CN102559563A - 一种乳酸片球菌ccfm7902及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抑制单核细胞增生李斯特菌生长的乳酸片球菌CCFM7902及其用途。它具有耐酸性、耐胆盐能力、在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有强烈抑制作用、在食品体系中对单核细胞增生李斯特菌的生长具有抑制作用、对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用、对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠肝脾具有保护作用。所述乳酸片球菌CCFM7902可以用于制备生产青贮饲料、发酵香肠等食品。

Description

一种乳酸片球菌CCFM7902及其用途

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种能抑制单核细胞增生李斯特菌生长的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902，还涉及所述乳酸片球菌CCFM7902的用途。 

【背景技术】

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)在分类上属李斯特菌属，该属有8个菌种，普遍认为仅有单核细胞增生李斯特菌能引起食物中毒。该菌为革兰氏阳性小杆菌，需氧或兼性厌氧，生长温度3-45℃，具有嗜冷性，能在低至4℃的温度下生存和繁殖。李斯特菌在自然界中广泛存在，土壤、水、食品都是其生境，孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷个体均属是易感人群。食源性单核细胞增生李斯特菌可引起脑膜炎、败血症和流产，发病率虽不高，但死亡率有时可达20％-50％。食品中存在的李斯特菌对人类的安全具有较大威胁，也是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 

益生菌是一种通过改善平衡宿主的肠道内菌群，拮抗肠道内病原菌，从而对宿主起到有益作用的活性微生物。拮抗作用具有菌株特异性，并非所有的益生菌都对同一种病原菌起作用。益生菌中有很多属于乳酸菌，乳酸菌代谢可以产生有机酸、双乙酰、过氧化氢和细菌素等多种代谢产物，可以抑制食品中的腐败菌和病原菌。刘洁等(上海交通大学学报(农业科学版)，24(3)：221-225，2006)研究发现，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有明显的抑制作用，其发酵液对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用受pH影响显著；周伟、李平兰等(食品科学，27(2)：121-125，2006)研究了植物乳杆菌素L-1对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用，并探讨了温度、pH及盐对抑制效果的影响。单核细胞增生李斯特菌对细胞的粘附是其侵染的前提，乳酸菌可以通过占位作用排除致病菌，或者它分泌代谢产物以抑制致病菌。除此之外，乳酸菌还能够增强机 体免疫反应，从而达到清除致病菌的作用。Sinea等人(FEMS immunology and medical microbiology、50(380-388)，2006)应用细胞模型发现，其所用的乳酸杆菌是通过代谢产物而非粘附作用对单核细胞增生李斯特菌产生抑制拮抗作用并刺激细胞的自身免疫。由此可见，乳酸菌及其代谢产物可能对单核细胞增生李斯特菌的污染具有一定的预防或干预作用，有作为抗生素的辅助治疗剂的潜能，筛选具有优良拮抗特性的乳酸菌对于抑制单增李斯特菌的污染很有必要。本发明经过体外筛选、细胞模型和应用研究发现，从泡菜中分离出的一株乳酸片球菌CCFM7902对单核细胞增生李斯特菌具有明显的抑制作用。 

目前公开的关于乳酸片球菌及其抑菌物质的文献很有限，其中关于乳酸片球菌素的报道较多，如CN101050437和CN102115720A分别公开了生产片球菌素的方法；CN102127578A公开了一种积累片球菌素的方法，可以增加片球菌素的生产量。也有少数专利是关于乳酸片球菌作为发酵剂的作用，如CN101289647公开的一株片球菌能够在发酵香肠中作为发酵剂的应用，改善发酵香肠的风味。本发明在体外拮抗的基础上，通过细胞模型发现乳酸片球菌对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用，动物模型中乳酸片球菌对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保护作用。此乳酸片球菌具有潜在的应用价值。可应用于食品体系中，为控制单核增生李斯特菌提供了一种基于生物拮抗的控制方法，对于减少动物疾病发生，提高相关产品的安全性具有重要意义。 

因此，本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量试验研究，终于完成了本发明。 

【发明内容】

[要解决的技术问题] 

本发明的目的是提供一种具有抑制单核细胞增生李斯特菌生长的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902。 

本发明的另一个目的是提供所述乳酸片球菌CCFM7902的用途。 

[技术方案] 

本发明是通过下述技术方案实现的。 

本发明涉及一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902，该菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.5493。 

本发明的乳酸片球菌CCFM7902具有下述性质： 

(1)具有耐酸性，在pH3.0下能存活； 

(2)具有耐胆盐能力，能耐受的胆盐浓度达0.3％； 

(3)在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有抑制作用； 

(4)对单核细胞增生李斯特菌在食品中的生长具有抑制作用； 

(5)对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用； 

(6)对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保护作用。 

本发明还涉及所述的乳酸片球菌CCFM7902在使用含有该菌株的工作发酵剂生产青贮饲料与发酵香肠中的用途。 

在所述的工作发酵剂中乳酸片球菌CCFM7902的浓度是10⁹cfu/g以上。 

根据本发明，所述的工作发酵剂是按照下述方法制备得到的： 

按照以MRS液体培养基重量计1～2％接种量，将乳酸片球菌CCFM7902原始菌种接种于MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h进行活化，连续以相同方式进行活化2-3代，得到活化培养物，然后按照以MRS液体培养基重量计1-3％接种量再接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h，接着在温度2-6℃与转速3500-4500r/min的条件下进行离心12-18min，去除上清夜，收集菌泥，然后，往所述的菌泥中加入冻干保护剂悬液，调整菌液浓度为10⁹cfu/ml，混匀后装入冻干瓶中，在温度-80℃的条件下预冻2-6h，然后转入真空冷冻干燥机进行冻干，于是得到所述的工作发酵剂，它在温度4℃下保存。 

根据本发明，所述的冻干保护剂悬液是按照下述方法制备得到的： 

将脱脂乳、海藻糖与去离子水按照重量比为1∶1∶8进行混合溶解，得到的溶液在温度115℃的条件下灭菌10min，得到所述的冻干保护剂悬液，它在温度4℃下保存。 

在本发明中，所述的青贮饲料是按照下述步骤制备的： 

首先，将青贮饲料原料揉切至1～4cm后待用； 

然后，将0.5重量份采用上述方法制备的工作发酵剂溶入到200-250重量份温度30℃-40℃的水中，搅拌溶解得到一种工作发酵剂悬液； 

接着，把该工作发酵剂悬液喷洒到2000重量份的青贮饲料原料中，翻拌均匀，将青贮饲料原料的水含量控制在以重量计65％-75％；当饲料原料的水含量超过其范围时，让饲料原料在日光下晾晒，使其含水量达到其范围；当饲料原料的水含量低于其范围时，往其饲料原料中喷洒水，使其含水量达到其范围； 

最后，把如此处理的青贮饲料原料装入青贮饲料桶中压实，然后密封，在常温下发酵3-4周后，得到含有乳酸片球菌CCFM7902的植物秸秆饲料。 

在本发明中，所述的青贮饲料原料是一种或多种选自稻草、玉米秸秆、高粱秸秆、小麦秸秆、天然牧草、栽培牧草、田间杂草、菜叶类、水生植物或嫩枝树叶的青贮饲料。 

在本发明中，所述的发酵香肠是按照下述步骤制备的： 

首先，将选自猪肉、牛肉、羊肉或鸡肉的肉切碎，在温度-6℃～-8℃的冷藏室中进行预冻24h； 

然后，让预冻肉与食盐、白砂糖、亚硝酸钠、复合磷酸盐按照重量比100∶3∶1.5∶0.015∶0.3充分混合得到一种混合物，所述的复合磷酸盐是由多聚磷酸钠、焦磷酸钠和磷酸氢二钠按照重量比2∶1∶1复配而成的， 

接着，将所述的混合物置于温度0～4℃下腌制24h，加入按照肉重量计5-10％香辛料，搅拌混合，然后加入采用所述方法制备的工作发酵剂，其加入量是以肉重量计0.5～1％，接着把含有工作发酵剂的肉灌注到肠衣中，得到一种灌肠； 

最后，所述的灌肠在温度14℃～18℃与相对湿度85％的条件下发酵20天；发酵结束后在温度66-70℃下进行烘烤，冷却后得到所述的发酵香肠。 

在本发明中，所述的香辛料是一种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。 

下面将更详细地描述本发明。 

本发明涉及一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902，该菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.5493。 

所述的乳酸片球菌CCFM7902是采用下述筛选方法获得的，并且对其性质进行了研究。 

一、筛选 

筛选方法的具体实施步骤如下： 

1、样品采集 

用无菌三角瓶采集自然发酵的发酵泡菜，原始样品取自无锡板桥村等地农民自制的发酵泡菜。采集的样品保存在温度0℃的条件下，在48h内进行样品分析和乳酸菌的分离。 

2、从样品中分离乳酸菌 

10g自然发酵泡菜样品置于带玻璃珠的90ml 0.1％无菌蛋白胨水中，振荡30min，然后使用0.1％无菌蛋白胨水按照体积比1∶10进行连续稀释。使用本技术领域的技术人员熟知的涂布平板法，将各个稀释梯度的菌液0.1ml分别涂布在以下三种培养基平板上：添加溴甲酚紫指示剂的MRS培养基(青岛海博生物技术有限公司产品，用于乳杆菌培养的培养基)，TPY固体培养基(青岛海博生物技术有限公司销售产品，用于双歧杆菌增菌培养)，M17琼脂培养基(BD Difco公司以商品名 

M17 Agar销售的培养基)，并分别在厌氧与温度37℃的培养条件下培养48h。从长有30-300个菌落的平板上分离单个菌落，用接种环随机挑取其中的5-10个菌落在普通肉汤培养基(青岛海博生物技术有限公司销售产品)中在厌氧与温度37℃的培养条件下进行培养24h，然后在琼脂板上划线。分离物连续划线三次得到纯的单菌落，然后进行本技术领域的技术人员熟知的革兰氏染色与接触酶试验。方法为：用接种环在平板上刮一环新鲜培养的菌苔，均匀涂抹在载玻片上，向上滴加一滴3％H₂O₂溶液，观察是否有气泡产生。若无气泡产生则表明该菌株不产过氧化氢酶，为接触酶实验阴性菌。将纯化后的菌株接入MRS液体培养基中，在厌氧与温度37℃的培养条件下进行培养24h，然后按照 以培养基重量计2-4％接种量接种于MRS液体培养基中，在厌氧与温度37℃的培养条件下进行发酵培养18-24h进行活化，连续传代3次，得到活性良好的乳酸菌。其纯化菌株可在MRS斜面上在温度4℃下短期保存，而长期保存需要在30％灭菌甘油溶液中在温度-80℃的条件下冻存。 

利用加溴甲酚紫的MRS琼脂培养基、TPY培养基和M17琼脂培养基上共分离出244个分离株。经过菌落形态、革兰氏染色、接触酶试验排除了3个革兰氏阴性，2个接触酶阳性和4个酵母。这样，分离得到了235株乳酸菌。 

3、筛选体外具有拮抗单核细胞增生李斯特菌的乳酸菌 

将上述分离乳酸菌株按照以培养基重量计2-4％接种量接种于MRS液体培养基中，在厌氧与温度37℃的培养条件下进行发酵培养18-24h，得到乳酸菌发酵液。 

然后，将灭菌的单核细胞增生李斯特菌选择性培养基(青岛海博生物技术有限公司销售，用于单核细胞增生李斯特菌生长的选择性培养)倾注到平板中(每平板15mL，平板为90mm标准平板)，单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)ATCC19114作为指示菌株(菌株购买自美国典型培养物保藏中心ATCC)，每板放入4个牛津杯(直径10mm)，牛津杯内加入上述乳酸菌发酵液200μL，置于温度4℃下扩散6h，然后放入培养箱内在温度37℃下培养24h，接着测量抑菌圈大小。以MRS液体培养基作为阴性对照，乳酸片球菌PA1(菌株来源江南大学食品生物技术中心)作为阳性对照，试验重复3次。筛选出具有比阳性对照更大抑菌圈的乳酸菌CCFM7902。 

这些试验结果列于表1。 

表1CCFM7902对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用 

由表1列出的结果可以看出，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902是对单核细胞增生李斯特菌生长具有明显抑制作用的乳酸菌。 

4、CCFM7902菌株的16s rDNA序列鉴定 

将乳酸片球菌CCFM7902按照以培养基重量计2-4％接种量接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-24h，取1mL新鲜菌液用细菌基因组DNA提取试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司销售，商品名为EZ-10 Spin Column Genomic DNA Isolation Kit)对基因组进行提取。然后以基因组DNA作为模板，采用文献(Critical Evaluation of Two Primers Commonly Used for Amplification of Bacterial 16S rRNA Genes.Applied and Environmental Microbiology，2008，74(8)：2461-2470)公布的细菌鉴定通用引物27F和1492R为引物，50μL反应体系进行PCR扩增。 

目的基因PCR扩增产物测序工作由上海生物工程技术服务有限公司完成。将乳酸片球菌CCFM7902的16S rDNA测序结果与NCBI核酸数据库进行比对，最终结果表明：本发明的CCFM7902与Pediococcus acidilactici7_4 cont1.26及Pediococcus acidilactici DSM 20284contig00019同源性均高达99％，因此，将本发明的CCFM7902菌株鉴定为乳酸片球菌，命名为Pediococcus acidilactici CCFM7902，于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.5493。 

二、乳酸片球菌CCFM7902的微生物学性质 

1、乳酸片球菌CCFM7902耐酸性能的测定 

配制人工胃液：取0.1N盐酸16.4ml加水摇匀，然后稀释至1000ml，再用浓盐酸或10％NaOH将其pH调至3.0，再在温度121℃下灭菌30min，然后按照1g/100ml比例加入商品胃蛋白酶制剂(上海雅培生物技术有限公司)，混匀得到所述的人工胃液。 

乳酸片球菌CCFM7902耐酸性能测定：将保存的乳酸片球菌CCFM7902按照以MRS培养基重量计2-4％接种量接种于MRS培养基中，在温度37℃下培养24h，以相同方式使用MRS培养液传代培养2～3次，然后取活化菌悬液40ml加入到50ml离心管中，在6000r/min条件下离心 5min，收集其菌体，然后用PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤2次，接着向离心管中加入40ml上述制备的人工胃液，在温度37℃的水浴中处理3h，每隔30min摇匀1次，分别在处理0h、1.5h、3h后采用标准平板菌落计数法进行活菌计数。 

乳酸片球菌CCFM7902耐酸特性测定结果列于表2。 

2、乳酸片球菌CCFM7902耐胆盐性能的的测定 

配制人工肠液：取KH₂PO₄ 6.8g加蒸馏水500ml溶解，用以重量计0.4％NaOH溶液将其pH调节至6.8，然后加水至1000ml，按照每100ml溶液中加0.3g猪胆盐(常规商业产品)的比例添加猪胆盐，充分溶解后于温度115℃下灭菌15min，得到所述的人工肠液。 

采用与前面所述的同样方法收集菌体。收集的菌体用PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤2次，接着向离心管中加入40ml上述制备的人工肠液，在温度37℃的水浴中处理3h，每隔30min摇匀一次，分别在处理0h、1.5h、3h后采用标准平板菌落计数法进行活菌计数。 

乳酸片球菌CCFM7902耐胆盐性能的测定结果列于表3。 

按照与乳酸片球菌CCFM7902耐酸、耐胆盐性能测定方法相同的方式使用戊糖片球菌CCFM0956进行了对照试验，其试验结果也列于表2和表3。 

表2：乳酸片球菌CCFM7902的耐酸特性测定结果 

表3：乳酸片球菌CCFM7902的耐胆盐特性测定结果 

表2和表3的结果清楚地表明，乳酸片球菌CCFM7902具有耐酸性，在pH3.0下可以生长，具有耐胆盐能力，能耐受的胆盐浓度达0.3％。 

3、乳酸片球菌CCFM7902抑制单核细胞增生李斯特菌在热狗和牛奶中生长 

将冷冻保存的乳酸片球菌CCFM7902按照以MRS培养基重量计2-4％接种量接种于MRS培养基中，在温度37℃下培养24h，以相同方式使用MRS培养液传代培养2～3次，然后取活化菌悬液1ml加入到50ml离心管中，在5000r/min条件下离心5min，收集其菌体，然后用PBS(pH＝7.2)重悬。以同样方式处理单核细胞增生李斯特菌ATCC19114。然后，在产品热狗表面涂抹单核细胞增生李斯特菌ATCC19114菌液，晾干后，再涂抹重悬乳酸片球菌CCFM7902菌液，晾干，8h后采用标准平板菌落计数法计数。对照试验按照同样方式进行，只是使用无菌的MRS液体培养基代替乳酸片球菌CCFM7902涂抹热狗表面。这些试验结果列于表4中。 

表4在热狗表面乳酸片球菌CCFM7902对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用 

试验结果表明，乳酸片球菌CCFM7902在热狗表面能够抑制单核细胞增生李斯特菌的生长。 

按照与上述方法相同的方式处理乳酸片球菌CCFM7902和单核细胞增生李斯特菌，然后将它们按照以牛乳重量计0.5％接种量分别接入到灭菌牛乳中，每隔2h采用标准平板菌落计数法进行计数，这些测定结果列于图1 中。 

试验结果表明，乳酸片球菌CCFM7902在牛乳中同样能够抑制单核细胞增生李斯特菌的生长。 

4、对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用。 

通过下述试验方法确定其抑制侵入性： 

使用RPMI1640培养液(Gibco公司产品)培养肠上皮细胞株HT-29细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。HT-29细胞在培养箱里在温度37℃与5％CO₂和95％空气的气体条件下进行培养，每培养48h就更换培养液1次，这样连续培养15天。然后，使用0.2％胰蛋白酶溶液对HT-29细胞在温度为37℃的条件下进行消化，接着使用RPMI1640培养液将其细胞浓度调节至2×10⁵个/mL，再加到6孔细胞培养板中，每孔2ml。每天更换其细胞培养液，至形成单层细胞。 

将乳酸片球菌CCFM7902在MRS液体培养基中于温度37℃下培养24h。在5000r/min条件下离心5min，收集其菌体，用PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤2次并重悬，调整菌液浓度为10⁸CFU/mL。对单核细胞增生李斯特菌ATCC19114按照上述同样方法处理。 

试验分为四个组进行，第一组为抑制粘附组，第二组为抑制侵入组，第三组为粘附对照组，第四组为侵入对照组。从上述6孔细胞培养板中吸出细胞培养液，用PBS缓冲液(pH＝7.2)清洗HT-29细胞3次，第一组与第二组每孔中加入乳酸片球菌CCFM7902悬液1ml和RPMI1640培养液1ml，混匀，感染复数约为200∶1。第三组与第四组每孔中加入2ml RPMI1640培养液，在温度37℃与5％CO₂和95％空气的气体条件下孵育1h。之后用PBS缓冲液(pH＝7.2)清洗3次，所有的孔均加入单核细胞增生李斯特菌悬液1ml和RPMI1640培养液1ml，混匀。在温度37℃与5％CO₂和95％空气的气体条件下继续孵育1h，得到的单层细胞用PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤3次，第一组与第三组加入0.5mL 0.5％Triton X-100溶液，培育8min，加入0.5mLPBS缓冲液(pH＝7.2)，随后进行梯度稀释；第二组与第四组洗涤后加入1ml含庆大霉素(100ug/ml)的RPMI1640培养液，在温度37℃与5％CO₂和95％空气的 气体条件下继续孵育1h，孵育结束后用PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤3次，加入0.5mL 0.5％Triton X-100溶液培育8min，加入0.5mLPBS缓冲液(pH＝7.2)随后进行梯度稀释。使用单核细胞增生李斯特菌选择性培养基对所有孔的单核细胞增生李斯特菌采用标准平板菌落计数法进行计数，每个试验组进行3个平行试验，重复进行3次。按照下式计算抑制粘附率和抑制侵袭率。 

抑制粘附率＝第三组计数结果/第一组计数结果； 

抑制侵袭率＝(第四组计数结果-第三组计数结果)/(第二组计数结果-第一组计数结果)。 

这些试验结果列于表5。 

表5乳酸片球菌CCFM7902对单核细胞增生李斯特菌侵染HT-29细胞的抑制作用 

从表5中可以看到，乳酸片球菌CCFM7902对单核细胞增生李斯特菌粘附和侵袭结肠癌细胞都具有明显的抑制作用，因此，对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用。 

5、对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠肝脾具有抑制作用。 

取20-25g健康雄性昆明小鼠40只，随机分为4组：空白组，单核细胞增生李斯特菌感染模型对照组，乳酸片球菌CCFM7902试验组以及青霉素阳性对照组。空白组每日灌喂脱脂乳0.5ml；其余3组每日灌胃浓度为10⁷cfu/mL单核细胞增生李斯特菌；乳酸片球菌CCFM7902试验组每日还需灌喂浓度2.0×10⁹cfu/mL乳酸片球菌CCFM7902脱脂乳悬液，青霉素阳性对照组每日还需口服青霉素，按照上述方式连续灌胃3天。3天后，试验结束后处死小鼠，取肝，脾，进行平板计数，测定单核细胞增生李斯特菌感染数。这些试验结果列于表6。 

表6：单核细胞增生李斯特菌在小鼠肝脾中的定植量 

表6的试验结果表明，乳酸片球菌CCFM7902对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠肝脾具有保护作用。 

由上述试验清楚地表明，所述的乳酸片球菌CCFM7902具有下述性质： 

(1)具有耐酸性，在pH3.0下能存活； 

(2)具有强的耐胆盐能力，能耐受的胆盐浓度达0.3％； 

(3)CCFM7902培养物在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有抑制作用； 

(4)在食品体系中对单核细胞增生李斯特菌的生长具有抑制作用； 

(5)对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用。 

(6)对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠肝脾具有保护作用。 

本发明还涉及所述的乳酸片球菌CCFM7902在使用含有该菌株的工作发酵剂生产青贮饲料与发酵香肠中的用途。 

根据本发明，在所述的工作发酵剂中乳酸片球菌CCFM7902的浓度是10⁹cfu/g以上。 

所述的工作发酵剂是按照下述方法制备得到的： 

按照以MRS液体培养基重量计1～2％接种量，将乳酸片球菌CCFM7902原始菌种接种于MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h进行活化，连续以相同方式进行活化2-3代，得到活化培养物，然后按照以MRS液体培养基重量计1-3％接种量再接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h，接着在温度2-6℃与转速3500-4500r/min的条件下进 行离心12-18min，去除上清液，收集菌泥，然后，往所述的菌泥中加入冻干保护剂悬液，调整菌液浓度为10⁹cfu/ml，混匀后装入冻干瓶中，在温度-80℃的条件下预冻2-6h，然后转入真空冷冻干燥机进行冻干，于是得到所述的工作发酵剂，它在温度4℃下保存。所述的MRS培养基是目前市场上销售的产品，例如青岛海博生物技术有限公司生产的产品。 

所述的冻干保护剂悬液是按照下述方法制备得到的： 

将脱脂乳、海藻糖与去离子水按照重量比为1∶1∶8进行混合溶解，得到的溶液在温度115℃的条件下灭菌10min，得到所述的冻干保护剂悬液，它在温度4℃下保存。 

在本发明中使用的冻干瓶与真空冷冻干燥机都是目前市场上销售的产品，例如北京众益中和生物技术有限公司销售的冻干瓶和上海沃迪科技有限公司销售的真空冷冻干燥机。 

根据本发明，所述的青贮饲料是按照下述步骤制备的： 

首先，将青贮饲料原料揉切至1～4cm后待用。 

在本发明中，所述的青贮饲料原料是一种或多种选自稻草、玉米秸秆、高粱秸秆、小麦秸秆、天然牧草、栽培牧草、田间杂草、菜叶类、水生植物或嫩枝树叶的青贮饲料。 

青贮饲料原料揉切所使用的设备都是目前市场上销售的产品，例如郑州富乐机械设备有限公司销售的粗杆类揉切机。 

然后，将0.5重量份采用上述方法制备的工作发酵剂溶入到200-250重量份温度30℃-40℃的水中，搅拌溶解得到一种工作发酵剂悬液； 

接着，把该工作发酵剂悬液喷洒到2000重量份的青贮饲料原料中，翻拌均匀，将青贮饲料原料的水含量控制在以重量计65％-75％；当饲料原料的水含量超过其范围时，让饲料原料在日光下晾晒，使其含水量达到其范围；当饲料原料的水含量低于其范围时，往其饲料原料中喷洒水，使其含水量达到其范围； 

接着，把如此处理的青贮饲料原料装入青贮饲料桶中压实，然后密封，在常温下发酵3-4周后，得到含有乳酸片球菌CCFM7902的青贮饲料。 

这种青贮饲料通常含有10⁶cfu/g以上乳酸片球菌CCFM7902，因此， 为控制单核细胞增生李斯特菌提供了一种基于生物拮抗的控制方法，减少单核增生李斯特菌对青贮饲料的污染，减少动物疾病发生，提高了相关产品的安全性。根据本发明，发酵香肠是按照下述步骤制备的： 

首先，将选自猪肉、牛肉、羊肉或鸡肉的肉切碎，肥瘦比为3∶7，在温度-6℃～-8℃的冷藏室中进行预冻24h； 

然后，让预冻肉与食盐、白砂糖、亚硝酸钠、复合磷酸盐按照重量比100∶3∶1.5∶0.015∶0.3充分混合得到一种混合物，所述的复合磷酸盐是由多聚磷酸钠、焦磷酸钠和磷酸氢二钠按照重量比2∶1∶1复配而成的， 

接着，将所述的混合物置于温度0～4℃下腌制24h，加入按照肉重量计5-10％香辛料，搅拌混合，然后加入根据权利要求6所述方法制备的工作发酵剂，其加入量是以肉重量计0.5～1％，接着把含有工作发酵剂的肉灌注到肠衣中，得到一种灌肠； 

最后，所述的灌肠在温度14℃～18℃与相对湿度85％的条件下发酵20天；发酵结束后在温度66-70℃进行烘烤，冷却后得到所述的发酵香肠。 

当然，在肉腌制时根据口味等要求，也可以适量添加一些调味品，例如味精等。 

在本发明中，所述的香辛料是一种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。 

在这些香辛料中，每味香辛料是否添加以及添加多少并不是关键的，通常按照实际食用情况进行调整确定。 

制备得到的发酵香肠通常用塑料真空包装机进行压膜包装，以便保存和运输。 

[有益效果] 

本发明的乳酸片球菌CCFM7902在体外对单核细胞增生李斯特菌具有明显的抑制作用，对人工胃液、人工肠液具有强的耐受性，在实际食品体系中可以显著抑制单核细胞增生李斯特菌的生长。对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用。对小鼠进行单核细胞增生李斯特菌急性感染试验，摄入乳酸片球菌CCFM7902的小鼠感染单核细胞增生李斯特菌的数量显著降低。所述乳酸片球菌CCFM7902可以用于制备 生产青贮饲料、发酵香肠等产品。 

【附图说明】

图1是在有CCFM7902条件下及其不加入CCFM7902条件下单核细胞增生李斯特菌在牛乳中的生长曲线。 

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。 

实施例1：制备本发明的工作发酵剂 

按照下述步骤制备所述的工作发酵剂： 

首先制备冻干保护剂悬液。将脱脂乳、海藻糖与去离子水按照重量比为1∶1∶8进行混合溶解，得到的溶液在温度115℃的条件下灭菌10min，得到所述的冻干保护剂悬液，它在温度4℃下保存。 

按照以MRS液体培养基重量计2％接种量，将乳酸片球菌CCFM7902原始菌种接种于MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下培养24h进行活化，连续以相同方式进行活化3代，得到活化培养物，然后按照以MRS液体培养基重量计2％接种量再接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下培养24h，接着在温度4℃与转速4000r/min的条件下进行离心15min，去除上清夜，收集菌泥，然后，往所述的菌泥中加入冻干保护剂悬液，调整菌液浓度为10⁹cfu/ml，混匀后装入冻干瓶中，在温度-80℃的条件下预冻4h，然后转入真空冷冻干燥机进行冻干，于是得到所述的工作发酵剂，它在温度4℃下保存。 

实施例2：使用本发明的工作发酵剂制备青贮饲料 

青贮饲料制备步骤如下： 

首先，使用郑州富乐机械设备有限公司销售的粗杆类揉切机将青贮饲料原料玉米秸秆揉切至1～4cm后待用； 

然后，将0.5重量份采用本发明方法制备的工作发酵剂溶入到250重量份温度35℃的水中，搅拌溶解得到一种工作发酵剂悬液； 

接着，把该工作发酵剂悬液喷洒到2000重量份的青贮饲料原料中，翻拌均匀，将青贮饲料原料的水含量控制在以重量计70％；当饲料原料的水含量超过其范围时，让饲料原料在日光下晾晒，使其含水量达到其范围；当 饲料原料的水含量低于其范围时，往其饲料原料中喷洒水，使其含水量达到其范围； 

最后，把如此处理的青贮饲料原料装入青贮饲料桶中压实，然后密封，在常温下发酵3-4周后，得到含有乳酸片球菌CCFM7902的植物秸秆饲料。 

经测定，该植物秸秆饲料含有2×10⁷cfu/g乳酸片球菌CCFM7902。 

采用相同的工艺，但不加乳酸片球菌CCFM7902制备的植物青贮饲料相比，能够明显抑制单核细胞增生李斯特菌在饲料中的生长和存活。 

实施例3：使用本发明的工作发酵剂制备发酵香肠 

发酵香肠按照下述步骤制备： 

将牛肉切碎，肥瘦比为3∶7，在温度-6℃～-8℃的冷藏室中进行预冻24h； 

然后，让预冻牛肉与食盐、白砂糖、亚硝酸钠、复合磷酸盐按照重量比100∶3∶1.5∶0.015∶0.3充分混合得到一种混合物，所述的复合磷酸盐是由多聚磷酸钠、焦磷酸钠和磷酸氢二钠按照重量比2∶1∶1复配而成的； 

接着，将所述的混合物置于温度0℃下腌制24h，加入按照牛肉重量计8％香辛料，搅拌混合均匀。所述的香辛料是由辣椒、花椒、胡椒、八角、茴香与姜粉料按照常规用量混合得到的。 

然后，往其牛肉中加入采用实施例1制备的工作发酵剂，其加入量是以牛肉重量计0.8％，接着把含有工作发酵剂的肉灌注到肠衣中，得到一种灌肠； 

最后，所述的灌肠在温度14℃～18℃与相对湿度85％的条件下发酵20天；发酵结束后在温度66-70℃下进行烘烤，其烘烤时间约10min，冷却后得到所述的发酵香肠。

所述的发酵香肠酸味柔和，香气浓郁，成色好，产品切片性良好，与利用实施例3相同工艺制作，但不加CCFM7902相比，从中检出单核细胞增生李斯特菌和其它有害菌的概率降低了80％。 

Claims (10)

1.一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902，该菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.5493。

2.根据权利要求1所述的乳酸片球菌CCFM7902，其特征在于它具有下述性质：

(1)具有耐酸性，在pH3.0下能存活；

(2)具有耐胆盐能力，能耐受的胆盐浓度达0.3％；

(3)在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有抑制作用；

(4)对单核细胞增生李斯特菌在食品中的生长具有抑制作用；

(5)对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用；

(6)对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保护作用。

3.根据权利要求1所述的乳酸片球菌CCFM7902在使用含有该菌株的工作发酵剂生产青贮饲料与发酵香肠中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在所述工作发酵剂中乳酸片球菌CCFM7902的浓度是10⁹cfu/g以上。

5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的工作发酵剂是按照下述方法制备得到的：

按照以MRS液体培养基重量计1～2％接种量，将乳酸片球菌CCFM7902原始菌种接种于MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h进行活化，连续以相同方式进行活化2-3代，得到活化培养物，然后按照以MRS液体培养基重量计1-3％接种量再接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h，接着在温度2-6℃与转速3500-4500r/min的条件下进行离心12-18min，去除上清夜，收集菌泥，然后，往所述的菌泥中加入冻干保护剂悬液，调整菌液浓度为10⁹cfu/ml，混匀后装入冻干瓶中，在温度 -80℃的条件下预冻2-6h，然后转入真空冷冻干燥机进行冻干，于是得到所述的工作发酵剂，它在温度4℃下保存。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的冻干保护剂悬液是按照下述方法制备得到的：

将脱脂乳、海藻糖与去离子水按照重量比为1∶1∶8进行混合溶解，得到的溶液在温度115℃的条件下灭菌10min，得到所述的冻干保护剂悬液，它在温度4℃下保存。

7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的青贮饲料是按照下述步骤制备的：

首先，将青贮饲料原料揉切至1～4cm后待用。

然后，将0.5重量份根据权利要求5所述方法制备的工作发酵剂溶入到200-250重量份温度30℃-40℃的水中，搅拌溶解得到一种工作发酵剂悬液；

接着，把该工作发酵剂悬液喷洒到2000重量份的青贮饲料原料中，翻拌均匀，将青贮饲料原料的水含量控制在以重量计65％-75％；当饲料原料的水含量超过其范围时，让饲料原料在日光下晾晒，使其含水量达到其范围；当饲料原料的水含量低于其范围时，往其饲料原料中喷洒水，使其含水量达到其范围；

最后，把如此处理的青贮饲料原料装入青贮饲料桶中压实，然后密封，在常温下发酵3-4周后，得到含有乳酸片球菌CCFM7902的青贮饲料。

8.根据权利要求3或7所述的用途，其特征在于所述的饲料原料是一种或多种选自稻草、玉米秸秆、高粱秸秆、小麦秸秆、天然牧草、栽培牧草、田间杂草、菜叶类、水生植物或嫩枝树叶的青贮饲料。

9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的发酵香肠是按照下述步骤制备的：

首先，将选自猪肉、牛肉、羊肉或鸡肉的肉切碎，在温度-6℃～-8℃的冷藏室中进行预冻24h；

然后，让预冻肉与食盐、白砂糖、亚硝酸钠、复合磷酸盐按照重量比100∶3∶1.5∶0.015∶0.3充分混合得到一种混合物，所述的复合磷酸盐是由多聚磷酸钠、焦磷酸钠和磷酸氢二钠按照重量比2∶1∶1复配而成的， 

接着，将所述的混合物置于温度0～4℃下腌制24h，加入按照肉重量计5-10％香辛料，搅拌混合，然后加入根据权利要求5所述方法制备的工作发酵剂，其加入量是以肉重量计0.5～1％，接着把含有工作发酵剂的肉灌注到肠衣中，得到一种灌肠；

最后，所述的灌肠在温度14℃～18℃与相对湿度85％的条件下发酵20天；发酵结束后在温度66-70℃进行烘烤，冷却后得到所述的发酵香肠。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的香辛料是一种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。 

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