JP3873512B2 - Ｄ−３−（２−ナフチル）アラニンの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬・農薬等の合成中間体として有用なＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの生物化学的製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
天然に存在する光学活性アミノ酸の多くは、微生物を用いた発酵法や天然物からの抽出法により製造されている。しかしながらＤ−３−（２−ナフチル）アラニンは非天然型アミノ酸であるため、従来のような発酵法や抽出法によっては工業的に製造されてはいなかった。
一般に光学活性アミノ酸を製造する方法としては、有機化学的合成法により製造したＤＬ−アミノ酸を光学分割する方法がよく知られている（Ｂｕｌｌ．Ａｇｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ．，２１，３０４（１９５７）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，６０４５（１９５４）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８８，６５７（１９５１））。しかしながら、ＤＬ−アミノ酸の光学分割は操作が煩雑であり、収率も低くなるという欠点を有している。
【０００３】
また、Ｄ−アミノ酸を製造する方法として、ＤＬ体の５−置換ヒダントイン類にヒダントイン環を不斉的に開裂加水分解する能力を有する、シュードモナス属等の微生物の菌体、固定化菌体又は菌体破砕物を作用させることによりＤ−アミノ酸を取得する方法が知られているが、主に天然型のＤ型アミノ酸に関してのみであった（特開昭５４−８９０８８号公報；同５５−１１５６９号公報；同５５−１５３５９５号公報等）。従って、非天然型のＤ型アミノ酸、具体的には、Ｄ−３−（２−ナフチル）アラニンの高収率な製造方法の確立が期待されていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの工業的製法につき鋭意検討した結果、原料としてのＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインにある種の微生物の菌体及び／またはその処理物を作用させれば、該原料が生物化学的に加水分解し、目的とするＤ−３−（２−ナフチル）アラニンが高効率に製造出来ることを初めて見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち本発明は、ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインに、Ｄ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインからＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを生成する能力を有する微生物の菌体及び／またはその処理物を水性媒体中で作用させ、該水性媒体中にＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを生成蓄積せしめ、該水性媒体中からＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを採取することを特徴とするＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの製造方法を提供するものである。
【０００６】
本発明において原料として用いられる５−（２−ナフチル）メチルヒダントインは、ＤＬ体はもちろんＤ体もまた利用できるが、化学合成で安価に製造されるＤＬ体が好適に用いられる。又、Ｌ体の５−（２−ナフチル）メチルヒダントインは、酵素的に又は／および化学的に容易にラセミ化されＤＬ体に変換される為、ラセミ化反応を共存させることでＬ体もまた原料として利用することが出来る。
【０００７】
本発明で使用される微生物は、Ｄ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを選択的に開裂加水分解してＤ−３−（２−ナフチル）アラニンに変換する能力を有するものであれば特に限定はされない。かかる微生物としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及び／またはパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属からなる群より選ばれる微生物等が挙げられる。
【０００８】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては例えばアグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）等が挙げられ、具体的にはＮＲＲＬ Ｂ１１２９１（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに保存）やＭＣＩ３６６２等が挙げられる。
【０００９】
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する微生物としては例えばアルカリゲネス アクアマリヌス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ）等が挙げられ、具体的にはＦＥＲＭ Ｐ−４２２９（工業技術院生命工学工業技術研究所に保存）等が挙げられる。
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物としては例えばアルスロバクター クリスタロポイエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）等が挙げられ、具体的にはＪＣＭ２５２２（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：理化学研究所微生物系統保存施設に保存）等が挙げられる。
【００１０】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物としては例えばバチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等が挙げられ、具体的にはＩＦＯ１２１９９やＩＦＯ１２２００（財団法人 発酵研究所に保存）等が挙げられる。
フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては例えばフラボバクテリウム ヒダントイノフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｙｄａｎｔｏｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）等が挙げられ、具体的にはＦＥＲＭ Ｐ−４８１９（工業技術院生命工学工業技術研究所に保存）等が挙げられる。
【００１１】
パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物としては例えばパラコッカス デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）等が挙げられ、具体的にはＦＥＲＭ Ｐ−４３４９（工業技術院生命工学工業技術研究所に保存）等が挙げられる。
前述したアグロバクテリウム ラジオバクター（ＭＣＩ３６６２）の菌学的性質は以下の通りである。なお、アグロバクテリウム ラジオバクター（ＭＣＩ３６６２）は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭＰ−１７３１２として寄託されている。
【００１２】
【００１３】
６．分類学的考察
（１）属の同定
本菌株ＭＣＩ３６６２株は１）グラム陰性桿菌、２）絶対好気性、３）芽胞を形成しない、４）運動性なし、５）Ｏ−Ｆテストは酸化型、６）硫化水素を生成しない、７）ウレアーゼ陽性、８）主要なイソプレノイドキノンはユビキノンＱ１０を有する、９）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は５９．５モル％などの特徴を持っている。これらの特徴から、本菌株はバージェイズマニュアル・システマティック・バクテリオロジー〔Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ〕第１巻、２３４〜２５６頁（１９８４）に記載されているリゾビアシーエ科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に含まれる、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に帰属することが示唆された。
【００１４】
（２）種の同定
現在、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列の解析結果から、アグロバクテリウム属とリゾビウム属は属レベルでまとまった菌群であることが判明している。従って本菌株の種を決定するため、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列（１４４５塩基）を決定した。得られた結果に基づくデータベース検索により、本菌株はアグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に最も近縁であることが判明した。
【００１５】
インターナショナル ジャーナル オブ システマティック バクテリオロジー〔Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ〕第４３巻、６９４−７０２頁（１９９３）によると、アグロバクテリウム属にはアグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム ラディオバクター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム ビティス（Ａ．ｖｉｔｉｓ）及びアグロバクテリウムルビ（Ａ．ｒｕｂｉ）の５種が知られているが、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）とアグロバクテリウム ラディオバクター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）は１６Ｓ ｒＲＮＡの解析から同一種として統合され、アグロバクテリウム ラディオバクターとなっている。従って本菌株はアグロバクテリウム ラディオバクターと９９．６％の相同値を示し、他種（相同値９４．６〜９７．７％）より高い相同性を示した。さらに生理学的性質においても、１）３７℃での生育、２）エリスリトールの資化性、３）アルギニンジヒドロラーゼの有無などの点で明らかに他種とは区別された。
【００１６】
以上の結果から、本菌株ＭＣＩ３６６２株をアグロバクテリウム ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）と同定した。本発明で用いられる微生物は、上記微生物から、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等により誘導される変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株等であってもよい。
【００１７】
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体及び／またはその処理物として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体及び／または菌体処理物から、Ｄ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインにのみ選択的に作用して、それを開裂加水分解してＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを生成する能力を有する酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体又は／および菌体処理物又は／および酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／またはその処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００１８】
本発明において、これらの微生物を、予めヒダントイン類を含む培地中で培養させた場合に、該微生物のヒダントイン環の不斉的開裂加水分解能が増強されている場合があるのでヒダントイン類を含む培地中で培養することが望ましいが、それに限定されるものではない。ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導された組換え株で、誘導物質なしに高い活性が得られる菌株を用いることも可能である。
【００１９】
本発明における微生物の培養培地としては、通常の炭素源、窒素源、無機イオンを含有する一般的な培地が使用できる。さらにビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加することもできる。
炭素源としてはグルコース、シュクロース等の炭水化物、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸、アルコール類その他が適宜使用される。
窒素源としては、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素源、あるいは酵母エキスやペプトン等の有機窒素源が適宜使用される。本発明においては主に酵母エキスが０．１〜０．５％で用いられ、好ましくは０．３〜１％である。
無機イオンとしては、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、リン酸イオンその他が必要に応じて適宜使用される。本発明においては、主に硫酸マグネシウム０．０１〜０．１％、リン酸二水素カリウム０．０５〜０．５％、リン酸水素二カリウム０．１〜１％、硫酸マンガン０．００１〜０．０５％が用いられる。
【００２０】
又、必要に応じて反応を触媒する酵素を菌体内に著量生合成させる為の誘導物質として添加する５−置換ヒダントイン類としては特に限定されるものではないが、例えばメチルヒダントイン、イソプロピルヒダントイン、ヒダントイン、メチルチオエチルヒダントイン、５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダントイン等が使用される。好ましくは、メチルヒダントイン又はイソプロピルヒダントインが用いられる。
【００２１】
前記微生物を培養する際に必要に応じ５−置換ヒダントイン類を培地に添加する場合には、はじめから５−置換ヒダントイン類を含有した培地で培養してもよいし、培養途中から添加してもよい。
５−置換ヒダントイン類の培地への添加量は特に制限されるものではないが、一般的には０．０００１〜３重量％、より好ましくは０．００１〜１重量％が用いられる。
【００２２】
培養は好気的条件下に、前記培地中で１５〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で、ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ５〜８の範囲に制御しつつ５〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間行うことが出来る。
反応は、前述した如く、微生物菌体又は／およびその処理物を原料としてＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインに作用させることにより行なわれる。
【００２３】
微生物菌体を作用させる場合、前述の培養条件にて十分に菌を生育させた後、菌体を分離し洗浄後、水あるいは適当な緩衝液に懸濁させ、原料としてＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを飽和濃度以上添加する。ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインは水性媒体に対する溶解度は低いが、反応の進行と共に溶解する。ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインの添加量は、特に制限されるものではないが、一般に０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１〜４重量％である。反応は１０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃の温度で、ｐＨは４．０〜１０．０、好ましくは７．０〜９．０で、水性媒体中又は／および該水性媒体を含有する容器中を窒素で置換した後、１〜１４日、通常は１〜７日間程度撹拌しながら実施する。
【００２４】
菌体処理物を作用させる場合、タンパク質重量で１０〜１００ｍｇ程度の菌体破砕物等を含む０．０１〜１Ｍの緩衝液（ｐＨ７〜９）等の水性媒体に、ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを上記範囲で添加後反応させることが出来る。
なお、本発明でいう水性媒体とは、水または例えばリン酸バッファー等の適当な緩衝液を意味する。
このようにして水性媒体中に生成したＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの反応終了液からの分離精製は常法通り公知の方法、例えば酸で沈殿させる酸晶析方法、あるいは合成吸着剤等を用いたカラムクロマトグラフィー法等で行なうことが出来る。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明の実施例を挙げるが、その要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
グルコース１ｇ、酵母エキス１ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１ｇＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｍｇ、５−イソプロピルヒダントイン０．３ｇを水１００ｍｌに溶解した培地を、２０ｍｌづつ２００ｍｌ容量のバッフル付きフラスコに分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。３０℃に冷却後、普通寒天培地上で２４時間培養した下記の各菌株を１白金耳づつ接種し、３０℃、２０時間、１６０ｒｐｍのロータリーシェーカーで培養した。
【００２６】
実施菌株
菌株Ａ Agrobacterium radiobacter ＮＲＲＬ Ｂ１１２９１
菌株Ｂ Agrobacterium radiobacter ＭＣＩ３６６２
菌株Ｃ Alcaligenes aquamarinus ＦＥＲＭ Ｐ−４２２９
菌株Ｄ Arthrobacter crystallopoietes ＪＣＭ２５２２
菌株Ｅ Bacillus licheniformis ＩＦＯ１２１９９
菌株Ｆ Bacillus licheniformis ＩＦＯ１２２００
菌株Ｇ Flavobacterium hydantoinophilum ＦＥＲＭ Ｐ−４８１９
菌株Ｈ Paracoccus denitrificans ＦＥＲＭ Ｐ−４３４９
【００２７】
２０時間後それぞれの培養物を回収し、菌体を遠心分離によって分離した。分離した菌体を再度１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁洗浄し、遠心分離によって菌体を分離した。該分離菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、５０ｍｌ容量の蓋付き遠沈管に入れ、ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを０．１ｇ添加した。遠沈管を窒素置換した後、蓋を閉め、３０℃にて２４時間撹拌し、反応を行った。２４時間後、遠沈管に１規定度のＮａＯＨ １ｍｌを加え反応終了液をアルカリ性にし、生成した未溶解のＤ−３−（２−ナフチル）アラニンおよび未反応のＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを完全に溶解した後、遠心分離により菌体を除去した。シリカゲルの薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて、得られた反応上清中のＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの生成を確認した。更に、ＨＰＬＣにより、未反応基質およびＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの定量と光学純度の測定を行った。又、反応終了液からＨＰＬＣによりＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの画分を分取後、濃縮乾固し採取量を定量した。結果を下表に示した。
【００２８】
【００２９】
実施例２
上記菌株Ｂ（ＭＣＩ３６６２）を実施例１と同様の条件で培養して菌体を得た。この休止菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、５０ｍｌ容量の蓋付き遠沈管に入れ、ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを０．３ｇ添加した。遠沈管を窒素置換した後、蓋を閉め、３０℃にて５５時間撹拌し、反応を行った。５５時間後、シリカゲルのＴＬＣにて未反応のＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインがないことを確認した。遠沈管に１規定度のＮａＯＨ １ｍｌを加えて生成した未溶解のＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを完全に溶解した後、遠心分離により菌体を除去した。この反応上清に１規定度のＨＣｌを滴下し、ｐＨ７としたところ、結晶が析出し、系内が白濁した。遠心分離によりこの白色結晶を分離し、水および有機溶媒で数回洗浄した後、真空乾燥し、白色の粉体を１９２ｍｇ得た。この結晶の一部を０．０１規定度のＮａＯＨに溶解し、ＨＰＬＣで測定した結果、Ｄ−３−（２−ナフチル）アラニンの純度は９９．０％以上であった。さらにＨＰＬＣにて光学純度を測定した結果、各々９９．５％ｅｅであった。
なお、上記実施例にて用いたＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬・農薬の合成中間体として有用なＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを高収率で得ることが出来る。
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬・農薬等の合成中間体として有用なＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの生物化学的製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
天然に存在する光学活性アミノ酸の多くは、微生物を用いた発酵法や天然物からの抽出法により製造されている。しかしながらＤ−３−（２−ナフチル）アラニンは非天然型アミノ酸であるため、従来のような発酵法や抽出法によっては工業的に製造されてはいなかった。
一般に光学活性アミノ酸を製造する方法としては、有機化学的合成法により製造したＤＬ−アミノ酸を光学分割する方法がよく知られている（Ｂｕｌｌ．Ａｇｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ．，２１，３０４（１９５７）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，６０４５（１９５４）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８８，６５７（１９５１））。しかしながら、ＤＬ−アミノ酸の光学分割は操作が煩雑であり、収率も低くなるという欠点を有している。
【０００３】
また、Ｄ−アミノ酸を製造する方法として、ＤＬ体の５−置換ヒダントイン類にヒダントイン環を不斉的に開裂加水分解する能力を有する、シュードモナス属等の微生物の菌体、固定化菌体又は菌体破砕物を作用させることによりＤ−アミノ酸を取得する方法が知られているが、主に天然型のＤ型アミノ酸に関してのみであった（特開昭５４−８９０８８号公報；同５５−１１５６９号公報；同５５−１５３５９５号公報等）。従って、非天然型のＤ型アミノ酸、具体的には、Ｄ−３−（２−ナフチル）アラニンの高収率な製造方法の確立が期待されていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの工業的製法につき鋭意検討した結果、原料としてのＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインにある種の微生物の菌体及び／またはその処理物を作用させれば、該原料が生物化学的に加水分解し、目的とするＤ−３−（２−ナフチル）アラニンが高効率に製造出来ることを初めて見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち本発明は、ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインに、Ｄ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインからＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを生成する能力を有する微生物の菌体及び／またはその処理物を水性媒体中で作用させ、該水性媒体中にＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを生成蓄積せしめ、該水性媒体中からＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを採取することを特徴とするＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの製造方法を提供するものである。
【０００６】
本発明において原料として用いられる５−（２−ナフチル）メチルヒダントインは、ＤＬ体はもちろんＤ体もまた利用できるが、化学合成で安価に製造されるＤＬ体が好適に用いられる。又、Ｌ体の５−（２−ナフチル）メチルヒダントインは、酵素的に又は／および化学的に容易にラセミ化されＤＬ体に変換される為、ラセミ化反応を共存させることでＬ体もまた原料として利用することが出来る。
【０００７】
本発明で使用される微生物は、Ｄ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを選択的に開裂加水分解してＤ−３−（２−ナフチル）アラニンに変換する能力を有するものであれば特に限定はされない。かかる微生物としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及び／またはパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属からなる群より選ばれる微生物等が挙げられる。
【０００８】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては例えばアグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）等が挙げられ、具体的にはＮＲＲＬ Ｂ１１２９１（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに保存）やＭＣＩ３６６２等が挙げられる。
【０００９】
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する微生物としては例えばアルカリゲネス アクアマリヌス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ）等が挙げられ、具体的にはＦＥＲＭ Ｐ−４２２９（工業技術院生命工学工業技術研究所に保存）等が挙げられる。
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物としては例えばアルスロバクター クリスタロポイエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）等が挙げられ、具体的にはＪＣＭ２５２２（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：理化学研究所微生物系統保存施設に保存）等が挙げられる。
【００１０】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物としては例えばバチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等が挙げられ、具体的にはＩＦＯ１２１９９やＩＦＯ１２２００（財団法人 発酵研究所に保存）等が挙げられる。
フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては例えばフラボバクテリウム ヒダントイノフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｙｄａｎｔｏｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）等が挙げられ、具体的にはＦＥＲＭ Ｐ−４８１９（工業技術院生命工学工業技術研究所に保存）等が挙げられる。
【００１１】
パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物としては例えばパラコッカス デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）等が挙げられ、具体的にはＦＥＲＭ Ｐ−４３４９（工業技術院生命工学工業技術研究所に保存）等が挙げられる。
前述したアグロバクテリウム ラジオバクター（ＭＣＩ３６６２）の菌学的性質は以下の通りである。なお、アグロバクテリウム ラジオバクター（ＭＣＩ３６６２）は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭＰ−１７３１２として寄託されている。
【００１２】
６．分類学的考察
（１）属の同定
本菌株ＭＣＩ３６６２株は１）グラム陰性桿菌、２）絶対好気性、３）芽胞を形成しない、４）運動性なし、５）Ｏ−Ｆテストは酸化型、６）硫化水素を生成しない、７）ウレアーゼ陽性、８）主要なイソプレノイドキノンはユビキノンＱ１０を有する、９）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は５９．５モル％などの特徴を持っている。これらの特徴から、本菌株はバージェイズマニュアル・システマティック・バクテリオロジー〔Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ〕第１巻、２３４〜２５６頁（１９８４）に記載されているリゾビアシーエ科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に含まれる、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に帰属することが示唆された。
【００１４】
（２）種の同定
現在、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列の解析結果から、アグロバクテリウム属とリゾビウム属は属レベルでまとまった菌群であることが判明している。従って本菌株の種を決定するため、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列（１４４５塩基）を決定した。得られた結果に基づくデータベース検索により、本菌株はアグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に最も近縁であることが判明した。
【００１５】
インターナショナル ジャーナル オブ システマティック バクテリオロジー〔Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ〕第４３巻、６９４−７０２頁（１９９３）によると、アグロバクテリウム属にはアグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム ラディオバクター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム ビティス（Ａ．ｖｉｔｉｓ）及びアグロバクテリウムルビ（Ａ．ｒｕｂｉ）の５種が知られているが、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）とアグロバクテリウム ラディオバクター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）は１６Ｓ ｒＲＮＡの解析から同一種として統合され、アグロバクテリウム ラディオバクターとなっている。従って本菌株はアグロバクテリウム ラディオバクターと９９．６％の相同値を示し、他種（相同値９４．６〜９７．７％）より高い相同性を示した。さらに生理学的性質においても、１）３７℃での生育、２）エリスリトールの資化性、３）アルギニンジヒドロラーゼの有無などの点で明らかに他種とは区別された。
【００１６】
以上の結果から、本菌株ＭＣＩ３６６２株をアグロバクテリウム ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）と同定した。本発明で用いられる微生物は、上記微生物から、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等により誘導される変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株等であってもよい。
【００１７】
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体及び／またはその処理物として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体及び／または菌体処理物から、Ｄ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインにのみ選択的に作用して、それを開裂加水分解してＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを生成する能力を有する酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体又は／および菌体処理物又は／および酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／またはその処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００１８】
本発明において、これらの微生物を、予めヒダントイン類を含む培地中で培養させた場合に、該微生物のヒダントイン環の不斉的開裂加水分解能が増強されている場合があるのでヒダントイン類を含む培地中で培養することが望ましいが、それに限定されるものではない。ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導された組換え株で、誘導物質なしに高い活性が得られる菌株を用いることも可能である。
【００１９】
本発明における微生物の培養培地としては、通常の炭素源、窒素源、無機イオンを含有する一般的な培地が使用できる。さらにビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加することもできる。
炭素源としてはグルコース、シュクロース等の炭水化物、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸、アルコール類その他が適宜使用される。
窒素源としては、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素源、あるいは酵母エキスやペプトン等の有機窒素源が適宜使用される。本発明においては主に酵母エキスが０．１〜０．５％で用いられ、好ましくは０．３〜１％である。
無機イオンとしては、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、リン酸イオンその他が必要に応じて適宜使用される。本発明においては、主に硫酸マグネシウム０．０１〜０．１％、リン酸二水素カリウム０．０５〜０．５％、リン酸水素二カリウム０．１〜１％、硫酸マンガン０．００１〜０．０５％が用いられる。
【００２０】
又、必要に応じて反応を触媒する酵素を菌体内に著量生合成させる為の誘導物質として添加する５−置換ヒダントイン類としては特に限定されるものではないが、例えばメチルヒダントイン、イソプロピルヒダントイン、ヒダントイン、メチルチオエチルヒダントイン、５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダントイン等が使用される。好ましくは、メチルヒダントイン又はイソプロピルヒダントインが用いられる。
【００２１】
前記微生物を培養する際に必要に応じ５−置換ヒダントイン類を培地に添加する場合には、はじめから５−置換ヒダントイン類を含有した培地で培養してもよいし、培養途中から添加してもよい。
５−置換ヒダントイン類の培地への添加量は特に制限されるものではないが、一般的には０．０００１〜３重量％、より好ましくは０．００１〜１重量％が用いられる。
【００２２】
培養は好気的条件下に、前記培地中で１５〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で、ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ５〜８の範囲に制御しつつ５〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間行うことが出来る。
反応は、前述した如く、微生物菌体又は／およびその処理物を原料としてＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインに作用させることにより行なわれる。
【００２３】
微生物菌体を作用させる場合、前述の培養条件にて十分に菌を生育させた後、菌体を分離し洗浄後、水あるいは適当な緩衝液に懸濁させ、原料としてＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを飽和濃度以上添加する。ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインは水性媒体に対する溶解度は低いが、反応の進行と共に溶解する。ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインの添加量は、特に制限されるものではないが、一般に０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１〜４重量％である。反応は１０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃の温度で、ｐＨは４．０〜１０．０、好ましくは７．０〜９．０で、水性媒体中又は／および該水性媒体を含有する容器中を窒素で置換した後、１〜１４日、通常は１〜７日間程度撹拌しながら実施する。
【００２４】
菌体処理物を作用させる場合、タンパク質重量で１０〜１００ｍｇ程度の菌体破砕物等を含む０．０１〜１Ｍの緩衝液（ｐＨ７〜９）等の水性媒体に、ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを上記範囲で添加後反応させることが出来る。
なお、本発明でいう水性媒体とは、水または例えばリン酸バッファー等の適当な緩衝液を意味する。
このようにして水性媒体中に生成したＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの反応終了液からの分離精製は常法通り公知の方法、例えば酸で沈殿させる酸晶析方法、あるいは合成吸着剤等を用いたカラムクロマトグラフィー法等で行なうことが出来る。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明の実施例を挙げるが、その要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
グルコース１ｇ、酵母エキス１ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１ｇＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｍｇ、５−イソプロピルヒダントイン０．３ｇを水１００ｍｌに溶解した培地を、２０ｍｌづつ２００ｍｌ容量のバッフル付きフラスコに分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。３０℃に冷却後、普通寒天培地上で２４時間培養した下記の各菌株を１白金耳づつ接種し、３０℃、２０時間、１６０ｒｐｍのロータリーシェーカーで培養した。
【００２６】
実施菌株
菌株Ａ Agrobacterium radiobacter ＮＲＲＬ Ｂ１１２９１
菌株Ｂ Agrobacterium radiobacter ＭＣＩ３６６２
菌株Ｃ Alcaligenes aquamarinus ＦＥＲＭ Ｐ−４２２９
菌株Ｄ Arthrobacter crystallopoietes ＪＣＭ２５２２
菌株Ｅ Bacillus licheniformis ＩＦＯ１２１９９
菌株Ｆ Bacillus licheniformis ＩＦＯ１２２００
菌株Ｇ Flavobacterium hydantoinophilum ＦＥＲＭ Ｐ−４８１９
菌株Ｈ Paracoccus denitrificans ＦＥＲＭ Ｐ−４３４９
【００２７】
２０時間後それぞれの培養物を回収し、菌体を遠心分離によって分離した。分離した菌体を再度１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁洗浄し、遠心分離によって菌体を分離した。該分離菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、５０ｍｌ容量の蓋付き遠沈管に入れ、ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを０．１ｇ添加した。遠沈管を窒素置換した後、蓋を閉め、３０℃にて２４時間撹拌し、反応を行った。２４時間後、遠沈管に１規定度のＮａＯＨ １ｍｌを加え反応終了液をアルカリ性にし、生成した未溶解のＤ−３−（２−ナフチル）アラニンおよび未反応のＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを完全に溶解した後、遠心分離により菌体を除去した。シリカゲルの薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて、得られた反応上清中のＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの生成を確認した。更に、ＨＰＬＣにより、未反応基質およびＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの定量と光学純度の測定を行った。又、反応終了液からＨＰＬＣによりＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの画分を分取後、濃縮乾固し採取量を定量した。結果を下表に示した。
【００２８】
実施例２
上記菌株Ｂ（ＭＣＩ３６６２）を実施例１と同様の条件で培養して菌体を得た。この休止菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、５０ｍｌ容量の蓋付き遠沈管に入れ、ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインを０．３ｇ添加した。遠沈管を窒素置換した後、蓋を閉め、３０℃にて５５時間撹拌し、反応を行った。５５時間後、シリカゲルのＴＬＣにて未反応のＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインがないことを確認した。遠沈管に１規定度のＮａＯＨ １ｍｌを加えて生成した未溶解のＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを完全に溶解した後、遠心分離により菌体を除去した。この反応上清に１規定度のＨＣｌを滴下し、ｐＨ７としたところ、結晶が析出し、系内が白濁した。遠心分離によりこの白色結晶を分離し、水および有機溶媒で数回洗浄した後、真空乾燥し、白色の粉体を１９２ｍｇ得た。この結晶の一部を０．０１規定度のＮａＯＨに溶解し、ＨＰＬＣで測定した結果、Ｄ−３−（２−ナフチル）アラニンの純度は９９．０％以上であった。さらにＨＰＬＣにて光学純度を測定した結果、各々９９．５％ｅｅであった。
なお、上記実施例にて用いたＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬・農薬の合成中間体として有用なＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを高収率で得ることが出来る。
Claims (2)
- ＤＬ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインに、Ｄ−５−（２−ナフチル）メチルヒダントインからＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを生成する能力を有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、及び／またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属からなる群より選ばれる微生物の菌体及び／またはその処理物を水性媒体中で作用させ、該水性媒体中にＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを生成蓄積せしめ、該水性媒体中からＤ−３−（２−ナフチル）アラニンを採取することを特徴とするＤ−３−（２−ナフチル）アラニンの製造方法。
- アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物がアグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物がアルスロバクター クリスタロポイエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がバチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、である請求項１記載の製造方法。
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