JP2002233395A - 補酵素ｎａｄｈの再生方法 - Google Patents
補酵素ｎａｄｈの再生方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ＮＡＤＨ依存性還元酵素が関与する酵素
反応の共役反応において、バチルス属細菌由来のＮＡＤ
+依存性ギ酸脱水素酵素を用いることを特徴とする、補
酵素ＮＡＤＨの再生方法。 【効果】 本発明によれば、従来知られていなかったバ
チルス属に属する微生物のギ酸脱水素酵素活性を用いて
反応系に生じたＮＡＤ+を元のＮＡＤＨに効率よく変換
させる方法が提供される。従って、本方法をＮＡＤＨ依
存性還元酵素が関与する酵素反応に共役させて用いれ
ば、前記酵素反応を円滑に進めることができ、その反応
生成物の収量を上げることができる。
反応の共役反応において、バチルス属細菌由来のＮＡＤ
+依存性ギ酸脱水素酵素を用いることを特徴とする、補
酵素ＮＡＤＨの再生方法。 【効果】 本発明によれば、従来知られていなかったバ
チルス属に属する微生物のギ酸脱水素酵素活性を用いて
反応系に生じたＮＡＤ+を元のＮＡＤＨに効率よく変換
させる方法が提供される。従って、本方法をＮＡＤＨ依
存性還元酵素が関与する酵素反応に共役させて用いれ
ば、前記酵素反応を円滑に進めることができ、その反応
生成物の収量を上げることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＮＡＤＨ依存性還
元酵素が関与する酵素反応に共役して補酵素ＮＡＤＨを
効率よく再生する方法に関する。
元酵素が関与する酵素反応に共役して補酵素ＮＡＤＨを
効率よく再生する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、ＮＡＤＨ依存性還元酵素によ
る酵素反応にて工業的に目的生成物を合成する場合、Ｎ
ＡＤ+依存性脱水素酵素による酵素反応を共役させるこ
とによって、生じたＮＡＤ+を元のＮＡＤＨに再生する
ことが行われている。しかし、共役反応に通常のＮＡＤ
+依存性脱水素酵素を用いた場合、反応系には正反応の
生成物と共役反応の生成物の少なくとも2系列の生成物
が反応液中に存在し、その分離が極めて難しいという問
題点があった。そこで、ＮＡＤ依存性脱水素酵素とし
て、ギ酸脱水素酵素を用いて共役反応を行う方法が提案
されている（特公平7-59198号公報、特開平10-23896、
特開平11-225784）。ギ酸脱水素酵素は、原料のギ酸か
ら生成する二酸化炭素を反応系外へ容易に放出できるた
め、反応液中にはＮＡＤＨ依存性脱水素酵素による酵素
反応の生成物のみが残り、その分離が非常に容易である
という利点がある。
る酵素反応にて工業的に目的生成物を合成する場合、Ｎ
ＡＤ+依存性脱水素酵素による酵素反応を共役させるこ
とによって、生じたＮＡＤ+を元のＮＡＤＨに再生する
ことが行われている。しかし、共役反応に通常のＮＡＤ
+依存性脱水素酵素を用いた場合、反応系には正反応の
生成物と共役反応の生成物の少なくとも2系列の生成物
が反応液中に存在し、その分離が極めて難しいという問
題点があった。そこで、ＮＡＤ依存性脱水素酵素とし
て、ギ酸脱水素酵素を用いて共役反応を行う方法が提案
されている（特公平7-59198号公報、特開平10-23896、
特開平11-225784）。ギ酸脱水素酵素は、原料のギ酸か
ら生成する二酸化炭素を反応系外へ容易に放出できるた
め、反応液中にはＮＡＤＨ依存性脱水素酵素による酵素
反応の生成物のみが残り、その分離が非常に容易である
という利点がある。
【０００３】これまで報告されているギ酸脱水素酵素活
性を有する微生物としては、マイコバクテリウム属〔Ap
pl. Microbiol. Biotechnol., Vol.44, pp.479-483 (19
95)〕、シュードモナス属〔Ｂiotechnol. Appl. Bioche
m., Vol.18, pp.201-207 (1993)、Eur. J. Biochem., V
ol.83, pp.485-498 (1978)〕、パラコッカス属〔Biosc
i. Biotech. Biochem., Vol.56, pp.1966-1970 (199
2)〕、モラクセラ属〔Journal Of Bacteriology, Vol.1
70, pp.3189-3193 (1988)〕、メチロモナス属〔Bioche
m. J., Vol.93, pp.281-290 (1964 )、Z. Allg. Mikrob
iol., Vol.20, pp.167-175 (1980 )〕、また、酵母とし
てカンジダ属〔Eur. J. Biochem., Vol.152,pp.657-662
(1985) 、Gene, Vol.162, pp.99-104 (1995)、Eur. J.
Biochem.,Vol.62, pp.151-160 (1976)、Biochim.Bioph
ys. Acta, Vol. 566, pp.12-20 (1979)〕、ハンセヌラ
属（EP0299108 A1, B1、特開平2-124093 ）、ハイホマ
イクロビウム属（特開平12-245471）がある。また、バ
チルス・ポリミキサ（Bacilluspolymyxa）と呼ばれる種
にギ酸脱水素酵素活性のあることが報告されているが
〔近畿大学工学部研究報告 No. 14, pp.133-139 (1980
), No.15, pp.115-123 (1981 ), No.16, pp.141-152
(1982）〕、以下の理由によりバチルス属とは非常にか
け離れた存在であることが示された。
性を有する微生物としては、マイコバクテリウム属〔Ap
pl. Microbiol. Biotechnol., Vol.44, pp.479-483 (19
95)〕、シュードモナス属〔Ｂiotechnol. Appl. Bioche
m., Vol.18, pp.201-207 (1993)、Eur. J. Biochem., V
ol.83, pp.485-498 (1978)〕、パラコッカス属〔Biosc
i. Biotech. Biochem., Vol.56, pp.1966-1970 (199
2)〕、モラクセラ属〔Journal Of Bacteriology, Vol.1
70, pp.3189-3193 (1988)〕、メチロモナス属〔Bioche
m. J., Vol.93, pp.281-290 (1964 )、Z. Allg. Mikrob
iol., Vol.20, pp.167-175 (1980 )〕、また、酵母とし
てカンジダ属〔Eur. J. Biochem., Vol.152,pp.657-662
(1985) 、Gene, Vol.162, pp.99-104 (1995)、Eur. J.
Biochem.,Vol.62, pp.151-160 (1976)、Biochim.Bioph
ys. Acta, Vol. 566, pp.12-20 (1979)〕、ハンセヌラ
属（EP0299108 A1, B1、特開平2-124093 ）、ハイホマ
イクロビウム属（特開平12-245471）がある。また、バ
チルス・ポリミキサ（Bacilluspolymyxa）と呼ばれる種
にギ酸脱水素酵素活性のあることが報告されているが
〔近畿大学工学部研究報告 No. 14, pp.133-139 (1980
), No.15, pp.115-123 (1981 ), No.16, pp.141-152
(1982）〕、以下の理由によりバチルス属とは非常にか
け離れた存在であることが示された。
【０００４】バチルス属は１９９３年当時、60種以上報
告されており、種のグループ分けが必要とされた。そこ
で16S rRNAの解析により６つのグループに分けられた
が、グループ３及びグループ６は系統樹的にはバチルス
属とは非常にかけ離れた存在であることが判明した〔An
tonie van Leeuwenhoek, Vol.64 pp.253-260 (1993)〕
（図１）。最近、グループ６に属するアシドカルダリウ
ス(Acidocaldarius)、シクロヘプタニカス(cycloheptan
icus)がω−シクロヘキサンまたはω−シクロヘプタン
脂肪酸を含むacidophilicな種であることからアリシク
ロバチルス属（Alicyclobacillus）と新たに分類された
〔Int. J. Syst. Bacteriol., Vol.42, pp.263-269 (19
92)〕。また、グループ６よりもさらに系統樹的にかけ
離れているグループ３に属するポリミキサ等の種も新た
にペニバチルス属に分類され、現在バチルス属とは別の
属に位置づけられている〔International Journal Of S
ystematic Bacteriology, Vol.46, No.4, pp.988-1003
(1996)〕。そのため、ギ酸脱水素酵素活性を有するバチ
ルス属に属する微生物は現在までのところ報告がない。
告されており、種のグループ分けが必要とされた。そこ
で16S rRNAの解析により６つのグループに分けられた
が、グループ３及びグループ６は系統樹的にはバチルス
属とは非常にかけ離れた存在であることが判明した〔An
tonie van Leeuwenhoek, Vol.64 pp.253-260 (1993)〕
（図１）。最近、グループ６に属するアシドカルダリウ
ス(Acidocaldarius)、シクロヘプタニカス(cycloheptan
icus)がω−シクロヘキサンまたはω−シクロヘプタン
脂肪酸を含むacidophilicな種であることからアリシク
ロバチルス属（Alicyclobacillus）と新たに分類された
〔Int. J. Syst. Bacteriol., Vol.42, pp.263-269 (19
92)〕。また、グループ６よりもさらに系統樹的にかけ
離れているグループ３に属するポリミキサ等の種も新た
にペニバチルス属に分類され、現在バチルス属とは別の
属に位置づけられている〔International Journal Of S
ystematic Bacteriology, Vol.46, No.4, pp.988-1003
(1996)〕。そのため、ギ酸脱水素酵素活性を有するバチ
ルス属に属する微生物は現在までのところ報告がない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ＮＡ
ＤＨ依存性還元酵素による酵素反応に共役し、生じたＮ
ＡＤ+を元のＮＡＤＨに再生する方法を提供することを
目的とする。
ＤＨ依存性還元酵素による酵素反応に共役し、生じたＮ
ＡＤ+を元のＮＡＤＨに再生する方法を提供することを
目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく、土壌からの微生物のスクリーニングを広く
行った結果、従来全く知られていなかったバチルス属に
属する微生物が補酵素ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換させる
ギ酸脱水素酵素活性を有することを見出し、本発明を完
成するに至った。すなわち、本発明は、ＮＡＤＨ依存性
還元酵素が関与する酵素反応の共役反応において、バチ
ルス属細菌由来のＮＡＤ+依存性ギ酸脱水素酵素を用い
ることを特徴とする、補酵素ＮＡＤＨの再生方法であ
る。以下、本発明について詳細に説明する。
解決すべく、土壌からの微生物のスクリーニングを広く
行った結果、従来全く知られていなかったバチルス属に
属する微生物が補酵素ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換させる
ギ酸脱水素酵素活性を有することを見出し、本発明を完
成するに至った。すなわち、本発明は、ＮＡＤＨ依存性
還元酵素が関与する酵素反応の共役反応において、バチ
ルス属細菌由来のＮＡＤ+依存性ギ酸脱水素酵素を用い
ることを特徴とする、補酵素ＮＡＤＨの再生方法であ
る。以下、本発明について詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明は、ＮＡＤＨ依存性還元酵
素による酵素反応の共役反応においてＮＡＤＨを再生す
る方法である。当該共役反応は、ギ酸を基質とし、ＮＡ
Ｄを補酵素としてギ酸脱水素酵素を作用させることによ
り行う。
素による酵素反応の共役反応においてＮＡＤＨを再生す
る方法である。当該共役反応は、ギ酸を基質とし、ＮＡ
Ｄを補酵素としてギ酸脱水素酵素を作用させることによ
り行う。
【０００８】目的生成物を工業的に合成するために用い
られる、ＮＡＤＨ依存性還元酵素が関与する酵素反応と
しては、代表的にはα−ケト酸を基質とし、アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼを作用させて光学活性アミノ酸を合成す
る反応、α−ケト酸を基質とし、アルコールデヒドロゲ
ナーゼを作用させて光学活性アルコールを合成する反応
などがある。
られる、ＮＡＤＨ依存性還元酵素が関与する酵素反応と
しては、代表的にはα−ケト酸を基質とし、アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼを作用させて光学活性アミノ酸を合成す
る反応、α−ケト酸を基質とし、アルコールデヒドロゲ
ナーゼを作用させて光学活性アルコールを合成する反応
などがある。
【０００９】ここで用いるギ酸脱水素酵素としては、バ
チルス属に属する微生物に由来し、ギ酸イオンをCO2に
酸化し、酵素ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換させる酵素活性
を有するものであれば特に制限はされない。バチルス属
に属する微生物としては、具体的には、Bacillus sp. M
７F-1（FERM P-18170）が挙げられ、本菌株は産業技術
総合研究所生命工学工業技術研究所に前記番号にて寄託
されている。本菌株は、本発明者らにより天然土壌から
分離された細菌であり、その菌学的性質は次の通りであ
る。
チルス属に属する微生物に由来し、ギ酸イオンをCO2に
酸化し、酵素ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換させる酵素活性
を有するものであれば特に制限はされない。バチルス属
に属する微生物としては、具体的には、Bacillus sp. M
７F-1（FERM P-18170）が挙げられ、本菌株は産業技術
総合研究所生命工学工業技術研究所に前記番号にて寄託
されている。本菌株は、本発明者らにより天然土壌から
分離された細菌であり、その菌学的性質は次の通りであ
る。
【００１０】 （１）形態的性状及び生育状態 培養温度 30℃ 細胞形態 桿菌( 1× 2〜3μm ) グラム染色 ＋ 胞子 ＋ 運動性 ＋ コロニー形態 円形 周縁波状 低凸状 光沢あり 淡黄色（不均一） 運動性 周毛 芽胞 準端立楕円芽胞、芽胞による菌体の膨化を 伴わない 肉汁液体培養 混濁 リトマスミルク 凝固
【００１１】（２）生理的性質 生育温度℃ NT カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ Ｏ／Ｆ試験 − 嫌気的生育 ＋ ５０℃での生育 − 加水分解 ＋ カゼイン ＋ 馬尿酸塩 ＋ デンプン ＋ チロシンの分解 ＋
【００１２】（３）炭水化物からの酸産生 グリセロール ＋ エリスリトール − D−アラビノース − L−アラビノース − リボース − D−キシロース − L−キシロース − アドニトール − β−メチル−D−キシロース − ガラクトース − グルコース − フラクトース ＋ マンノース − ソルボース − ラムノース − ズルシトール − イノシトール − マンニトール − ソルビトール − α−メチル−D−マンノース − α−メチル−D−グルコース − N−アセチルグルコサミン ＋ アミグダリン − アルブチン ＋ エスクリン ＋ サリシン − セロビオース ＋ マルトース ＋ 乳糖 − メリビオース − 白糖 ＋ トレハロース ＋ イヌリン − メレチトース − ラフィノース − 澱粉 − グリコーゲン − キシリトール − ゲンチオビオース − D−ツラノース − D−リキソース − D−タガトース − D−フコース − L−フコース − D−アラビトール − L−アラビトール − グルコネート ＋ ２−ケトグルコン酸 − ５−ケトグルコン酸 − β−ガラクトシラーゼ（ONPG） − アルギニンジヒドロラーゼ − リシンデカルボキシラーゼ − オルニチンデカルボキシラーゼ − クエン酸の利用性 ＋ H2S産生 − ウレアーゼ − トリプトファンデアミナーゼ − インドール産生 − アセトイン産生（ＶＰ） ＋ ゼラチナーゼ ＋ 硝酸塩還元 − 脱膣反応 ＋ ＭＲテスト ＋ クエン酸の利用 Koser ＋ Christensen ＋ 無機窒素源の利用 硝酸塩 ＋W アンモニウム塩 ＋ 生育の範囲 温度（℃） 10〜50℃ pH 6.8 ＋ 5.7 ＋ 糖類からの酸及びガス生成（酸/ガス） D−フラクトース ＋/− マルトース ＋/− デンプン ＋/− 白糖 ＋/− トレハロース ＋/− グリセリン ＋/− レシチナーゼ − リジンデカルボキシラーゼ − フェニルアラニンデアミナーゼ − NaCl生育性（％） ０ ＋ ２ ＋ ５ ＋ ７ ＋ １０ − リゾチーム存在化での生育性 ＋ 硫化水素の生成 −
【００１３】（４）分類学的考察 以上の結果、本菌は（i）好気性のグラム陽性桿菌であ
ること、（ii）運動性を示すこと、（iii）芽胞を形成
することなどの特徴から、バージェイズ マニュアル
オブ システマティック バクテリオロジー（Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology）、第２巻、1104
〜1139頁、1986年に記載されているバチルス属（Bacill
us）に属することが判明した。また、運動性を有し、芽
胞による菌体の膨化を示さず、D−ブドウ糖、L−アラビ
ノース及びD−マンニトールの４種の糖においてD−ブド
ウ糖のみから酸を産生する等の性状からバチルス・タウ
リンジエンシス（Bacillus thuringiensis）が最も近縁
な菌群と考えられるが、その菌株の特徴である硝酸塩の
還元能が陰性であること及び結晶封入体の存在が未確認
であることからバチルス属（Bacillus sp.）と考えられ
た。さらに16S rRNAの部分塩基配列を決定し、本菌株の
系統学的位置を推定した（図２参照）。この結果から、
本細菌は相同率99.00%でバチルス・セレウス（Bacillus
cereus）に最も近縁な菌群であると考えられる。以上
の結果を総合すると、本菌株はバチルス属に属する新種
の菌株であることが判明した。
ること、（ii）運動性を示すこと、（iii）芽胞を形成
することなどの特徴から、バージェイズ マニュアル
オブ システマティック バクテリオロジー（Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology）、第２巻、1104
〜1139頁、1986年に記載されているバチルス属（Bacill
us）に属することが判明した。また、運動性を有し、芽
胞による菌体の膨化を示さず、D−ブドウ糖、L−アラビ
ノース及びD−マンニトールの４種の糖においてD−ブド
ウ糖のみから酸を産生する等の性状からバチルス・タウ
リンジエンシス（Bacillus thuringiensis）が最も近縁
な菌群と考えられるが、その菌株の特徴である硝酸塩の
還元能が陰性であること及び結晶封入体の存在が未確認
であることからバチルス属（Bacillus sp.）と考えられ
た。さらに16S rRNAの部分塩基配列を決定し、本菌株の
系統学的位置を推定した（図２参照）。この結果から、
本細菌は相同率99.00%でバチルス・セレウス（Bacillus
cereus）に最も近縁な菌群であると考えられる。以上
の結果を総合すると、本菌株はバチルス属に属する新種
の菌株であることが判明した。
【００１４】本発明で使用される微生物の培養は定法通
りに行うことができる。使用する培地としてはギ酸、メ
タノールなどの炭素源、硫酸アンモニウムなどの無機窒
素源、酵母エキスなどの有機窒素源、及びリン酸塩、ナ
トリウム、カリウムなどの無機塩類を適当な割合で含有
する培地が使用される。この培地のpHは例えばpH5〜
９、好ましくは6〜８とし、温度は例えば30〜50℃、好
ましくは30〜40℃で1〜3日間培養を行う。
りに行うことができる。使用する培地としてはギ酸、メ
タノールなどの炭素源、硫酸アンモニウムなどの無機窒
素源、酵母エキスなどの有機窒素源、及びリン酸塩、ナ
トリウム、カリウムなどの無機塩類を適当な割合で含有
する培地が使用される。この培地のpHは例えばpH5〜
９、好ましくは6〜８とし、温度は例えば30〜50℃、好
ましくは30〜40℃で1〜3日間培養を行う。
【００１５】当該微生物を前述の方法で培養し、その培
養液から菌体を遠心分離により集め、これを水、生理食
塩水、リン酸やトリスなどのpHが例えばpH5〜９、好ま
しくは6〜８の緩衝液中に懸濁し、超音波処理後、遠心
分離により上清を回収する。これにギ酸及びＮＡＤを加
え、適当な温度条件の下、たとえば30℃で共存させれば
よい。その場合、ＮＡＤを反応の進行とともに逐次添加
していくことも可能である。また、上記のように培養し
た微生物菌体または培養上清から、破砕、硫安沈殿、ゲ
ル濾過、アフィニティーカラムクロマトグラフィーの手
段により酵素を精製し、得られた酵素を用いて上記のよ
うな反応を行わせることも可能である。
養液から菌体を遠心分離により集め、これを水、生理食
塩水、リン酸やトリスなどのpHが例えばpH5〜９、好ま
しくは6〜８の緩衝液中に懸濁し、超音波処理後、遠心
分離により上清を回収する。これにギ酸及びＮＡＤを加
え、適当な温度条件の下、たとえば30℃で共存させれば
よい。その場合、ＮＡＤを反応の進行とともに逐次添加
していくことも可能である。また、上記のように培養し
た微生物菌体または培養上清から、破砕、硫安沈殿、ゲ
ル濾過、アフィニティーカラムクロマトグラフィーの手
段により酵素を精製し、得られた酵素を用いて上記のよ
うな反応を行わせることも可能である。
【００１６】さらに、上記の方法で得られた微生物菌体
または酵素を、ポリアクリルアミド、光架橋性樹脂、寒
天、カラギーナンなどのゲルで包括固定化し、上記に示
したと同様なpH、温度条件下で攪拌型反応槽内でギ酸及
びＮＡＤと反応させ、またはカラムに充填し、ＮＡＤを
含有する液を流通させることにより反応させることも可
能である。反応後、得られたＮＡＤＨはそのまま水溶液
として他の還元酵素の反応に使用してもよく、精製して
から使用してもよい。また、ＮＡＤＨ再生反応中もしく
は反応前に他の還元酵素とその酵素の基質を加えて反応
させてもよい。
または酵素を、ポリアクリルアミド、光架橋性樹脂、寒
天、カラギーナンなどのゲルで包括固定化し、上記に示
したと同様なpH、温度条件下で攪拌型反応槽内でギ酸及
びＮＡＤと反応させ、またはカラムに充填し、ＮＡＤを
含有する液を流通させることにより反応させることも可
能である。反応後、得られたＮＡＤＨはそのまま水溶液
として他の還元酵素の反応に使用してもよく、精製して
から使用してもよい。また、ＮＡＤＨ再生反応中もしく
は反応前に他の還元酵素とその酵素の基質を加えて反応
させてもよい。
【００１７】
【実施例】以下本発明について実施例を挙げて具体的に
説明するが、その要旨を超えない限り以下に限定される
ものではない。
説明するが、その要旨を超えない限り以下に限定される
ものではない。
【００１８】〔実施例１〕 （ギ酸脱水素酵素活性の測
定） （１）菌株の培養 土壌サンプルから得られたバチルス・エスピー（Bacill
us sp.）M７F−１菌株（FERM P-18170）を、炭素源とし
てメタノールを含む培地〔組成：リン酸二水素カリウム
２g、硫酸アンモニウム２g、塩化ナトリウム １g、酵母
エキス0.2g、ギ酸アンモニウム１％、メタノール１％を
蒸留水に溶解して１リットルとする（pH7.0）〕に植菌
し、30℃で振とう培養を行った。培養後、集菌し、緩衝
液等で適当な量に調整した。次に菌を超音波により破砕
し、遠心分離により上清を回収した。
定） （１）菌株の培養 土壌サンプルから得られたバチルス・エスピー（Bacill
us sp.）M７F−１菌株（FERM P-18170）を、炭素源とし
てメタノールを含む培地〔組成：リン酸二水素カリウム
２g、硫酸アンモニウム２g、塩化ナトリウム １g、酵母
エキス0.2g、ギ酸アンモニウム１％、メタノール１％を
蒸留水に溶解して１リットルとする（pH7.0）〕に植菌
し、30℃で振とう培養を行った。培養後、集菌し、緩衝
液等で適当な量に調整した。次に菌を超音波により破砕
し、遠心分離により上清を回収した。
【００１９】（２）菌体反応 得られた上清（総タンパク質量：3.8 × 10-2 mg/ml）2
00μlにギ酸アンモニウム（最終濃度：10mM）と補酵素
（ＮＡＤ）（最終濃度：0.35mM）を加え、３０℃で反応
させた（反応系：3ml）。ギ酸脱水素酵素活性の測定
は、吸光度計（UV1200（島津製作所製））を用い、ＮＡ
ＤＨの吸光度変化により測定した。その結果、酵素比活
性は3.7×10-2 U/mg proteinであった。
00μlにギ酸アンモニウム（最終濃度：10mM）と補酵素
（ＮＡＤ）（最終濃度：0.35mM）を加え、３０℃で反応
させた（反応系：3ml）。ギ酸脱水素酵素活性の測定
は、吸光度計（UV1200（島津製作所製））を用い、ＮＡ
ＤＨの吸光度変化により測定した。その結果、酵素比活
性は3.7×10-2 U/mg proteinであった。
【００２０】〔実施例２〕 （ＮＡＤＨ再生系への適
用） サーモアクチノミセス・インターミディアス（ATCC3320
5）を栄養培地（トリプチカーゼ ソイ ブロス：30gを
蒸留水に溶解して１リットルとする）に植菌し、55℃で
振とう培養を行った。培養後、集菌し、緩衝液等で適当
な量に調整した。次に菌を超音波により破砕し、遠心分
離により上清を回収した。これに実施例１で用いた菌破
砕液の上清を加え、さらに４−メチル−２−オキソペン
タン酸（最終濃度：0.4M）、ギ酸アンモニウム（最終濃
度：0.5M）、補酵素（ＮＡＤ）（最終濃度：0.35mM）を
加え、３０℃で反応させた（反応系：3ml）。また、ギ
酸の有無により酵素反応がどう変化するか調べた。この
酵素反応により生成したL−ロイシンは、高速液体クロ
マトグラフィー（日本分光社製）を用いて定性及び定量
した。その結果、ギ酸を入れた反応系では３時間後のL
−ロイシン生成量は0.9mg（濃度：0.3M）であり、この
ときギ酸を入れていない反応系では反応は全く進行しな
かった。
用） サーモアクチノミセス・インターミディアス（ATCC3320
5）を栄養培地（トリプチカーゼ ソイ ブロス：30gを
蒸留水に溶解して１リットルとする）に植菌し、55℃で
振とう培養を行った。培養後、集菌し、緩衝液等で適当
な量に調整した。次に菌を超音波により破砕し、遠心分
離により上清を回収した。これに実施例１で用いた菌破
砕液の上清を加え、さらに４−メチル−２−オキソペン
タン酸（最終濃度：0.4M）、ギ酸アンモニウム（最終濃
度：0.5M）、補酵素（ＮＡＤ）（最終濃度：0.35mM）を
加え、３０℃で反応させた（反応系：3ml）。また、ギ
酸の有無により酵素反応がどう変化するか調べた。この
酵素反応により生成したL−ロイシンは、高速液体クロ
マトグラフィー（日本分光社製）を用いて定性及び定量
した。その結果、ギ酸を入れた反応系では３時間後のL
−ロイシン生成量は0.9mg（濃度：0.3M）であり、この
ときギ酸を入れていない反応系では反応は全く進行しな
かった。
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、従来知られていなかっ
たバチルス属に属する微生物のギ酸脱水素酵素活性を用
いて反応系に生じたＮＡＤ+を元のＮＡＤＨに効率よく
変換させる方法が提供される。従って、本方法をＮＡＤ
Ｈ依存性還元酵素が関与する酵素反応に共役させて用い
れば、前記酵素反応を円滑に進めることができ、その反
応生成物の収量を上げることができる。
たバチルス属に属する微生物のギ酸脱水素酵素活性を用
いて反応系に生じたＮＡＤ+を元のＮＡＤＨに効率よく
変換させる方法が提供される。従って、本方法をＮＡＤ
Ｈ依存性還元酵素が関与する酵素反応に共役させて用い
れば、前記酵素反応を円滑に進めることができ、その反
応生成物の収量を上げることができる。
【図１】バチルス属細菌の系統樹を示す。
【図２】16S rRNAの解析によるBacillus sp. M７F−１
菌株の近縁株に対する系統学的位置付けを示す。
菌株の近縁株に対する系統学的位置付けを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 13/06 (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (2)
- 【請求項１】 ＮＡＤＨ依存性還元酵素が関与する酵素
反応の共役反応において、バチルス属に属する微生物由
来のＮＡＤ+依存性ギ酸脱水素酵素を用いることを特徴
とする、補酵素ＮＡＤＨの再生方法。 - 【請求項２】 バチルス属に属する微生物が、バチルス
・エスピー（Bacillus sp.）M７F−１菌株（FERM P-181
70）である、請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001029211A JP2002233395A (ja) | 2001-02-06 | 2001-02-06 | 補酵素ｎａｄｈの再生方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001029211A JP2002233395A (ja) | 2001-02-06 | 2001-02-06 | 補酵素ｎａｄｈの再生方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002233395A true JP2002233395A (ja) | 2002-08-20 |
Family
ID=18893586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001029211A Pending JP2002233395A (ja) | 2001-02-06 | 2001-02-06 | 補酵素ｎａｄｈの再生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002233395A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008058951A1 (de) * | 2006-11-15 | 2008-05-22 | Basf Se | Verfahren zur enzymatischen reduktion von alkenderivaten |
| EP1959019A1 (de) * | 2006-12-22 | 2008-08-20 | Basf Se | Verfahren zur enzymatischen Reduktion von Alkenderivaten |
| WO2011016102A1 (ja) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | トヨタ自動車株式会社 | 変異型ギ酸脱水素酵素、これをコードする遺伝子及びnadhの製造方法 |
| US7987097B2 (en) | 2005-08-30 | 2011-07-26 | Lg Electronics | Method for decoding an audio signal |
| FR2961825A1 (fr) * | 2010-06-29 | 2011-12-30 | Univ Toulouse 3 Paul Sabatier | Nouveau procede de regeneration enzymatique continue de nadh et de detection de nad+ et systeme pour sa mise en oeuvre |
| WO2017119731A1 (ko) | 2016-01-06 | 2017-07-13 | 주식회사 씨원켐 | Co 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법 |
| WO2022255160A1 (ja) * | 2021-06-03 | 2022-12-08 | Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ株式会社 | 組換え微生物及びこれを用いたｌ－ロイシンを製造する方法 |
-
2001
- 2001-02-06 JP JP2001029211A patent/JP2002233395A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7987097B2 (en) | 2005-08-30 | 2011-07-26 | Lg Electronics | Method for decoding an audio signal |
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| US8313923B2 (en) | 2006-11-15 | 2012-11-20 | Basf Se | Process for enzymatic reduction of alkene derivatives |
| EP1959019A1 (de) * | 2006-12-22 | 2008-08-20 | Basf Se | Verfahren zur enzymatischen Reduktion von Alkenderivaten |
| WO2011016102A1 (ja) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | トヨタ自動車株式会社 | 変異型ギ酸脱水素酵素、これをコードする遺伝子及びnadhの製造方法 |
| US8481294B2 (en) | 2009-08-03 | 2013-07-09 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Mutant formate dehydrogenase, gene encoding the same, and method for producing NADH |
| FR2961825A1 (fr) * | 2010-06-29 | 2011-12-30 | Univ Toulouse 3 Paul Sabatier | Nouveau procede de regeneration enzymatique continue de nadh et de detection de nad+ et systeme pour sa mise en oeuvre |
| WO2012001305A3 (fr) * | 2010-06-29 | 2012-04-05 | Universite Paul Sabatier Toulouse Iii | Nouveau procédé de régénération enzymatique continue de nadh et de détection de nad+ et système pour sa mise en oeuvre |
| WO2017119731A1 (ko) | 2016-01-06 | 2017-07-13 | 주식회사 씨원켐 | Co 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법 |
| US10240170B2 (en) | 2016-01-06 | 2019-03-26 | C1Chem Co., Ltd. | CO hydratase and method for producing formate using the same |
| WO2022255160A1 (ja) * | 2021-06-03 | 2022-12-08 | Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ株式会社 | 組換え微生物及びこれを用いたｌ－ロイシンを製造する方法 |
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