JP2003199559A - アルカリプロテアーゼ生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 バチルス属に属し、配列番号１で示され
る塩基配列又はこれと９８％以上の相同性を有する塩基
配列からなる１６ＳリボゾーマルＤＮＡを有するアルカ
リプロテアーゼ生産菌。 【効果】 本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌によれ
ば、優れた酸化剤耐性を有し且つゼラチン分解能の高
い、洗剤用、写真工業、食品加工用のアルカリプロテア
ーゼが工業的に生産できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は工業的に利用価値の
高いアルカリプロテアーゼを生産する新規バチルス属細
菌に関する。

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】プロテ
アーゼは、３０年以上も前から衣料用洗剤に配合されて
きたタンパク質を分解する酵素であり、衣類に付着した
タンパク質系の汚れ、襟袖の汚れ、食べこぼし汚れ、血
液汚れ等に洗浄助剤として効果を発揮してきた。中でも
アルカリプロテアーゼは、衣料用洗剤を始めとして、洗
顔剤、浴用剤、義歯洗浄剤、コンタクトレンズ洗浄剤等
のトイレタリー分野、低アレルゲン化ラテックス製造等
の化学品分野、烏賊の皮むき用、食肉軟化用等の食品分
野、消化助剤や消炎剤といった医薬品分野等で利用され
ている。

【０００２】衣料等の汚れはタンパク質だけでなく、皮
脂汚れや微粉塵等複数の成分が含まれていることから、
洗剤用プロテアーゼとしてはタンパク質複合汚れに対し
て高い洗浄力を示す洗剤用アルカリプロテアーゼの取得
が望まれており、斯かる観点から、本発明者らは高濃度
の脂肪酸存在下でもプロテアーゼ活性を保持し、タンパ
ク質だけでなく皮脂等の汚れを含む複合汚れに対して優
れた洗浄力を示すバチルス属細菌の生産する分子量約４
３，０００のアルカリプロテアーゼを見出し、先に特許
出願した（ＷＯ９９／１８２１８号公報）。

【０００３】この分子量約４３ｋＤａのアルカリプロテ
アーゼは、他のバチルス属細菌からもいくつか見出され
ており、いずれも従来からのズブチリシンタイプのセリ
ンプロテアーゼに比べて非常に高い酸化剤耐性を有して
おり、酸化剤耐性アルカリプロテアーゼとして新しいズ
ブチリシンサブファミリーを形成するものと提唱されて
いる（Biochem. Biophys. Res. Commun., 279, 313-31
9, 2000）。

【０００４】このように、数種のバチルス属細菌が新し
いタイプのアルカリプロテアーゼを生産することが明ら
かになってきたが、これら以外の新しいバチルス属細菌
によっても同様な酵素が生産される可能性は大きい。従
って、酸化剤耐性アルカリプロテアーゼを生産するバチ
ルス属の新規な細菌を探索し、酵素生産に係わる応用の
可能性を広げることが求められている。一方、写真工業
や食品工業においては、ゼラチンを良好に分解できるプ
ロテアーゼがフィルムの処理、食品加工等の分野で求め
られている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、日本各地
の土壌サンプル中から、タンパク質複合モデル汚染布に
対し極めて高い洗浄力を示すアルカリプロテアーゼ生産
菌を選抜し、菌株並びに産生酵素の諸性質について研究
を行ったところ、特定の１６ＳリボゾーマルＤＮＡ（以
下、「１６ＳｒＤＮＡ」という）を有するバチルス属細
菌が、優れた酸化剤耐性を有すると共にゼラチンに対す
る高い分解活性を示し、工業的に有用なアルカリプロテ
アーゼを生産し得ることを見出した。

【０００６】すなわち本発明は、バチルス属に属し、配
列番号１で示される塩基配列又はこれと９８％以上の相
同性を有する塩基配列からなる１６ＳリボゾーマルＤＮ
Ａを有するアルカリプロテアーゼ生産菌を提供するもの
である。

【０００７】また本発明は、バチルス エスピー ＫＳ
Ｍ−９８６５（ＦＥＲＭ−Ｐ１８５６６号）として寄託
されたアルカリプロテアーゼ生産菌を提供するものであ
る。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のアルカリプロテアーゼ生
産菌は、バチルス属に属し、配列番号１で示される塩基
配列又はこれと９８％以上の相同性を有する塩基配列か
らなる１６ＳｒＤＮＡを有するものである。配列番号１
で示される塩基配列からなる１６ＳｒＤＮＡを有する好
適な菌株としては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ
−９８６５株及びこれと遺伝学的に同種の菌株が挙げら
れる。また、配列番号１で示される塩基配列と９８％以
上の相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＤＮＡを
有する菌株としては、例えば配列番号１で示される塩基
配列からなる１６ＳｒＤＮＡとＧＥＮＥＮＴＹＸ−ＭＡ
Ｃプログラム（ソフトウェア開発，Ｖｅｒ３６）を用い
たマキシマムマッチング法による相同性検索をを行った
場合に９８％以上の相同性を示す１６ＳｒＤＮＡを有す
るものが挙げられ、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ
−９８６５株と遺伝学的に同種の菌株及びこれと近縁の
菌株であって、ＫＳＭ−９８６５株が産生するアルカリ
プロテアーゼと同一若しくは類似の性質を有するプロテ
アーゼを産生する菌株が挙げられる。

【０００９】以下、本発明のアルカリプロテアーゼ生産
菌の性質について、バチルス エスピー ＫＳＭ−９８
６５を例に挙げて説明する。尚、本発明アルカリプロテ
アーゼ生産菌の性質を検討するに当たり、比較として、
類似の酸化剤耐性アルカリプロテアーゼを生産する公知
のバチルス属細菌：バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ
４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）（ＷＯ９９／１８２
１８号公報）、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８
６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）（ＷＯ９９／１８２
１８号公報）、バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ１７９
０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３３）（ＷＯ９９／１８２１
８号公報）、バチルス Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−
１５９２）（特公昭５６−４２３６号公報）、バチルス
エスピー Ｙ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２９）（特公平
３−９９７号公報）、バチルス ＳＤ５２１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１１１６２）（特開平１−３３００６９号公
報）、バチルス エスピー ＮＣＩＢ１２２８８、バチ
ルス エスピー ＮＣＩＢ１２２８９、バチルス エス
ピー ＮＣＩＢ１２５１２及びバチルス エスピー Ｎ
ＣＩＢ１２５１３（ＷＯ８８／０１２９３号公報）を選
択した。

【００１０】（２）菌学的性質 （Ａ）形態学的性質 （ａ）形及び大きさ：桿菌（０．５〜０．７×１．３〜
３．５μｍ） （ｂ）胞子の有無、形、位置、大きさ：胞子嚢は膨潤、
楕円形、中央（０．７〜０．８５×１．３〜１．７μ
ｍ） （ｃ）多形性：無し （ｄ）運動性：有り （ｅ）グラム染色：陽性

【００１１】（Ｂ）生理学的性質 （ａ）カタラーゼ：陽性 （ｂ）オキシダーゼ：陽性 （ｃ）ＶＰ反応：陽性 （ｄ）硝酸塩の還元：陽性 （ｅ）脱窒反応：陰性 （ｆ）澱粉加水分解：陽性 （ｇ）プルラン加水分解：陽性 （ｈ）カゼイン加水分解：陽性 （ｉ）ゼラチン加水分解：陽性 （ｊ）馬尿酸加水分解：陰性 （ｋ）Ｔｗｅｅｎ４０加水分解：陽性 （ｌ）Ｔｗｅｅｎ６０加水分解：陽性 （ｍ）Ｔｗｅｅｎ８０加水分解：陽性 （ｎ）クエン酸の利用：陽性 （ｏ）プロピオン酸の利用：陰性 （ｐ）チロシン分解：陽性 （ｑ）フェニルアラニンの脱アミノ反応：陰性 （ｒ）レシチナ―ゼ反応：陰性 （ｓ）インドールの生成：陰性 （ｔ）ジヒドロキシアセトンの生成：陽性 （ｕ）生育ｐＨ範囲：ｐＨ７．４〜１０．７ （ｐＨ
８．５〜８．８が最適） （ｖ）生育温度範囲：１２．７℃〜４０℃ （３６℃付
近が最適） （ｗ）塩化ナトリウム耐性：７％塩化ナトリウムまで生
育 （ｘ）糖類の利用性： 以下の糖を唯一の炭素源として利用できる：グルコー
ス、マンノース、マルトース、イノシトール、シューク
ロース，フラクトース、マン二トール、ズルシトール、
ソルビトール、ラフィノース、ガラクトース、ゲンチオ
ビオース、リボース、ツラノース、サリシン、メレチト
ース、Ｎ―アセチルグルコサミン。 以下の糖類を利用できない：ラクトース、グリセロー
ル、エリスリトール、アラビノース、メリビオース、ラ
ムノース、キシロース、キシリトール、アラビトール、
タガトース、リキソース。

【００１２】以上の試験に用いた培地は、Bergey's Man
ual of Systematic Bacteriology vol.2 (Sneath, P.H.
A.ら、Williams & Wilkins, Baltimore, 1986)又はNiel
senらの方法（Microbiology, 141, 1745-1761,1995）に
従った。

【００１３】（２）遺伝学的性質 （ａ）１６ＳｒＤＮＡの解析 Ｓｈｉｍａらの方法（FEMS Microbiol. Lett. 119, 119
-122,1994）に従い、ＰＣＲ法によって１６ＳｒＤＮＡ
のダイレクトシークエンスを行い、塩基配列を明らかに
した（配列番号１）。そして、ＣｌｕｓｔａｌＷプログ
ラムを用いて系統樹を作成したことろ、本発明のＫＳＭ
−９８６５株は、Bacillus psychrodurans DSM11713及
びBacillus psychrotolerans DSM11706に近い位置に分
類されるが異なる菌株であることが示された（図１）。
尚、B. psychrodurans DSM11713及びB.psychrotolerans
DSM11706の１６ＳｒＤＮＡと本発明ＫＳＭ−９８６５
株のそれとの相同性は、それぞれ９７．７％及び９７．
５％であった。

【００１４】（ｂ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョン 類似のアルカリプロテアーゼを産生すると予想される公
知のバチルス属細菌（バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｋ
Ｐ４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）、バチルス エス
ピー ＮＣＩＢ１２２８８、バチルス エスピー ＮＣ
ＩＢ１２２８９、バチルス エスピー ＮＣＩＢ１２５
１２、バチルス エスピー ＮＣＩＢ１２５１３）との
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを、フォトビオ
チンラベルＤＮＡプローブを用い、Ezakiらの方法（In
t. J. Syst. Bacteriol. 39, 224-229, 1989）により行
ったところ、本発明のＫＳＭ−９８６５株はこれらのバ
チルス属細菌と最大で３２〜４２％（バチルス エスピ
ー ＮＣＩＢ１２５１２）、最低で０％（バチルス エ
スピー ＮＣＩＢ１２２８９）というリアソシエーショ
ン率を示した。以上より、本発明のＫＳＭ−９８６５株
は、上記バチルス属細菌とは異なる菌株である。

【００１５】更に、酸化剤耐性アルカリプロテアーゼ生
産菌であるバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ１７９
０、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＷＯ
９９／１８２１８号公報）、バチルス エスピー Ｙ、
バチルス エスピー Ｄ−６、バチルス エスピー Ｓ
Ｄ５２１と比較すると、バチルス エスピー ＫＳＭ−
ＫＰ１７９０は、胞子嚢の膨潤が認められないこと、硝
酸塩を還元しないこと、ｐＨ６．２で生育可能なこと、
ＶＰテスト陰性、クエン酸を利用しないこと等多くの点
で本発明のＫＳＭ−９８６５とは異なり、バチルス エ
スピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０は、硝酸塩を還元しない
こと、ｐＨ６．２で生育可能なこと、ＶＰテスト陰性、
クエン酸を利用しないことより、やはり本発明ＫＳＭ−
９８６５とは異なる性質を有している。一方、バチルス
エスピー Ｙ、バチルス エスピー Ｄ−６、バチル
ス エスピー ＳＤ５２１については１６ＳｒＤＮＡの
解析結果から、Bacillus cohniiに近縁であることが示
されている。

【００１６】以上のことから、本発明のＫＳＭ−９８６
５株は、公知の酸化剤耐性を有する新しいタイプのアル
カリプロテアーゼ生産菌とは異なることは明白であり、
また他のバチルス属細菌の中にも本発明のＫＳＭ−９８
６５株は存在しないことから、独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センターにバチルス エスピーＫ
ＳＭ−９８６５として寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１８５６６号）。

【００１７】本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は、
適当な液体培地を用いて好気的に培養することにより菌
体外にアルカリプロテアーゼを生産させることができ
る。培地中には資化しうる炭素源、窒素源、更にビタミ
ン類、金属塩類等の微量栄養源を適当に組合せ、培地の
ｐＨは８〜１０の間に調整し、培養温度は２５〜４０
℃、２〜５日間振盪培養を行えば良い。使用する炭素
源、窒素源は特に限定されないが、炭素源としてはグル
コース、マルトース、フラクトース、シュークロース、
可溶性澱粉等、窒素源としては魚肉エキス、各種アミノ
酸、酵母エキス、肉エキス、ポリペプトン、コーンステ
ィープリカー、ソイビーンミール、アジプロン、無機窒
素化合物等が挙げられる。また、その他のリン酸、Ｍｇ
²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ｆｅ³⁺、Ｎ
ａ⁺、Ｋ⁺等の無機塩、ビオチン、パントテン酸、ピリド
キサール、チアミン等のビタミン類を添加することもで
きる。

【００１８】かくして得られた培養液からアルカリプロ
テアーゼを得るには目的に応じて精製、結晶化、あるい
は造粒化すればよい。また、アルカリプロテアーゼの生
産量を高めるために本発明菌株を変異育種することで得
られる高生産変異株も使用することができる。

【００１９】さらに、本発明菌株の遺伝子から目的とす
るアルカリプロテアーゼ遺伝子をクローン化することも
できる。得られた遺伝子を用いたアルカリプロテアーゼ
の生産方法は、例えば当該遺伝子を安定に増幅できるプ
ラスミドベクターに連結させる、あるいは当該変異遺伝
子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させる等の
方法でアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を安定
に増幅し、さらに当該遺伝子を安定にかつ効率よく発現
させることが可能である宿主に導入し、アルカリプロテ
アーゼを生産させる方法が採用できる。この条件を満た
す宿主菌としては例えば本発明のバチルス エスピー
ＫＳＭ−９８６５をはじめとするバチルス属細菌、大腸
菌、カビ、酵母、放線菌等が挙げられる。

【００２０】次に、バチルス エスピー ＫＳＭ−９８
６５が産生するアルカリプロテアーゼ（Ｋ−９８６５）
の性質を示す。 （１）分子量 １２．５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（分子量マーカーとしてファ
ルマシアのLow molecular weight marker を使用）によ
り求めた精製酵素の分子量は、約４３，０００である。

【００２１】（２）基質特異性 各種タンパク質基質に対する分解活性は、高アルカリ至
適のズブチリシンであるＫ−１６プロテアーゼ（Appl.M
icrobiol.Technol. 43、473-481、1995）と比較した場
合、卵黄やゼラチンに対する分解活性が高く、特にゼラ
チンに対しては下表１に示すようにカゼインに対する活
性値の１０倍近い分解活性を有する。

【００２２】

【表１】

【００２３】また合成基質であるＢＡＥＥ（Nα-benzoy
l-L-arginine-ethylester）、ＢＴＥＥ（N-benzoyl-L-t
rosine-ethylester）、ＡＴＥＥ（N-acetyl-L-tyrosine
-ethylester）及びＴＡＭＥ（Nα-p-tosyl-L-arginine-
methylester）に対する分解活性（５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８）中（基質濃度０．５ｍＭ））は、ＢＴ
ＥＥのみに作用し、２５６ｎｍにおける吸光度の増加を
認める。

【００２４】（３）酸化剤耐性 ５０ｍＭ過酸化水素水を含む１００ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ１０．５）２ｍＬ中にＫ−９８６５を添加し、３
０℃で３０分間放置し、充分量のカタラーゼ（ベーリン
ガーマンハイム）を加えて余剰の過酸化水素を除いた後
の残存プロテアーゼ活性を合成基質法にて測定した場
合、過酸化水素水による処理前の活性を１００％とする
と、９０％以上の残存活性を有する（同条件で処理した
Ｋ−１６プロテアーゼの残存活性が５％以下である）。

【００２５】（４）最適反応ｐＨ カゼインを基質として各ｐＨの緩衝液中で酵素反応を行
った場合、ｐＨ４−１３の間で作用し、最適反応ｐＨは
１１付近（ホウ酸緩衝液）であり、ｐＨ７−１２におい
てもｐＨ１１での活性値の８０％以上の活性を示す。

【００２６】（５）最適反応温度 カゼインを基質として５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１
０．５）中、各温度で酵素反応を行った場合、最適反応
温度は６０℃付近であり、５ｍＭカルシウムを添加した
場合、最適温度は７０℃にシフトする。

【００２７】（６）等電点 等電点は、等電点電気泳動法（mini IEF Cell modelII
I：バイオラッド）により求めた。すなわち、２％アン
フォライン（ファルマライト、ｐＨ８−１０．５：ファ
ルマシア）を含む５％アクリルアミドゲルを用い、等電
点マーカーキット（バイオラッド）の標準タンパク質の
移動度から測定した等電点は、約ｐＨ９．５である。

【００２８】以上のとおり、本発明のアルカリプロテア
ーゼ生産菌が産生するアルカリプロテアーゼは、公知の
類似菌株から生産されるプロテアーゼと比較して、優れ
た酸化剤耐性を有し且つ高いゼラチン分解能を有する。

【実施例】実施例１ ＫＳＭ−９８６５株の分離 土壌サンプル（０．２ｇ）を１０ｍＬの生理食塩水に懸
濁し、８０℃で１０分間恒温した後、表２に示した組成
の液体培地（１０ｍＬ）を分注した大型試験管へ接種
し、２０℃にて３〜５日間振盪培養を行った。同培地を
用いて２回植え継ぎを行った後、適当に希釈した培養液
を表２に示した組成の寒天平板培地に塗抹した。２０℃
で５〜７日間培養したところ、プロテアーゼ生産菌の周
辺はスキムミルクの分解によって生じる溶解斑が認めら
れ、これらのプロテアーゼ生産菌を選抜した。得られた
菌株は表３に示す組成の液体培地へ接種し、３０℃で２
４時間振盪培養を行った。一部の培養上清を採り、過酸
化水素水（ｐＨ１０．５）中、３０℃、３０分間放置し
た後の活性が対照に比べ５０％以上残存しているプロテ
アーゼを選抜した。中でも残存活性の高かったプロテア
ーゼ生産菌としてＫＳＭ−９８６５株を選抜した。尚、
活性測定法は以下に述べる２通りの方法を用いた。培養
活性はカゼイン法でまた酸化剤耐性を調べる場合には合
成基質法を採択した。

【００２９】［プロテアーゼ活性測定法−カゼイン法］
カゼイン１％（hanmerstein、メルク社製）を含む５０
ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）１．０ｍＬを３０℃で５
分間保温した後、０．１ｍＬの酵素溶液を加え、１５分
間反応を行った。反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢
酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）を
２．０ｍＬ加え、室温で１０分間放置したのち、濾過
（Ｎｏ．１濾紙、アドバンテック東洋）を行い、濾液中
の酸可溶タンパク質をＬｏｗｒｙらの方法（J.Biol. Ch
em.、193、265-275、1981）により次のように定量した。
０．５ ｍＬの濾液にアルカリ性銅溶液［１％酒石酸ナ
トリウムカリウム：１％硫酸銅：１％炭酸ナトリウム＝
１：１：１００］を２．５ｍＬ添加し、３０℃にて１０
分間放置後、希釈フェノール液（フェノール試薬（関東
化学）を脱イオン水で２倍希釈）０．２５ｍＬを添加し
て３０分間恒温したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を
測定した。酵素１単位は、上記反応にて１分間に１ｍｍ
ｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を
遊離させるのに必要な酵素量とした。

【００３０】［プロテアーゼ活性測定法−合成基質法］
合成基質（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ｎｉ
ｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、ペプチド研究所）２．５ｍＭを
含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）に酵素溶液を加
え（全量０．５ｍＬ）、３０℃中で１０分間反応を行っ
た。２ｍＬの５％クエン酸を添加し反応を停止した後、
４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素１単位は、
上記反応にて１分間に１μｍｏｌのｐ−ｎｉｔｒｏａｎ
ｉｌｉｎｅを生成する酵素量とした。

【００３１】

【表２】

【００３２】

【表３】

【００３３】実施例２ アルカリプロテアーゼ（Ｋ−９
８６５）の精製 実施例１で得られたＫＳＭ−９８６５株をポリペプトン
Ｓ、マルトースを主成分とする液体培地に接種し、３０
℃で６０時間振盪培養した。遠心分離により得られた培
養上清液（３Ｌ）に９０％飽和となるように硫酸アンモ
ニウムを添加し、タンパク質を塩析した。遠心分離によ
り得られた沈殿物を少量の２ｍＭ塩化カルシウムを含む
１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５：緩衝液Ａ）に
溶解した後、同緩衝液にて一晩透析を行なった。透析内
液（２００ｍＬ）を予め緩衝液Ａにて平衡化しておいた
ＤＥＡＥ トヨパールカラム（２．５×１４ｃｍ：東ソ
ー）に添着させ、非吸着のプロテアーゼ活性画分を回収
した（４００ｍＬ）。次にこの活性画分を限外濾過（Ｙ
Ｍ３メンブレン：アミコン）により３０ｍＬまで濃縮
し、緩衝液Ａにて平衡化しておいたＳＰ−トヨパール５
５０Ｗ（１．５×８ｃｍ：東ソー）に添着させ、０−５
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａを用いた直線濃
度勾配法により吸着したタンパク質を溶出した。プロテ
アーゼ活性を示す画分は非吸着画分にやや遅れて溶出さ
れた。この画分についてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、均一なプロテアーゼが得られている
ことを確認した（比活性１５０Ｕ／ｍｇ、活性収率１５
％）。タンパク質濃度の測定は牛血清アルブミン(バイ
オラッド)を標準タンパク質として用いてＬｏｗｒｙら
の方法に準じて行った。

【００３４】

【発明の効果】本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌に
よれば、優れた酸化剤耐性を有し且つゼラチン分解能の
高い、洗剤用、写真工業、食品加工用のアルカリプロテ
アーゼが工業的に生産できる。

【００３５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> An alkaline protease productive microorganism <130> P00031401 <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1380 <212> DNA <213> Bacillus sp. KSM-9865 <400> 1 ttgttcttct aatttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggcaacctg ccctntagat 60 tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccgaataatc catttcctca catgnggnaa 120 tnttgaaaga cggtttcggc tgtcactaca ggatgggccc gcggcgcatt agctagttgg 180 tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 240 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat 300 ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggntttcgga tcgtaaaact 360 ctgttgtgag ggaagaacaa gtacgagagt aactgctcgt accttgacgg tacctcanna 420 gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttntc 480 cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtccttta agtctgatgt gaaagcccac 540 ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg ggggacttga gtgcagaaga ggaaagcgga 600 attccaagtg tagcggtgaa atgcgtagag atttggagga acaccagtgg cgaaggcggc 660 tttctggtct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 720 cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt 780 gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa 840 aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 900 agaaccttac caggtcttga catcccgntg accgncctaa aaataggctt ttcccttcgg 960 gganannngt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1020 agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag 1080 gtgactgccg gtgataaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1140 tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cggtacagag ggtcgcaaac ccgcgagggt 1200 gagctaatcc cataaaaccg ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa 1260 gccggaatcg ctagtaatcg tggatcagca tgccacggtg aatacgttcc cgggccttgt 1320 acacaccgnc ccgtcacacc acgagagttn gtaacacccg aagtcggtgg ggtaaccctt 1380

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６
５の１６ＳｒＤＮＡ配列に基づく系統樹を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA14 CA01 HA20 4B065 AA15X AC14 BA22 BB16 CA33 CA57 4H003 DA01 EC02 FA47

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス属に属し、配列番号１で示され
   る塩基配列又はこれと９８％以上の相同性を有する塩基
   配列からなる１６ＳリボゾーマルＤＮＡを有するアルカ
   リプロテアーゼ生産菌。
2. 【請求項２】 以下の性質（１）〜（３）を有するアル
   カリプロテアーゼを生産する請求項１記載のアルカリプ
   ロテアーゼ生産菌； （１）分子量：４３，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動法）、 （２）基質特異性：タンパク質、ペプチド基質に対して
   良好に作用し、特にゼラチンに対して強い分解活性を示
   す、 （３）酸化剤耐性：５０ｍＭ過酸化水素中（ｐＨ１０）
   ３０℃、３０分間処理した場合、９０％以上の活性を保
   持する。
3. 【請求項３】 更に以下の性質（４）〜（６）を有する
   アルカリプロテアーゼを生産する請求項２記載のアルカ
   リプロテアーゼ生産菌； （４）最適反応ｐＨ：カゼインを基質とした場合、ｐＨ
   ４〜１３の広い範囲で作用し、ｐＨ６〜１２で最適ｐＨ
   活性値の８０％以上を示す、 （５）最適温度：カゼインを基質とした場合、ｐＨ１
   ０．５のホウ酸緩衝液中で６０℃、カルシウムイオン添
   加（５ｍＭ）の場合７０℃、 （６）等電点：ｐＨ９．５付近（等電点電気泳動法）。
4. 【請求項４】 バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５
   （ＦＥＲＭ−Ｐ１８５６６号）として寄託された請求項
   １〜３のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼ生産
   菌。
5. 【請求項５】 バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５
   （ＦＥＲＭ−Ｐ１８５６６号）として寄託されたアルカ
   リプロテアーゼ生産菌。