンカルボキサミドおよび生成したピペラジンカルボン酸の量を測定した。 HPCL分析でピペラジンカルボン酸の光学的純度を調べた。 シュードモナス・プチダで生物的転換を実施した場合は、S−ピペラジンカルボン酸がee73.9%で得られ、シュードモナス・フルオレセンスで生物的転換を実施した場合は、S−ピペラジンカルボン酸がee59.5%で得られた。
Claims (9)
- ラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態のピペコールアミドまたはピペラジンカルボキサミドを、唯一の窒素源として利用することができる請求項1の微生物。
- (RS)−ピペコールアミド、(RS)−ピペラジンカルボキサミド、(RS)−4−メチルピぺコールアミドまたは(RS)−プロリンアミドを、(RS)−α−アミノカルボキサミドとして使用することを特徴とする請求項3に記載の製造方法。
- 生物的転換を、(RS)−α−アミノカルボキサミドを、培養基中の(RS)−α−アミノカルボキサミドの濃度が20%重量を超えないように、1回で、または連続的に添加して実施することを特徴とする請求項3または4に記載の製造方法。
- 生物的転換をpH7〜10、温度30〜60℃で実施することを特徴とする請求項3〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- a)一般式
、
b)その後、培養により得られた培養物から、上に定義した式Iの(RS)−α−アミノカルボキサミドを、一般式
によって単離される微生物であって、シュードモナス・プチダ種、シュードモナス・フルオレセンス種、クレブシエラ・テリゲナ種、およびクレブシエラ・ニューモニア種から成る群より選択される微生物。 - ラセミ化合物またはその光学活性異性体の形態のピペコールアミドまたはピペラジンカルボキサミドを、唯一の窒素源として利用することができ、かつ安定である、請求項7に記載の微生物。
- シュードモナス・プチダ種(受託番号DSM9923)、シュードモナス・フルオレセンス種(受託番号DSM9924)、クレブシエラ・テリゲナ種(受託番号DSM9174)、およびクレブシエラ・ニューモニア種(受託番号DSM9175および9176)からなる群より選択される、請求項1または7に記載の微生物。
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