CN102115720A

CN102115720A - 乳酸片球菌菌株及其生产片球菌素的方法

Info

Publication number: CN102115720A
Application number: CN 201010566509
Authority: CN
Inventors: 周志江; 韩烨; 李静
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102115720B

Abstract

本发明公开了一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2CGMCC No.4213以及采用所述乳酸片球菌P2生产乳酸片球菌素的方法，将乳酸片球菌菌株P2培养活化后接种至本发明提供的改良MRS培养基进行发酵培养，发酵培养方法如下：将活化的乳酸片球菌菌种P2接种至改良MRS发酵培养基中，发酵温度为35-37℃，pH值5.5-7.5，培养时间15-22h，接种量0.3-0.6％，发酵液溶解氧保持20-25％，发酵培养过程中流加葡萄糖；培养1522小时后从发酵产物中提取片球菌素。用本发明提供的改良MRS培养基和经优化的培养发酵条件下进行发酵，片球菌素产量达到22,000AU/ml以上，结合使用本发明提供的从细胞内提取未分泌的片球菌素的方法，总片球菌素产量达27,500AU/ml以上，适用于大规模工业化生产。

Description

乳酸片球菌菌株及其生产片球菌素的方法

技术领域

本发明涉及片球菌属的乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)新菌株及通过培养该菌株制备片球菌素的方法。

背景技术

为了减少微生物引起的食品腐败和食源性疾病，人类采用诸如干燥、加热、盐腌、发酵和化学防腐等方法进行食品防腐，由于担心长期摄入化学防腐剂的副作用，消费者更加青睐不添加防腐剂的食品或仅添加天然防腐剂的食品，但不添加防腐剂的食品容易出现微生物污染的状况，如冷藏食品中会有嗜冷性病原菌单核细胞增多症李氏杆菌，梭状芽胞杆菌和腐败微生物假单胞菌、明串珠菌，它们引起食品安全问题或食品货架期的问题。

由于使用化学防腐剂可能出现问题，寻找某些细菌产生的天然代谢产物抑制或杀死有害微生物的研究成为研究的热点。这些天然的抑菌物质可以替代那些化学防腐剂如二氧化硫、苯甲酸、山梨酸和亚硝酸盐。其中用食品级微生物乳酸菌产生的细菌素作为生物食品防腐剂以保证食品安全性和货架期的研究受到极大的关注。细菌素相当稳定，可生物降解、可被消化、在低浓度就可发挥作用。数种细菌素对许多食品腐败和致病菌有杀菌活性，如蜡样芽胞杆菌，肉毒梭状芽胞杆菌，产气荚膜梭状芽胞杆菌，单核细胞增多症李氏杆菌，金黄色葡萄球菌等。

乳酸菌特别是乳球菌、乳杆菌、片球菌、明串珠菌、和链球菌传统上用作发酵食品和蔬菜的出发菌，因为它们可以产生良好的风味和防腐作用。其抑菌活性的重要原因之一就是乳酸菌产生的细菌素。已从乳球菌、乳杆菌和片球菌发现产生细菌素的菌株。从明串珠菌、肉杆菌、链球菌、肠球菌和双岐杆菌也发现产生细菌素的菌株。由乳酸菌产生的细菌素本质为具有生物活性的蛋白质或蛋白复合物，对种属相近的细菌有抑菌活性。乳酸菌产生的细菌素有多种，其分子量、理化特性、抑菌谱、和作用方式都不尽相同。

已报道有数株片球菌产生细菌素。最初，发现从发酵黄瓜分离的戊糖片球菌FBB-61，FBB-63，和L-7230对植物乳杆菌有抑制作用(Etchells et al，Appl Microbiol，1964)。进一步研究表明，戊糖片球菌菌株FBB-61和L-7230抑制革兰氏染色阳性菌片球菌、乳杆菌、明串珠菌、肠球菌、微球菌、金黄色葡萄球菌和芽胞杆菌中的一些菌株(Fleming et al，Appl Microbiol，1975)。这些菌株的抑菌物质后来被证明是细菌素，命名为片球菌素A(Daeschel et al，ApplEnviron Microbiol，1985)。后来发现戊糖片球菌FBB-61也对单核细胞增多症李氏杆菌有抑菌活性，然而，也发现该菌株并非对所有革兰氏染色阳性细菌有抑制作用，对一些革兰氏染色阴性细菌和酵母完全无效(Hoover et al，Food Biotechnol，1989)。另一个课题组从发酵香肠分离出一株产细菌素的乳酸片球菌(菌株H)，抑制其他乳酸菌菌株的生长，产生的细菌素命名为片球菌素AcH(Bhunia et al，J Ind Microbiol，1987)。乳酸片球菌PAC1.0产生细菌素，命名为片球菌素PA-1(Gonzalez et al，Appl Environ Microbiol，1987)，对乳酸片球菌、戊糖片球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双发酵乳杆菌、肠膜明珠菌有抑菌活性，对单核细胞增多症李氏杆菌有抑菌活性。

美国专利4,883,673(Gonzalez，1989)提供了一种用乳酸片球菌产生的细菌素抑制色拉和色拉调味料中微生物腐败的方法。美国专利4,929,445(Vandenbergh et al.，1990)提供了一种用乳酸片球菌产生的细菌素抑制单核细胞增多症李氏杆菌的方法。美国专利5,219,603(Boudreaux et al.，1993)提供了一种使用乳酸片球菌产生的片球菌素延长生肉和加工肉制品货架期的方法。美国专利5,445,835(Vedamuthu et al.，1995)提供了一种用产片球菌素的乳酸片球菌延长酸奶货架期的方法。上述美国专利都是将产生乳酸片球菌素的乳酸片球菌用于某种食品以延长其货架期或抑制其中的微生物。国内专利公开号为CN 101050437A(孙爱友等，2007)公开了一种乳酸片球菌菌株和乳酸片球菌素的生产方法，该专利提供的菌株产生片球菌素效价为18,000AU/mL。

许多研究表明培养基和培养条件对细菌素的产生有重要影响，细菌的培养条件不但严重影响到它的生长情况，而且还与细菌素的产量密切相关，这些因素主要包括培养基的pH值、培养温度、培养时间、供氧量、生物量等等(

et al，Process Biochemist，1998)。一般来讲，在菌体进入稳定期以前细菌素的含量随着时间的延长而增加，稳定期后随着培养时间的不断延长细菌素的活性反而不断损失。但未见针对乳酸片球菌产生片球菌素的培养条件的全面优化的报道。

细菌素作为一种小分子蛋白质，具有蛋白质的一些基本特性，所以分离纯化蛋白质的提取方法同样适用于细菌素的提取。片球菌素在pH值6时吸附于产生菌的表面，而pH值2时则解吸附，因此，常用这种调整pH值的方法使片球菌素得到浓缩和纯化(Yang et al，Appl EnvironMicrobiol，1992)。这种方法成本低，易于操作，纯化时不加任何有害化学物质，安全性高，可满足用于食品防腐剂的片球菌素的生产。如进行片球菌素性质研究，则需进行高度的纯化。获得高纯度片球菌素的方法有硫酸盐沉淀、凝胶层析、离子交换层析、高效液相色谱等。但目前的各种提取和纯化方法中只涉及从发酵液中提取分泌到细胞外的细菌素，而仍然残留于细胞内的片球菌素的提取方法未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明通过对野生型乳酸片球菌(Pediococcusacidilatici)菌株PA003用硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)和氯化锂(LiCl)复合诱变剂进行诱变，得到的一株片球菌素高产突变菌株P2，该菌株能够产生大量片球菌素。

本发明另一个目的是提供一种通过培养该乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2而生产片球菌素的方法并从培养基和细胞中回收片球菌素的方法，以克服现有技术中野生型乳酸片球菌片球菌素产量低和提取方法得率低的问题。

乳酸片球菌PA003菌株从国内发酵酸菜中分离，产生的抑菌物质为蛋白质性质的片球菌素(周志江等，食品科学，2006)。本发明用基因工程手段克隆该片球菌素基因，根据基因测序结果推断其含44个氨基酸，与乳酸片球菌PAC1.0片球菌素PA-1的结构基因pedA(Accession number M83924)同源性为100％。pedA基因编码62个氨基酸的前体蛋白，经翻译后修饰，去除18个氨基酸的前导肽，成熟的具有抑菌活性的片球菌素为含44个氨基酸的多肽。

根据GenBank发布的乳酸片球菌PAC1.0片球菌素PA-1的结构基因pedA(Accessionnumber M83924)的DNA序列设计一对引物，上游引物序列为5’-ATG AAA AAA ATT GAAAAA TTA ACT-3’(SEQ ID NO.2)，下游引物为5’-CTA GCA TTT ATG ATT ACC TTG-3’(SEQ ID NO.3)。用碱裂解法提取乳酸片球菌PA003的全细胞DNA作为模板，用PCR反应扩增pedA基因。PCR反应的条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，44℃复性20s，72℃延伸15s，经30个循环后再72℃延伸10min。PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳后进行观察。将PCR产物克隆至pTA2 Vector载体，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选含有重组质粒的转化子，提取其重组质粒，测定重组质粒中乳酸片球菌PA003的pedA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，测序结果为：

1 ATGAAAAAAATTGAAAAATTAACTGAAAAAGAAATGGCCAATATCATTGGTGGTAAATAC

61 TACGGTAATGGGGTTACTTGTGGCAAACATTCCTGCTCTGTTGACTGGGGTAAGGCTACC

121 ACTTGCATAATCAATAATGGAGCTATGGCATGGGCTACTGGTGGACATCAAGGTAATCAT

181 AAATGCTAG

序列中前54个核苷酸序列编码18个氨基酸的前导肽，之后的132个核苷酸序列编码44个氨基酸的成熟片球菌素，最后的三个核苷酸为终止密码。

突变菌株P2通过化学诱变的方法得到。用正交试验确定DES诱变条件为：片球菌菌液浓度为10^6-10⁸cfu/mL，DES浓度为0.6％-1.0％，诱变时间为20min-30min，诱变温度为37℃-41℃，其中最佳诱变条件为：片球菌菌液浓度为10⁷cfu/mL，DES浓度为0.8％，诱变时间为30min，诱变温度为37℃，试验中共获得20个片球菌素产量提高的突变菌株。挑选产量提高幅度最大的五株继续进行LiCl诱变育种试验，从中进一步筛选出5株产量提高的突变菌株，其中突变菌株P2的片球菌素效价最高。

本发明乳酸片球菌P2主要有以下特性：

为革兰氏染色球菌，通常以双球菌或四叠球菌形式出现，无运动性，不形成芽胞，兼性厌氧。最适生长pH值为6.2，最适生长温度为25-40℃。生长依赖可发酵的碳水化合物，以EMP途径发酵葡萄糖产生乳酸，不产气，为同型乳酸发酵菌。主要生理生化特性见表1。

表1乳酸片球菌P2的主要生理和生化特性

本发明的片球菌素在20-100℃条件下保温20min细菌素抑菌活性基本保持不变，100℃以上抑菌活性受到影响，121℃时抑菌作用下降到20℃时的70％。片球菌素在pH2-9抑菌效果保持稳定，pH9以上活性逐渐减弱，到pH13时丧失抑菌活性。

本发明的片球菌素对单核细胞增多症李氏杆菌有强的抑菌作用，也对部分其他革兰氏染色阳性细菌有抑菌作用，如片球菌、乳杆菌、明串珠菌、肠球菌、微球菌、金黄色葡萄球菌和芽胞杆菌中的一些菌株。

所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2CGMCC No.4213生产乳酸片球菌素的方法，包括以下步骤：

(a)将保存的乳酸片球菌菌株P2CGMCC No.4213接种于MRS平板，37℃培养24-36h，挑取典型的单个菌落，接种于MRS液体培养基，37℃下培养16h进行活化；

(b)活化后接种至本发明提供的改良MRS培养基进行发酵培养，发酵培养方法如下：将活化的乳酸片球菌菌种P2 CGMCC No.4213接种至改良MRS发酵培养基中，发酵温度为35-37℃，pH值5.5-7.5，培养时间15-22h，接种量0.3-0.6％，发酵液溶解氧保持20-25％，发酵培养7小时后按0.025g/L浓度流加葡萄糖，每5升发酵液体积按2ml/min的流加速度进行间歇流加，罐时培养15-22小时后从发酵产物中提取片球菌素。

所述改良MRS培养基每升组成为：

酪蛋白胨7-10g，牛肉膏10-15g，酵母提取物5-9g，葡萄糖3-5g，乙酸钠3-5g，柠檬酸胺1-5g，吐温80 1-2mL，磷酸氢二钾1-2g，硫酸镁0.2-2g，硫酸锰0.1-0.5g，碳酸钙10-20g，pH6.2-6.8；

(c)培养15-22小时后从发酵产物中提取片球菌素。包括提取细胞外细菌素和细胞内细菌素，

然后将其分离纯化。

细胞内细菌素的提取方法为：

首先将菌液pH值调到2.0，4℃电磁搅拌12h，离心弃上清得菌体，加无菌水清洗沉淀菌体，再离心弃上清得菌体；

然后将菌体重悬于细胞壁裂解液I(25％蔗糖，30mg/ml溶菌酶)中，在37℃条件下保持15min，加入细胞壁裂解液II(3％SDS，0.2M NaOH)，迅速混匀，常温保持7min，离心取上清液，在70℃条件下保持30min，灭酶；之后用细胞外细菌素的分离纯化方法提取其中的片球菌素。

上述步骤(b)的培养条件通过改变碳源、氮源、摇床转速、pH值、培养时间、培养温度、接种量，优化了突变菌株P2片球菌素产量的条件。

碳源：将突变菌株P2接种于含不同碳源的MRS培养基中，碳源分别是山梨醇、木糖、葡萄糖、鼠李糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蜜三糖，37℃培养条件下培养16h，分别测定片球菌素产量。结果表明，葡萄糖为最佳碳源。

氮源：分别选取有机氮源酵母提取物、胰蛋白陈、大豆蛋白陈、牛肉膏，无机氮源柠檬酸氨、硝酸钾代替MRS培养基中的氮源成分，接种突变菌株P2，37℃培养条件下培养16h，分别测定片球菌素产量。结果表明，无机氮源无法满足细菌的生长及细菌素的产生。有机氮源对细菌素的产生有重要影响，大豆蛋白胨不适宜突变菌株P2生长和片球菌素的产生，其他三种有机氮源胰蛋白陈、牛肉膏、酵母提取物之间差异不大。

摇床转速：将突变菌株P2接种至MRS培养基，摇床转速分别设为60、80、100、120、140、160r/min，37℃下培养16h后分别测定片球菌素产量。结果表明，摇床转速对片球菌素效价的影响很小，和静止培养时片球菌素产量相差在0.2％左右，转速在160r/min时还会稍微的抑制片球菌素的产生。

培养基的初始pH值：将MRS培养基的初始pH值分别调整为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，接种突变菌株P2，37℃下培养16h后分别测定片球菌素产量。结果表明，初始pH值对效价的影响较大。pH5-pH7.0时片球菌素产量高。

培养时间的影响：将突变菌株P2接种至MRS培养基，培养时间分别设为8、10、12、14、16、18、20、22h，37℃下培养，然后分别测定片球菌素产量。结果表明，在16h-22h之间片球菌素产量高。

培养温度的影响：将突变菌株P2接种至MRS培养基，培养箱温度分别设为35、36、37、38、39、40℃，培养16h后，分别测定片球菌素产量。结果表明，温度对片球菌素产量影响不大，但36℃-37℃时产量最高。

接种量的影响：分别按0.1％、0.3％、0.5％、1％、2％的接种量将突变菌株P2接种至MRS培养基，37℃下培养16h后分别测定片球菌素产量。结果表明，接种量为0.3％-0.5％时片球菌素产量最高。

响应面法分析最优生产条件：经响应面法分析，突变菌株P2产片球菌素最佳方案为：初始pH值5.5-7.5、培养时间15-22h、初始温度35-37℃、接种量0.3-0.6％。在此培养条件下片球菌素产量预测值和实际试验值基本相符，其相对误差约为0.69％。

本发明片球菌素抑菌活性测定方法为：

测定片球菌素抑菌活性采用琼脂扩散分析法。将片球菌素溶液两倍连续稀释，以单核细胞增多症李氏杆菌为指示菌，平板底层加固体TGE，将指示菌加入到半固体TGE中后，加到底层TGE上，用打孔器在琼脂平板上打直径为5mm的小孔，孔中加入25μl上述抑菌溶液，37℃过夜培养，观察抑菌效果。待测物抑菌效价等于出现基本抑菌现象(2mm抑菌圈)的稀释倍数×40，所得片球菌素抑菌效价单位为AU/mL。

本发明的突变菌株乳酸片球菌P2已经于2010年10月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)保藏，编号为CGMCCNo.4213。乳酸片球菌PA003于2010年9月30日保藏于天津大学化工学院食品科学系食品生物技术研究室，编号：THSS No.2003-01。

本发明的有益效果为：采用本发明提供的乳酸片球菌突变菌株P2，在常用MRS培养基中培养，片球菌素产量达12,480AU/mL，进一步用本发明提供的改良MRS培养基和经优化的培养发酵条件下进行发酵，并流加葡萄糖的情况下，片球菌素产量达到22,000AU/mL以上，结合使用本发明提供的从细胞内提取未分泌的片球菌素的方法，总片球菌素产量达27,500AU/mL以上，比目前文献和专利报道的片球菌素的产量均有较大幅度提高，适用于大规模工业化生产。片球菌素作为天然生物食品防腐剂用于食品的防腐和保鲜。

具体实施方式

实施例1

突变菌株P2通过化学诱变的方法得到。用正交试验确定DES诱变条件为：片球菌菌液浓度为10⁷cfu/mL，DES浓度为0.8％，诱变时间为30min，诱变温度为37℃，试验中共获得20个片球菌素产量提高的突变菌株。挑选产量提高幅度最大的五株继续进行LiCl诱变育种试验，从中进一步筛选出5株产量提高的突变菌株，其中突变菌株P2的片球菌素效价最高。

诱变具体操作方法如下。

(1)DES对菌株乳酸片球菌PA003的化学诱变方法

①单因素对菌株乳酸片球菌PA003致死率影响

菌悬液浓度

DES浓度为0.6％，诱变时间为20min，诱变温度为37℃，分别在菌悬液浓度为10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸cfu/mL的条件下诱变，菌落计数后计算其致死率。

DES浓度

菌液浓度为10⁷cfu/mL，诱变时间为20min，诱变温度为37℃，调节DES浓度分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4，菌落计数后计算其致死率。

诱变时间

菌液浓度10⁷cfu/mL，DES浓度为0.6％，诱变温度37℃，诱变时间分别为20、25、30、35、40min，菌落计数后计算其致死率。

诱变温度

菌液浓度10⁷cfu/mL，DES浓度为0.6％，诱变时间为30min，调节恒温箱温度分别为35、37、39、41、43℃，菌落计数后计算其致死率。

②正交试验判定DES诱变的最适条件

取10mL 10⁶、10⁷、10⁸cfu/mL的片球菌乳酸片球菌PA003细胞悬液于诱变碘量瓶中，加入一滴乙醇助溶，然后加入一定量的DES，使DES体积比分别为0.6％、0.8％、1.0％。振荡处理20、25、30min，以2.5倍DES溶液体积加入25％Na₂S₂O₃溶液终止反应。诱变中，通过改变菌液浓度、DES溶液的体积分数、诱变时间、诱变温度控制致死率。

③筛选方法

吸取诱变过程得到的液体3mL于离心管中8000r/min离心15min，用3mL PBS离心洗涤细胞，吸取0.1mL用于筛选平板涂布。37℃下恒温培养16h，选取菌落分布均匀、菌数在100-250之间的平皿。用此平皿所接种的突变菌株进行液体发酵培养，37℃下16h后进行双层牛津杯平板抑菌试验，将抑菌圈较大的突变菌株留下用以下面的LiCl诱变。

(2)LiCl对突变株的化学诱变

取经DES诱变后抑菌圈较大的突变菌株作为出发菌株，制备突变乳酸片球菌株菌悬液，使菌悬液的浓度分别为10⁶cfu/mL、10⁷cfu/mL、10⁸cfu/mL。准确称量一定量的LiCl粉末，融入MRS固体培养基中，制得分离培养基平板。平板中的LiCl浓度分别为0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％。吸取菌悬液0.1mL分别涂布于以上浓度的分离培养基平板上，于37℃下培养20h，进行菌落计数并计算致死率。挑选致死率在90％左右的平板，挑取单菌落在液体培养基中发酵培养，37℃下16h后测定抑菌圈大小，挑选抑菌圈大的菌株，做片球菌素效价分析。

挑取经诱变的平板上的单菌落划斜面，将斜面传代两次后使活力达到一定的要求。接种突变菌株于10mL试管中进行发酵培养，37℃下恒温培养16h，用牛津杯双层平板抑菌试验测定各突变菌株产生的片球菌素的效价。

所使用的PBS缓冲液(每升含)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，pH7.0。

使用的主要化学试剂：

硫酸二乙酯(DES)，化学纯，天津市江天化工技术有限公司。

无水氯化锂(LiCl)，分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心。

硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃·5H₂O)，分析纯，廊坊天科生物科技有限公司。

实施例2

片球菌素高产乳酸片球菌突变菌株分离

产片球菌素乳酸片球菌PA003，片球菌素的产量为640AU/mL，用DES进行诱变，得到的高产菌株作为亲代菌株再用LiCl进行诱变。诱变试验后，P2突变株表现出了高产片球菌素的特性，而且该菌株经斜面连续20代传代后片球菌素产量性能保持稳定。

将P2突变菌株接种于10mL MRS液体培养基中，37℃培养16h，用上述琼脂扩散法测定培养液中的抑菌活性，突变菌株P2片球菌素产量是野生菌株PA003的19.5倍，片球菌素的产量为12,480AU/mL。

实施例3

突变菌株P2的培养基和发酵培养方法

取突变菌株P2的单菌落接种至MRS培养基，37℃下培养16h进行活化，活化后接种至本发明提供的改良MRS培养基进行发酵培养。

发酵培养方法如下：将活化突变菌株P2按0.5％接种至改良MRS发酵培养基中，发酵温度为37℃，发酵液溶解氧保持20％，发酵培养7小时后按0.025g/L浓度流加葡萄糖，每5升发酵液体积按2ml/min的流加速度进行间歇流加，培养16小时后从发酵产物中提取片球菌素。采用上述方法，片球菌素的产量是采用普通MRS培养基和未流加葡萄糖进行培养发酵时的1.77倍，片球菌素产量达22,000AU/mL以上。采用本发明提供的方法将细胞内未分泌的片球菌素也提取出来，总片球菌素产量达27,500AU/mL以上。

MRS培养基(每升含)：葡萄糖20g，胰蛋白胨10g，牛肉膏8g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温801mL，pH6.2-6.5。

改良MRS培养基(每升含)：酪蛋白胨9g，牛肉膏12g，酵母提取物7g，葡萄糖4g，乙酸钠4g，柠檬酸胺3g，吐温801mL，磷酸氢二钾1g，硫酸镁1g，硫酸锰0.3g，碳酸钙15g，pH6.5。

TGE(Tryptone Glucose Extract Agar)(每升含)：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，琼脂粉15.0g，pH 7.0。

使用的主要化学试剂：

磷酸三钠(Na₃PO₄)，分析纯，金汇太亚(北京)化学试剂公司。

溶菌酶，超纯级(ultra Pure Drade)，活性＞20000u/mg，北京索莱宝科技有限公司。

实施例4

发酵培养方法如下：将活化突变菌株P2按0.5％接种至改良MRS发酵培养基中，发酵温度为35℃，发酵液溶解氧保持23％，发酵培养7小时后按0.025g/L浓度流加葡萄糖，每5升发酵液体积按2ml/min的流加速度进行间歇流加，培养15小时后从发酵产物中提取片球菌素。

采用上述方法，片球菌素的产量是采用普通MRS培养基和未流加葡萄糖进行培养发酵时的1.77倍，片球菌素产量达22,000AU/mL以上。采用本发明提供的方法将细胞内未分泌的片球菌素也提取出来，总片球菌素产量达27,500AU/mL以上。

改良MRS培养基(每升含)：酪蛋白胨7g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸胺5g，吐温802mL，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.1g，碳酸钙10g，pH6.2。

TGE(Tryptone Glucose ExtractAgar)(每升含)：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，琼脂粉15.0g，pH 7.0。

使用的主要化学试剂：

实施例5

发酵培养方法如下：将活化突变菌株P2按0.5％接种至改良MRS发酵培养基中，发酵温度为35℃-37℃，发酵液溶解氧保持25％，发酵培养7小时后按0.025g/L浓度流加葡萄糖，每5升发酵液体积按2ml/min的流加速度进行间歇流加，培养22小时后从发酵产物中提取片球菌素。采用上述方法，片球菌素的产量是采用普通MRS培养基和未流加葡萄糖进行培养发酵时的1.77倍，片球菌素产量达22,000AU/mL以上。采用本发明提供的方法将细胞内未分泌的片球菌素也提取出来，总片球菌素产量达27,500AU/mL以上。

MRS培养基(每升含)：葡萄糖20g，胰蛋白胨10g，牛肉膏8g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，pH6.2-6.5。

改良MRS培养基(每升含)：酪蛋白胨10g，牛肉膏15g，酵母提取物9g，葡萄糖3g，乙酸钠3g，柠檬酸胺1g，吐温802mL，磷酸氢二钾2g，硫酸镁2g，硫酸锰0.5g，碳酸钙20g，pH6.8。

使用的主要化学试剂：

实施例6

细胞内细菌素的提取方法为：

然后将菌体重悬于细胞壁裂解液I中，在37℃条件下保持15min，加入细胞壁裂解液II，迅速混匀，常温保持7min，离心取上清液，在70℃条件下保持30min，灭酶；

所述细胞壁裂解液I为25％蔗糖，30mg/ml溶菌酶；

所述细胞壁裂解液II为3％SDS，0.2M NaOH。

实施例7

细胞外细菌素的分离纯化方法为：

发酵培养后将培养物置于70℃恒温水浴处理30min，使酶失活。灭酶后的培养物冷却至室温后用4mol/L NaOH溶液调pH至6.0。室温电动搅拌30min，使细菌素吸附在细胞上。10,000×g、4℃条件下离心30min。弃上清，收集沉淀，将沉淀再次悬浮于5mmol/L Na₃PO₄中，洗涤两次。8000r/min、4℃条件下离心30min。弃上清，收集沉淀，再将沉淀悬浮在100mmol/L NaCl溶液中。将悬浮液用5％的H₃PO₄调pH为2.0，4℃搅拌12h。18,000×g、4℃条件下离心30min，收集上清液并用0.22μm无菌滤膜过滤，即得纯化的片球菌素。

Claims

1.乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2CGMCC No.4213。

2.一种采用权利要求1所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2CGMCC No.4213生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将保存的乳酸片球菌菌株P2CGMCC No.4213接种于MRS平板，37℃培养24-36h，挑取典型的单个菌落，接种于MRS液体培养基，培养活化；

(b)活化后接种至本发明提供的改良MRS培养基进行发酵培养，发酵培养方法如下：将活化的乳酸片球菌菌种P2CGMCC No.4213接种至改良MRS发酵培养基中，发酵温度为35-37℃，pH值5.5-7.55，培养时间15-22h，接种量0.3-0.6％，发酵液溶解氧保持20-25％，发酵培养过程中流加葡萄糖；

所述改良MRS培养基每升组成为：

酪蛋白胨7-10g，牛肉膏10-15g，酵母提取物5-9g，葡萄糖3-5g，乙酸钠3-5g，柠檬酸胺1-5g，吐温801-2mL，磷酸氢二钾1-2g，硫酸镁0.2-2g，硫酸锰0.1-0.5g，碳酸钙10-20g，pH6.2-6.8；

(c)培养15-22小时后从发酵产物中提取片球菌素。

3.根据权利要求2所述生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述步骤(b)发酵过程中流加葡萄糖为发酵培养7小时后按0.025g/L浓度流加葡萄糖，每5升发酵液体积按2ml/min的流加速度进行间歇流加。

4.根据权利要求2所述生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述步骤(c)从发酵产物中提取片球菌素包括细胞外细菌素和细胞内细菌素，所述细胞内细菌素的提取方法为：

然后将菌体重悬于细胞壁裂解液Ⅰ中，在37℃条件下保持15min，加入细胞壁裂解液Ⅱ，迅速混匀，常温保持7min，离心取上清液，在70℃条件下保持30min，灭酶；

所述细胞壁裂解液Ⅰ为25％蔗糖，30mg/ml溶菌酶；

所述细胞壁裂解液Ⅱ为3％SDS，0.2M NaOH。