KR100466264B1

KR100466264B1 - 산화제 및 계면활성제에 안정한 단백질 분해 효소 및 그를 생산하는 미생물

Info

Publication number: KR100466264B1
Application number: KR10-2002-0013560A
Authority: KR
Inventors: 장정순; 백승렬; 주한승; 박건춘; 쿠마르씨.가네쉬; 김기태
Original assignee: 주식회사 서린바이오사이언스; 학교법인 인하학원
Priority date: 2002-03-13
Filing date: 2002-03-13
Publication date: 2005-01-14
Also published as: KR20030073816A

Abstract

본 발명은 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 속 균주(Bacillussp. 104) 및 상기 균주로부터 생산되는 단백질 분해효소에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 흰이빨 참갯지렁이(Periserrula leucophryna)로부터 분리한 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 속 균주, 상기 균주로부터 단백질 분해효소를 분리 및 대량생산하는 방법 및 상기 분리방법에 의해 생산된 단백질 분해효소에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 속 균주로부터 분리한 단백질 분해효소는 높은 농도의 계면활성제 및 산화제가 존재하여도 활성을 유지하기 때문에 의류용 또는 콘택트 렌즈용 세제의 성분으로 유용하며, 식품, 사료, 천연 가죽 등의 가공 및 유기 폐기물의 처리에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산화제 및 계면활성제에 안정한 단백질 분해 효소 및 그를 생산하는 미생물{Bacillus producing oxidant and detergent-resistant protease}

본 발명은 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 속 균주(Bacillussp. 104) 및 상기 균주로부터 생산되는 단백질 분해효소에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 흰이빨 참갯지렁이(Periserrula leucophryna)로부터 분리한 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 속 균주, 상기 균주로부터 단백질 분해효소를 분리 및 대량생산하는 방법 및 상기 분리방법에 의해 생산된 단백질 분해효소에 관한 것이다.

단백질 분해효소(protease)는 생체내에서 소화, 흡수 및 방어 등의 다양한 기능을 하고 있으며 활성 자리의 구조에 따라 세린 계열, 시스테인 계열, 아스파르트산 계열 및 메탈로 계열 단백질 분해효소로 구분된다. 단백질 분해효소는 그 용도가 다양하여 혈전의 용해 등과 같은 사람의 질병 치료용 이외에도 의류용 세제의 성분, 콘택트 렌즈 세정제의 성분으로 이용될 뿐만 아니라 우유 단백질의 변형, 견섬유의 고무질 제거(silk degumming), 사료의 개선, 가죽의 침지(soaking), 제모 (dehairing), 엑스선 필름(X-ray)으로부터 은의 회수 및 단백질 용액 농축에 사용되는 한외 여과막의 재생 등에서 다양하게 이용되고 있다.

단백질 분해효소를 산업적 용도에서 사용하는 경우 생체 내부의 항상적 환경에 비해 변화가 심하고, 보다 극심한 생체 외부 환경에서 단백질 분해효소가 활성을 유지해야 하기 때문에 매우 안정한 단백질 분해효소가 요구된다. 예를 들어, 계면활성제 존재시 대부분의 단백질은 활성이 감소하거나 완전히 사라지기 때문에, 세제에 사용되는 단백질 분해효소는 극히 제한되어 있으며, 고농도로 상기 세제를 사용할 경우 이에 함유된 단백질 분해효소의 활성을 기대하기 어렵다. 게다가 생체 외부 환경에서는 pH, 중금속에의 노출, 산화-환원 정도 등의 조건이 생체 내부에 비해 훨씬 변화가 심한데, 이들 조건은 모두 일반적으로 효소의 활성에 강하게 영향을 주어, 이들 조건이 적정 범위를 벗어나면 효소는 급격히 활성을 잃게 된다. 따라서, 단백질 분해효소가 본격적으로 산업에 이용되기 위해서는, 극심하고 불안정한 물리적, 화학적 조건에도 불구하고 활성을 유지하는 것이 요구된다. 즉, 단백질 분해효소가 산업용으로 사용되기 위해서는 첫째, 계면활성제에 의하여 단백질 분해효소의 활성이 억제를 받지 말아야 하고, 둘째 산소계 표백제에 의하여 그 활성이 억제를 받지 말아야 하고, 셋째 높은 pH 조건에서 활성을 유지해야 하며, 네 째 중저온(20∼30℃)에서 높은 효소 활성을 가져야 하며, 다섯째 중금속에 의하여 효소 활성이 억제를 받지 말아야 하며, 여섯째 효소 활성에 칼슘이온을 필요로 하지 말아야 한다. 상기와 같은 조건들을 충족시키는 단백질 분해효소를 만들기 위하여 미국 특허 제534075호 및 제6136553호에는 기존의 단백질 분해효소로부터 특이적인 돌연변이를 적용하여 보다 우수하고 안정성이 높은 단백질 분해효소를 개발하였다고 명시하고 있다. 이와 병행하여 미국 특허 제6162635호 등에서는 상기의 조건을 충족하는 단백질 분해효소를 생산하는 균주들을 토양 등 자연계로부터 탐색하여 산업용으로 사용하고자 시도하고 있다. 그러나 아직까지 상기의 모든 조건을충족시키는 단백질 분해효소가 제조되지 못하고 있는 실정이다. 특히 산소계 표백제 및 계면활성제에 모두 안정한 단백질 분해효소는 극히 제한적으로 보고되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 인식하여 한국의 서해안 갯벌에 서식하는 흰이빨 참갯지렁이(Periserrula leucophryna)로부터 여러 가지 균주를 탐색하고, 이들 균주 중에서 저온에서도 그 활성을 비교적 높게 유지되며 중금속에 의하여 그 활성이 억제되지 않고 광범위한 pH에서도 활성이 안정하게 유지되고, 특히 음이온성 계면활성제에 매우 안정하며 산소계 표백제에 사용되는 산화제(예; 과산화수소, 소디움 퍼보레이트)에 매우 뛰어난 안정성을 갖는 단백질 분해효소를 생산하는 균주를 분리, 동정하고, 상기 균주로부터 알카리성 단백질 분해효소를 분리하고, 이를 산업적으로 사용하기 위하여 대량 생산할 수 있는 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 극심한 물리 화학적 조건하에서도 활성을 유지하는 단백질 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주, 상기 균주로부터 생산되는 단백질 분해효소 및 상기 균주를 배양하여 단백질 분해효소를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 단백질 분해효소로 SDS-PAGE를 수행한 사진이고,

M: 표준 단백질, 1: 디이에이이-세파로즈 단계

2: 본 발명에서 정제한 단백질 분해효소,

도 2는 pH의 변화에 따른 본 발명의 단백질 분해효소의 효소 활성을 나타낸 그래프이고,

도 3은 온도의 변화에 따른 본 발명의 단백질 분해효소의 효소 활성을 나타낸 그래프이고,

도 4는 음이온성 계면 활성제의 농도에 따른 본 발명의 단백질 분해효소의 효소 활성을 나타낸 그래프이고,

도 5는 과산화 수소수의 농도에 따른 본 발명의 단백질 분해효소의 효소 활성을 나타낸 그래프이고,

도 6은 소디움 퍼보레이트의 농도에 따른 본 발명의 단백질 분해효소의 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 극심한 물리 화학적 조건하에서도 활성을 유지하는 단백질 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되는 단백질 분해효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 단백질 분해효소를 분리하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 단백질 분해효소를 대량생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 단백질 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 제공한다.

본 발명의 바실러스 속 균주는 흰이빨 참갯지렁이의 체액으로부터 분리되었고, 그램 양성이며서열번호 1로 기재되는 16S 리보소말 RNA를 갖고 있다.

본 발명의 바실러스 속 균주의 균학적 특성은 하기표 1에 나타난 바와 같다.

특성	바실러스 속 균주 104
그람염색	+, Rod
포자형성	+
카탈라제	+
옥시다제	+
우레아제	-
니트레이트의 환선	+
인돌 생산	-
아세테이느	+
시트레이트	+
글루타메이트	+
아라비노스	+
글루코스	+
프럭토스	+
갈락토스	+
만노스	+
락토스	+
말토스	+
이노시톨	+
만니톨	+
소비톨	+
전분	+
카세인	+
젤라틴	+

본 발명자들은 상기 균주를 '바실러스 속 균주(Bacillussp. 104)'로 명명하고, 이를 2002년 2월 5일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10166BP).

또한, 본 발명은 상기 바실러스 속 균주로부터 단백질 분해효소를 분리, 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바실러스 속 균주로부터 단백질 분해효소를 분리하는 방법은

1) 바실러스 속 균주를 배양한 후 원심분리하여 배양 상등액을 회수하여 조효소액을 얻는 단계;

2) 상기 조효소액을 흡착한 후 30% 아세톤(acetone)을 포함하는 인산나트륨완충액(pH 7.5)으로 활성 분획을 용출하는 단계;

3) 상기 단계 2의 용출액을 소수성 크로마토그래피 칼럼에 부가하여 20 mM 트리스 완충액(pH 8.2)으로 활성 분획을 용출하는 단계;

4) 상기에서 단계 3의 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피에 부가하여 완충액으로 세척하고 40 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.0)으로 활성 분획을 용출하는 단계; 및

5) 28 kDa의 분자량을 갖는 단백질 분해효소를 분리하는 단계로 구성된다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 속 균주로부터 분리한 단백질 분해효소를 제공한다.

본 발명의 단백질 분해효소는 계면활성제, 산화제, 유기용매 및 중금속 등의 다양한 물리 화학적 조건하에서도 활성을 유지하는 안정한 효소이다. 본 발명의 단백질 분해효소는 비이온성 계면활성제 뿐만 아니라 SDS(sodium dodecyl sulfate)와 같은 강한 음이온성 계면 활성제의 존재하에서도 단백질 분해 활성을 유지하고(도 3참조), 특히 5%의 SDS로 72시간 동안 처리하여도 활성을 거의 잃지 않는 매우 안정한 효소이다. 이는 여타 발명의 단백질 분해효소보다 안정성이 뛰어난 효소임을 알 수 있다(출원번호 1996-019826; 출원번호 2000-0044047; 출원번호 1996-008674 참조). 또한, 본 발명의 단백질 분해효소는 강력한 산화제로 알려진 과산화수소 및 소디움 퍼보레이트(sodium perborate)의 존재하에서도 활성을 거의 잃지 않는 매우 안정한 효소이다(도 4및도 5참조). 특히 2.5%(>1 M) 과산화 수소수로 72시간 동안 처리하여도 그 활성을 거의 잃지 않는 효소학적 안정성은 여타 발명의 단백질 분해효소 보다 산화제, 특히 과산화수소에 대한 안정성이 뛰어난 효소임을 알 수 있다(출원번호 2000-7003728 참조). 또한, 본 발명의 단백질 분해효소는 아세톤, 아세토니트릴(acetonitrile), 에탄올, 이소프로판올, 메탄올, 디메틸포마마이드(dimethylformamide) 및 디메틸설폭사이드(dimethylfulfoxide) 등의 유기용매의 존재하에서도 활성을 잃지 않는 유기 용매에 매우 안정한 효소이고(표 7참조), 이는 본 발명의 단백질 분해효소를 올리고펩타이드의 생합성에도 이용할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 분해효소는 칼슘, 카드뮴, 코발트, 크롬, 구리, 마그네슘 및 망간 등의 금속의 존재하에서도 효소 활성이 영향 받지 않는다(표 8참조).

본 발명의 단백질 분해효소는 pH 4 ~ pH 12에서도 단백질 분해활성을 나타내고, 최대 활성을 나타내기 위해서는 pH 8 ~ pH 11인 것이 바람직하고, pH 8 ~ pH 10인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 단백질 분해효소는 10 ~ 70℃에서도 단백질 분해활성을 나타내고, 최대 활성을 나타내기 위해서는 30 ~ 60℃인 것이 바람직하고, 40 ~ 55℃인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 상기 단백질 분해효소를 포함하는 의류용 또는 콘택트 렌즈용 세제를 제공한다. 상기 단백질 분해효소를 포함하는 세제는 일반적인 의류용 또는 콘택트 렌즈용 세제의 제조 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 상기 단백질 분해효소는 SDS, 옥틸글루코시드(octylglucoside), Triton X-100, 트윈 20, Brij-35 등 공지의 합성 계면활성제 또는 천연 계면활성제와 함께 상기 세제의 성분으로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 분해효소를 이용하여 식품, 사료, 직물, 천연 가죽을 가공하는 방법 및 유기 폐기물을 분해하는 방법을 제공한다. 상기 단백질 분해효소는 광범위한 pH, 산화-환원 환경에서도 활성을 유지하므로, 식품, 사료, 직물, 천연가죽 등의 가공 공정에서 폭넓게 사용할 수 있다. 또한, 상기 단백질 분해효소는 중금속의 존재하에서도 높은 활성을 유지하므로 폐기물 분해에도 사용할 수 있다. 상기에서, 가공 방법 또는 분해 방법에는 특별한 제약은 없으며, 공지의 방법에 본 발명의 단백질 분해효소를 첨가하여 실시하는 모든 방법이 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명은 바실러스 속 균주로부터 단백질 분해효소를 대량생산하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 바실러스 속 균주로부터 단백질 분해효소를 대량생산하기 위한 바실러스 속 균주의 배지 조성 및 최적 배양조건을 제공한다.

본 발명은 바실러스 속 균주가 단백질 분해효소를 대량생산할 수 있는 배양 배지의 조성은 하기와 같다.

유기 질소원으로는 카제인, 탈지분유, 유청, 대두박 및 펩톤으로 구성되는군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 바람직하고, 대두박 또는 카제인을 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 그 공급 농도는 0.1∼5%인 것이 바람직하고, 0.2∼2.5%로 공급하는 것이 더욱 바람직하다.

탄소원으로는 포도당, 락토스, 말토스, 고구마 전분, 옥수수 전분, 밀기울, 밀가루, 구연산 나트륨, 초산 나트륨, 숙신산 나트륨 및 글루탐산 나트륨으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 바람직하고, 밀가루를 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 그 공급 농도는 0.1∼5%로 하는 것이 바람직하고, 0.2∼2.5%로 공급하는 것이 더욱 바람직하다. 작은 분자량을 갖는 탄소원으로는 구연산 나트륨, 숙신산 나트륨, 초산 나트륨 및 글루탐산 나트륨 등을 사용하며, 그 공급 농도는 0.1∼5%로 하는 것이 바람직하고, 0.2∼2.5%로 공급하는 것이 더욱 바람직하다.

배양 배지의 pH는 탄산나트륨으로 조절하며, 그 공급 농도는 0.2∼1.0%로 하는 것이 바람직하고, 0.4∼0.8%로 공급하는 것이 더욱 바람직하며, 이 때 배지의 pH는 pH 7 ~ pH 12인 것이 바람직하고, pH 7.5 ~ pH 10인 것이 더욱 바람직하다.

상기의 배지 조성물을 이용하여 미리 배양한 종균 배양액을 1∼10% 범위에서 접종하고, 특히 1∼5%로 공급하고, 종균 배양액을 접종한 후 20∼96 시간 동안 배양하는 것이 바람직하고, 24∼48 시간 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 최적 배양조건으로는 배양 온도 범위가 25∼40℃인 것이 바람직하고, 33∼37℃가 더욱 바람직하다. 또한, 배양 중 공급되는 공기의 양은 0.1∼1.5 vvm이 바람직하고, 0.75∼1.25 vvm이 더욱 바람직하다. 또한, 배양 중 교반 속도는 150∼600 rpm이 바람직하고, 200∼500 rpm인 것이 더욱 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 갯지렁이로부터 단백질 분해효소를 생산하는 균주의 분리

본 발명자들은 서해 특산 흰이빨 참갯지렁이의 체액으로부터 단백질 분해효소를 생산하는 균주를 다음과 같이 분리하였다. 먼저 갯지렁이 몸통을 70% 알코올에 10분간 침지시켜 표면을 살균한 후, 멸균한 가위로 몸통을 절단한 후 체액을 회수하였다. 회수한 체액을 증류수로 100배 희석하여 0.5% 탄산나트륨과 기질인 탈지 분유를 포함하는 한천 평판 배지에 균일하게 자라도록 도포하고, 생성된 군락(colony) 주위에 전지 분유의 분해에 의해 생성된 투명환의 생성을 관찰하였다. 군락으로부터 투명환의 크기가 4 ㎜ 이상되는 군락을 선택한 후, 선택된 균주들을 액체 배지를 이용하여 단백질 분해효소 활성이 뛰어난 균을 선별하였다.

단백질 분해효소의 활성을 분석하기 위하여, 세포 배양 상등액을 회수하여 활성을 측정하였다. 구체적으로, 0.1 M 글리신 완충용액(pH 11.0)에 최종 농도가 0.5%가 되게 함마스탄 카제인(Hammerstan casein)을 녹인 기질 용액 0.5 ㎖에 40∼100배 희석한 효소 용액 0.1 ㎖를 가하여 잘 섞어준 후 50℃에서 10분간 반응시키고 10% 트리클로르 아세트산(TCA) 0.5 ㎖을 가하여 반응을 중단시켰다. 이 용액을 50℃에서 10분간 방치하여 반응하지 않은 단백질을 침전시키고, 원심 분리하여 상등액을 취한 후 라우리(Lowry) 방법에 따라서 660 nm에서 생성된 티로신 양을 측정하였다. 이 때, 단백질 분해효소 1 유니트(Unit)는 1분 동안에 1 마이크로 그람(ug)의 티로신 생성에 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

그 결과, 단백질 분해효소 활성이 가장 뛰어난 균주를 선별하였고, 상기 균주를 그람 테스트한 결과 그람 양성인 것을 확인하였다.

상기에서 선별한 균주의 16S 리보소말 RNA의 염기서열을 분석한 결과서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 16S 리보소말 RNA를 갖는 것으로 밝혀졌고, 상기 염기서열을 분석한 결과 바실러스 속의 균주임을 확인하였다. 상기 바실러스 속 균주의 균학적 성질은표 1에 나타내었다.

본 발명자들은 상기에서 선별한 균주를 "바실러스 속 균주(Bacillussp. 104)"라 명명하고, 이를 2002년 2월 5일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10166BP).

<실시예 2> 단백질 분해효소의 활성에 미치는 영향 측정

<2-1> pH가 단백질 분해효소의 활성에 미치는 영향

본 발명자들은 바실러스 속 균주의 배양에서 배지의 pH가 단백질 분해효소 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 기본 배양 배지는 하기표 2과 같은 조성이 되도록 제조하였고, 탄산나트륨의 최종 농도를 0∼2% 되게 첨가한 후 20시간 동안 배양한 종균을 2%가 되게 접종하고, 35℃에서 40시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 균주를 원심분리한 후, 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.

성분명	농도
대두박(Soybean meal)	2%
인산칼륨	0.5%
황산 마그네슘	0.5 mM

그 결과, 0.1% 이상 농도의 탄산나트륨, 즉 약 알칼리성 pH 배지 조성에서 단백질 분해효소의 생산이 증가되었으며, 0.8% 탄산나트륨을 첨가하였을 때(pH 9.99) 효소의 생산 역가가 가장 높은 것으로 밝혀졌다(표 3).

탄산나트륨 농도(%)	pH	단백질 분해효소 활성(U/㎖,x10²)
무첨가	6.96	5.25
0.1	7.52	6.12
0.2	8.47	6.32
0.4	8.61	13.90
0.6	9.84	19.36
0.8	9.99	24.37
1.0	10.15	15.38
1.2	10.32	9.34
1.4	10.55	7.53
1.6	10.72	6.77
1.8	10.85	4.52
2.0	10.97	4.12

<2-2> 질소원이 단백질 분해효소의 활성에 미치는 영향

본 발명자들은 바실러스 속 균주에서 단백질 분해효소 활성에 미치는 질소원의 영향을 조사하였다. 대두박을 제외시킨 기본 배양배지에 각 질소원(1%) 및 탄산나트륨이 0.8% 농도로 포함된 배지를 제조한 후 20 시간 동안 배양한 종균을 2% 되게 접종하고, 35℃에서 40 시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 균주를 원심분리한 후 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.

그 결과 질소원이 첨가된 경우 전체적으로 단백질 분해효소의 생산이 증가하였으며, 특히 카제인 또는 대두박을 사용하였을 때 단백질 분해효소의 생산이 2배 이상 증가함을 알 수 있었다(표 4). 상기 결과로부터 바실러스 속 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 카제인, 탈지분유 또는 대두박을 포함하는 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 그 사용 범위는 0.5∼5%에서 사용하는 것이 바람직함을 확인하였다.

질소원	단백질 분해효소 활성 (U/㎖, x 10²)
무첨가	7.12
카제인	14.53
탈지분유	13.96
유청	6.05
대두박	15.24
펩톤	8.96

<2-3> 탄소원이 단백질 분해효소의 활성에 미치는 영향

본 발명자들은 바실러스 속 균주에서 단백질 분해효소 활성에 미치는 탄소원의 영향을 조사하였다. 대두박(1%), 카제인(1%) 및 탄산나트륨(0.8%)을 포함하는 기본 배지에 각 탄수화물을 1% 되게 가하여 배지를 제조한 후 20시간 동안 배양한 종균을 2% 되게 접종하고, 35℃에서 40시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 균주를 원심분리하여 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1의 효소 측정 방법으로 생산된 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 말토스를 첨가하였을 때 단백질 분해효소의 생산은 약간 증가하였다. 일반적으로 전분은 단백질 분해효소의 생산을 증가시키는 것으로 보고되어 있지만(Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 57:153-160), 바실러스 속 균주에서는 밀가루(wheat flour)를 첨가하였을 때에만 생산이 증가하였다. 또한 구연산 나트륨, 초산 나트륨, 숙신산 나트륨 및 글루탐산 나트륨 등을 첨가하였을 때에도 단백질 분해효소의 생산이 증가하였다. 상기 결과로부터 바실러스 속 균주 104에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 말토스, 밀가루, 구연산 나트륨, 초산 나트륨, 숙신산 나트륨 및 글루탐산 나트륨를 포함하는 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 그 사용 범위는 0.5∼5%에서 사용하는 것이 바람직함을 확인하였다(표 5).

탄소원	단백질 분해효소 활성 (U/㎖)
무첨가	21.25
포도당	16.32
락토스	10.19
말토스	22.17
고구마 전분	7.62
옥수수 전분	11.33
밀기울	6.40
밀가루	32.33
구연산 나트륨	25.32
초산 나트륨	28.85
숙신산 나트륨	23.10
굴루탐산 나트륨	29.75

<실시예 3> 단백질 분해효소의 생산

<3-1> 단백질 분해효소의 생산 1

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 선별한 바실러스 속 균주로부터 단백질 분해효소를 생산하였다. 구체적으로, 바실러스 속 균주를 배양하기 위한 배지는 대두박 1.0%, 카제인 1.0%, 인산제이칼륨 0.5%, 구연산나트륨 0.5%, 황산마그네슘 0.5 mM 및 밀가루 1%를 함유하는 액체 배지와 20% 탄산나트륨 용액을 각각 121℃에서 20 분간 고압 멸균하여 제조하였다. 상기 배지를 배양 직전에 탄산나트륨의 농도가 0.8% 되게 가한 후 동일한 배지 조성으로 미리 35℃에서 24 시간 동안 플라스크에서 배양한 배양액을 2% 접종하여 35℃에서 48시간 동안 5 L 발효배양기(NBS 사, 미국)를 사용하여 배양하였다. 이때 공기의 공급속도는 1 vvm이었고, 교반속도는 350 rpm이었다. 12,000 g로 20분간 원심분리하여 배양 상층액을 회수하였으며, 단백질 분해효소의 활성을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 상기와 같이 배양한 바실러스 속 균주 배양액 1 ㎖ 당 11,694 U의단백질 분해효소 역가를 가지는 것으로 나타났다.

<3-2> 단백질 분해효소의 생산 2

상기 실시예 <3-1>의 배양 배지의 조성 중에서 대두박과 카제인의 농도를 각각 2.0%로 증가시킨 후 같은 배양 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 회수하여 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 상기와 같이 배양한 바실러스 속 균주 배양액 1 ㎖ 당 19,985 U의 역가를 가졌다.

<3-3> 단백질 분해효소의 생산 3

상기의 실시예 <3-2>의 배양 배지의 조성 중에서 구연산나트륨을 제외시키고 같은 농도의 아세트산 나트륨 공급한 후 같은 배양 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 회수하여 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 상기와 같이 배양한 바실러스 속 균주 배양액 1 ㎖ 당 20,134 U 의 역가를 가졌다.

<3-4> 단백질 분해효소의 생산 4

상기의 실시예 <3-3>의 배양 배지의 조성 중에서 아세트산나트륨을 제외시키고 같은 농도의 글루탐산 나트륨 공급한 후 같은 배양 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 회수하여 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 상기와 같이 배양한 바실러스 속 균주 배양액 1 ㎖ 당 24,013 U 의 역가를 가졌다.

<실시예 4> 바실러스 속 균주로부터 단백질 분해효소 분리, 정제

<4-1> 균주 배양 및 흡착

상기 실시예 <3-3>의 배양 배지의 조성으로 48시간 동안 배양하고 배양 상층액을 회수하여 조효소액으로 사용하였다. 위의 조효소액에 Diaion HP 계열 합성 흡착제를 가하고 6시간 동안 잘 저어주어 흡착한 후, 여과법을 이용하여 흡착제를 회수하였다. 회수한 흡착제를 0.1 M 초산 나트륨 완충액(pH 4.5)으로 잘 세척한 후, 30% 아세톤(acetone)을 포함하는 인산나트륨 완충액(pH 7.5)으로 활성 분획을 용출하였다.

<4-2> 소수성 크로마토그래피

페닐-세파로즈 칼럼(5×8 cm, 아머샴-파마시아 사)을 1 M 황산 암모니움을 포함하는 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 후, 상기 용출액을 칼럼에 부가하였다. 280 nm의 흡광도가 거의 0이 될 때까지 상기 완충액으로 세척한 후, 20 mM 트리스 완충액(pH 8.2)으로 활성 분획을 용출하였다.

<4-3> 음이온 교환 크로마토그래피

디이에이이-세파로즈 칼럼(2.5×10 cm, 아머샴-파마시아 사)을 20 mM 트리스 완충용액(pH 8.2)으로 평형시킨 후, 상기의 페닐-세파로즈 칼럼 크로마토그래피에서 얻은 분획을 칼럼에 부가하였다. 280 nm의 흡광도가 거의 0이 될 때까지 동일 완충액으로 세척하였다.

<4-4> 양이온 교환 크로마토그래피

씨엠-세파로즈 칼럼(1.0×10 cm, 아머샴-파마시아 사)을 20 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.0)으로 평형시킨 후, 상기의 디이에이이-세파로즈 칼럼 크로마토그래피에서 얻은 분획을 칼럼에 부가하였다. 280 nm의 흡광도가 거의 0이 될 때까지 동일 완충액으로 세척하고 40 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.0)으로 활성 분획을 용출하고 활성도를 측정하였다.

<4-5> SDS-PAGE를 통한 프로테아제의 순수 분리 및 분자량 결정

상기와 같이 분리된 프로테아제가 순수 분리되었는지 확인하고 그 분자량을 결정하기 위해, 상기에서 분리된 친화 크로마토그래피 분획을 사용하여 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다. 분자량 측정용 표준단백질로는 97 kDa 크기의 포스포릴라제 b(phosphorylase b), 66 kDa 크기의 우혈청알부민 (BSA), 45 kDa 크기의 난알부민(ovalbumin), 30 kDa 크기의 탄산 무수효소(carbonic anhydrase), 20.1 kDa 크기의 트립신 저해제(trypsin inhibitor) 및 14.4 kDa 크기의 알파-락트알부민(α-lactalbumin)을 이용하였다. 분자량에 대한 상대적 이동도(Rf)는 반로그(Semi-log) 좌표를 그려서 직선식을 얻고, 이 직선식으로부터 정제한 프로테아제 소단위의 분자량을 측정하였다.

그 결과 약 28 kDa 위치에서 순수한 밴드를 나타냄으로써 프로테아제 활성을 갖는 단백질이 순수하게 정제되었음을 확인하였다(도 1참조).

<실시예 5> 단백질 분해효소 활성의 최적 조건 분석

<5-1> 단백질 분해효소 활성의 최적 pH

본 발명자들은 상기 실시예 4에서 분리, 정제한 단백질 분해효소가 최대의 활성을 낼 수 있는 최적 pH를 알아보고자 하였다. 구체적으로, 기질 카제인을 다양한 pH를 갖는 완충제를 사용하여 제조하였으며, pH 4.0∼5.5 범위에서는 0.1 M 초산 나트륨 완충액을, pH 6.0∼7.5 범위에서는 0.1 M 인산 나트륨 완충액을, pH 8.0∼9.5 범위에서는 0.1 M 트리스-염산 완충액을, pH 10.5∼pH 12.0 범위에서는 0.1 M 글리신-NaOH 완충액을 사용하여 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 단백질 분해효소는 pH 8.0∼11.0 범위에서 활성이 높으며 최적 pH는 9.0 임을 알 수 있었다(도 2).

<5-2> 단백질 분해효소 활성의 최적 온도

본 발명자들은 단백질 분해효소가 활성을 나타내는 최적 온도를 알아보았다. 구체적으로, 카제인을 pH 9.0의 완충제를 사용하여 제조하였으며, 온도 10∼70℃ 범위에서 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 단백질 분해효소 활성의 최적 온도는 50℃ 임을 알 수 있었다(도 3).

<실시예 6> 단백질 분해효소의 안정성 분석

<6-1> 단백질 분해효소의 계면활성제에 대한 안정성

본 발명자들은 상기 실시예 4에서 분리, 정제한 단백질 분해효소가 계면활성제에 대해 안정성을 갖는지 알아보기 위하여 음이온성 계면활성제로 처리하여 효소의 활성을 알아보았다. 구체적으로 계면활성제로 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 1%, 2.5%, 5% 또는 10%로 처리하였을 때의 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 단백질 분해효소는 5%의 SDS로 72시간 동안 처리하여도 그 활성을 거의 잃지 않는 SDS에 매우 안정한 효소임을 알 수 있었다(도 4).

<6-2> 단백질 분해효소의 산화제에 대한 안정성

본 발명자들은 단백질 분해효소가 산화제에 대해 안정성을 갖는지 알아보기위하여, 산화제로 처리한 후 각 시간별로 남아 있는 효소의 활성을 측정하였다. 구체적으로, 산화제로는 강력한 산화제로 알려진 과산화수소수(hydrogen peroxide) 및 소디움 퍼보레이트(sodium perborate)를 0.1%, 0.5%, 1% 또는 2.5%로 처리하였을 때의 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 단백질 분해효소는 2.5%의 소디움 퍼보레이트로 72시간 동안 처리하여도 그 활성을 거의 잃지 않는 산화제에 매우 안정한 효소임을 알 수 있었다(도 5및도 6).

<6-3> 단백질 분해효소의 유기용매에 대한 안정성

본 발명자들은 단백질 분해효소가 유기용매에 대해 안정성을 갖는지 알아보기 위하여, 단백질 분해효소를 10 또는 20%의 다양한 유기용매로 처리한 후, 효소의 활성을 측정하였다. 구체적으로, 단백질 분해효소에 10 또는 20%의 아세톤, 아세토니트릴(acetonitrile), 에탄올, 이소프로판올, 메탄올, 디메틸포마마이드(dimethylformamide) 또는 디메틸설폭사이드(dimethylfulfoxide)로 처리하였을 때 시간 별로 남아 있는 효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 단백질 분해효소는 20%의 다양한 용매로 72시간 동안 처리하여도 그 활성을 잃지 않는 유기 용매에 매우 안정한 효소임을 알 수 있었다(표 7). 이는 본 발명의 단백질 분해효소가 올리고펩타이드의 생합성에도 이용할 수있음을 알 수 있었다.

유기용매	활성 (%)
유기용매	4 h	24 h	48 h	72 h
아세톤	10%	93.9	98.3	99.8	97.8
아세톤	20%	103.2	96.1	106.4	101.8
아세토니트릴	10%	92.0	95.2	94.7	94.2
아세토니트릴	20%	94.6	87.1	98.2	93.2
에탄올	10%	99.4	95.3	97.8	97.2
에탄올	20%	92.9	88.2	96.0	92.4
이소프로판올	10%	104.5	105.7	109.9	107.1
이소프로판올	20%	109.3	110.7	112.8	111.2
메탄올	10%	94.5	96.9	94.7	95.5
메탄올	20%	105.2	95.9	96.4	98.3
디메틸포마마이드	10%	108.5	107.8	109.7	108.7
디메틸포마마이드	20%	112.1	108.6	112.0	110.8
디메틸설폭사이드	10%	92.4	89.3	94.8	95.5
디메틸설폭사이드	20%	95.2	93.8	97.9	95.7

<6-4> 금속이온이 단백질 분해효소 활성에 미치는 영향

본 발명자들은 단백질 분해효소 활성에 금속이온이 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 다양한 금속이온을 처리한 후 효소활성을 측정하였다. 구체적으로, 단백질 분해효소에 1 mM의 칼슘, 카드뮴, 코발트, 크롬, 구리, 마그네슘 또는 망간을 처리한 후 효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 단백질 분해효소의 효소 활성은 금속 이온에 의하여 영향을 받지 않음을 알 수 있었다(표 8).

금속이온	활성 (%)
None	100.0
Ca²⁺	125.6
Cd²⁺	93.3
Co²⁺	114.0
Cr³⁺	112.8
Cu²⁺	106.0
Mg²⁺	94.6
Mn²⁺	141.0

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 바실러스 속 균주 및 이로부터 분리, 정제된 단백질 분해효소는 음이온성 계면활성제, 산화제 및 유기용매에 매우 안정한 효소로서, 의류용 또는 콘택트 렌즈용 세제의 성분, 식품, 사료, 직물, 천연가죽 등의 가공 및 유기 폐기물의 처리 등 다양한 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> INHA UNIVERSITY SEOULIN BIO SCIENCE CO., LTD. <120> Bacillus producing oxidant and detergent-resistant protease <130> 2p-01-30 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1483 <212> DNA <213> Bacillus sp. 104 16S rRNA <400> 1 ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 60 tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120 gaaaccgggg ctaataccgg atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc 180 ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240 accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300 cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360 cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420 gaacaagtgc cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480 aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540 cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600 agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660 cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720 actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780 gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840 cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900 ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960 gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020 gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080 gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140 aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200 acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260 atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320 aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380 caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg 1440 aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg taacaaggta gcc 1483

Claims

단백질 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주(Bacillussp. 104)(수탁번호 : KCTC 10166BP).
1) 제 1항 기재의 바실러스 속 균주(수탁번호 : KCTC 10166BP)를 배양한 후 원심분리하여 배양 상등액을 회수하여 조효소액을 얻는 단계;

2) 상기 조효소액을 흡착한 후 30% 아세톤(acetone)을 포함하는 인산나트륨 완충액(pH 7.5)으로 활성 분획을 용출하는 단계;

3) 상기 단계 2의 용출액을 소수성 크로마토그래피 칼럼에 부가하여 20 mM 트리스 완충액(pH 8.2)으로 활성 분획을 용출하는 단계;

4) 상기에서 단계 3의 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피에 부가하여 완충액으로 세척하고 40 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.0)으로 활성 분획을 용출하는 단계; 및

5) 28 kDa의 분자량을 갖는 단백질 분해효소를 분리하는 단계로 구성되는 단백질 분해효소를 분리하는 방법.
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제 1항 기재의 바실러스 속 균주(수탁번호 : KCTC 10166BP)를 카제인, 탈지분유, 유청, 대두박 및 펩톤으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 질소원 0.1∼5%, 포도당, 락토스, 말토스, 고구마 전분, 옥수수 전분, 밀기울, 밀가루, 구연산 나트륨, 초산 나트륨, 숙신산 나트륨 및 글루탐산 나트륨으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 탄소원 0.1∼5%를 포함하고, pH 7.5 ~ pH 10 인 배지에서 25~40℃, 150~600 rpm으로 20~96시간 배양하는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 대량생산 방법.