KR0122284B1 - 내열성 d-히단토이나제 활성을 갖는 신규 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 약 55℃ 이상의 온도에서도 안정된 D-히단토이나제 활성을 갖는 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1을 제공한다.

Description

내열성 D-히단토이나제 활성을 갖는 신규 미생물

본 발명은 내열성 D-히단토이나제 활성을 갖는 신규 미생물 및 이를 이용한 D-아미노산의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 말하자면, 본 발명은 내열성 D-히단토이나제 활성을 갖는 바실러스 스티아로더모필러스(Bacillus stearothermo philus) 종의 고온성 신규 미생물 및 이 미생물을 이용하여 히단토인 유도체를 N-카르바모일-D-아미노산으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.

히단토인 유도체들은 히단토인 고리의 5번 탄소에 파라-히드록시페닐, 이소프로필 등이 치환된 물질로서 부허러-버어그(Bucherer-Berg)의 방법 등에 의해 유기 합성된다. 이러한 5-일치환 히단토인 유도체의 3번 질소와 4번 탄소 사이의 아미드 결합을 미생물 등 유래의 D-히단토이나제로 가수 분해하여 N-카르바모일-D-아미노산으로 전환시킨 후 화학적 또는 효소적 방법으로 N-카르바모일기를 제거시킴으로써 D-아미노산을 얻을 수 있다. D-아미노산은 기질인 히단토인 유도체의 종류에 따라 D-파라-히드록시페닐글리신, D-발린 등일 수 있다[C. Syldatk, A., R., H,, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 41 : 29(1990) 참조]. 이와 같이 하여 제조되는 D-아미노산은 의약품 원료, 식품 첨가물, 농약 등의 합성에 있어서 단위 구조체로서 산업적으로 널리 이용되고 있다.

D-아미노산의 제조에 이용되는 D-히단토이나제의 활성은 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에어로박터(Aerobacter) 속, 코리네박테리엄(Corynebacterium) 속, 스트렙토미세스(Streptomyces) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 아그로박테리엄(Agrobacterium) 속, 아트로박터(Arthrobacter) 속 등의 여러 미생물에서 발견되었으며[H. Yamada, S. Takahashi, Y. Kii, H. Kumagai, J. Ferment. Technol. 56 : 484 (1978); S. Takahashi, Y. Kii, H. Kumagai, H. Yamada, J. Ferment. Technol., 57 : 328(1979); H. Yamada et al., Biochimie, 62 : 395(1980); R. Olivieri, E. Fascetti, L. Angelini, L. Degen, Enzyme Microb. Technol., 1 : 201(1979); A., C. Syldatk, M. Schulze, F. Wagner, Enzyme Microb. Technol., 10 : 618(1988) 참조], 이들 각 균주의 D-히단토이나제가 분리 정제되어 각각의 효소의 특성이 밝혀지고 있다[A. Morin, W. Hummel, H., MR. Kular, Biotechnol. Appl. Biochem. 8 : 564(1986); K. Yokozeki, K. Kubota, Agric. Biol. Chem., 51 : 721(1987); A., C. Syldatk, M. Schulze, F. Wagner, Enzyme Microb. Technol., 10 : 618(1988)].

상기 D-아미노산 제조방법에 있어서 기질로 사용되는 히단토인 유도체들은 대부분이 수용액 중에서의 용해도가 낮은데, 이는 효과적인 효소 반응 및 연속 공정을 수행하는데 장해가 되고 있다. 효소 반응을 효과적으로 진행시키기 위해 기질의 용해도를 증가시키는 방법으로는, 효소 반응계에 유기 용매 등을 첨가하거나[S. J. Osborne, J. Leaver, et al., Enzyme Microb. Technol., 12 : 281(1990) 참조], 반응 온도를 높이는 것을 들 수 있다. 후자의 경우, 공정의 경제성을 고려할 때, 높은 열안정성 및 역가를 갖는 D-히단토이나제가 요구되고 있으며, 이를 위해서는 이러한 효소를 생한하는 균주의 분리가 선행되어야 한다.

이러한 상황하에서, 본 발명자들은 높은 열안정성 및 역가를 갖는 D-히단토이나제를 얻기 위해 연구를 계속한 결과, 목적하는 D-히단토이나제 활성을 갖는 새로운 미생물 균주를 발견하였으며, 이러한 발견을 기초로 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 열안정성 및 활성이 높은 D-히단토이나제를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 히단토인 유도체로부터 D-아미노산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 전국 각지의 건초 더미, 부식토, 하천, 폐수, 온천 등지에서 채취한 사료를 하기 표 1의 조성을 갖는 액체 배지에 접종하여 55 내지 60℃에서 부유 배양하였다. 이 배양액을 동일 성분의 2% 한천 평판 배지에 접종하고 55 내지 60℃에서 평판 배양하여 순수 콜로니를 분리하였다. 분리된 균주를 하기 표 1의 조성을 갖는 액체 배지 5ml에서 55내지 60℃에서 8 내지 10시간 배양한 후 균체를 수확하여 D-히단토이나제 활성 및 열안정성을 측정하여, D-히단토이나제 활성 및 열안정성이 우수한 균주들을 1차적으로 선별하였다. 이 균주들을 다시 하기 표 1의 조성을 갖는 액체 배지 100ml에서 배양하고 생육에 따른 D-히단토이나제 활성 및 열안정성을 측정하여 최종적으로 균주를 선별하므로서 본 발명에 따른 균주를 얻었다.

(pH 7.2-7.4)

D-히단토이나제 활성 및 열안정성은 다음과 같은 측정방법에 의해 측정하였다.

0.1M 인산염 완충액(pH 8.0)에 혼탁시킨 균체액 0.5ml에 동일 완충액 중의 1%(w/v) 히단토인 유도체용액 1ml를 첨가하고 30℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 이 결과 얻은 반응액에 야마다 등의 방법[H. Yamada et al., J. Ferment. Technol., 56 : 484(1978)]에 따라서 6N 염산 중의 10%(w/v) 파라-디메틸아미노벤즈알데히드 용액 0.5ml를 첨가하여 발색시켜서 440nm에서 흡광도를 측정하거나, 또는 반응 시료액을 HPLC(칼럼 : CLC-ODS(M), 용출제 : 10% 아세토니트릴 용액(pH 3), 유속 : 1ml/분)를 이용하여 크로마토 그래피시켜서 214nm에서 흡광도를 측정하여 N-카르바모일-아미노산을 정량함으로써 측정한다.

열안정성은 균체 자체 또는 균체를 파쇄하여 얻은 조효소액을 70℃에서 30분간 열처리한 후의 잔여 활성을 측정한다.

상기 방법으로, 본 발명의 균주에 대해 D-히단토이나제 활성 및 열안정성을 측정한 결과, D-히단토이나제 활성(30℃)은 0.3units/mg 건조 균체였으며, 균체를 70℃에서 30분 동안 열처리한 후에도 활성 잔여도가 80% 이상이었다. 균체를 파쇄한 후 얻은 조효소액으로 열안정도를 측정하여도 비슷한 결과를 얻을 수 있었다.

이 균주의 히단토이나제 활성에 의해 세라믹 히단토인 유도체로부터 생성된 N-카르바모일-아미노산은 HPLC 분석으로 확인되었으며, 키랄 플레이트(chiral plate) 상에서 효소의 기질 입체 특이성을 조사한 결과 D-형에 대해서만 활성을 나타내었다.

본 발명에 따라 분리된 균주는 65℃ 이상의 온도에서도 생육할 수 있는 고온성 미생물이며 그램 염색에 대해 양성이고 내생 포자를 형성하는 간균으로서 바실러스 스티아로더모필러스 종으로 분류되며, 본 발명자들은 이 균주를 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1로 명명하였다. 이 균주는 한국과학기술연구원 유전공학 연구소에 1994년 1월 6일자로 KCTC 8551P의 수탁 번호로 기탁되었다. 이 균주의 생리적 특성을 하기 표 2에 나타내었다.

또한, 본 발명은 고온에서 본 발명의 신규 미생물 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1을 사용하여 5-치환 히단토인 유도체로부터 N-카르바모일-D-아미노산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 기질인 5-치환 히단토인 유도체를 가수 분해시킴으로써 각종 N-카르바모일-D-아미노산을 생산할 수 있다. 기질로서 사용될 수 있는 히단토인 유도체로서는 DL-5-(파라-히드록시페닐)히단토인, DL-5-(2'-메틸티오에틸렌)히단토인, DL-5-페닐히단토인, DL-5-이소프로필히단토인 등이 있다. 본 발명에 따라 생산되는 N-카르바모일-D-아미노산은 N-카르바모일-D-파라-히드록시페닐글리신, N-카르바모일-D-메티오닌, N-카르바모일-D-페닐글리신, N-카르바모일-D-발린 등이다. 반응은 본 발명의 신규 미생물 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1을 사용하여 통상적인 효소 반응방법에 따라 수행될 수 있다. 반응은 약 55℃ 이상의 고온에서 수행될 수 있다.

본 발명의 D-아미노산의 제조방법은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명된다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의해 상세히 설명한다.

[실시예1]

0.1M 디에탄올아민 완충액(pH 8.5) 100ml에 균체 0.1g(건조량), DL-5-(파라-히드록시페닐)히단토인 1g 및 MnCl·4HO 0.01g을 첨가하고, 55내지 60℃에서 질소 기류 하에 교반시키면서 15시간 동안 반응시켰다. 반응을 중단시킨 후 HPLC로 분석한 결과, 약 80%의 수율로 N-카르바모일-D-파라-히드록시페닐글리신이 생성되었다.

[실시예2]

기질로서 DL-5-(2'-메틸티오에틸렌)히단토인을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여, N-카르바모일-D-메티오닌을 약 80%의 수율로 얻었다.

[실시예3]

기질로서 DL-5-페닐히단토인을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여, N-카르바모일-D-페닐글리신을 약 80%의 수율로 얻었다.

[실시예4]

기질로서 DL-5-이소프로필히단토인을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여, N-카르바모일-D-발린을 약 80%의 수율로 얻었다.

Claims (1)

1. 고온에서 생육할 수 있으며 내열성 D-히단토이나제 활성을 갖는 것이 특징인 미생물 바실러스 스티아로더모필러스(Bacillus strearothermophilus) SD-1.