CN104818232A - 一株具有抑菌活性的植物乳杆菌ab-3及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株具有抗甜瓜疫霉活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-3，保藏号为CGMCC No.9655。本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-3表现出对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的有效抑制性；表现出对甜瓜疫霉、甜瓜枯萎菌、娄地青霉和苹果炭疽菌的有效抑制性；具有良好的热稳定性，其发酵上清在经过100℃处理后出现抑菌率显著增大的结果；其发酵上清经中性蛋白酶酶解处理后抑菌活性能得到提高；其发酵上清具有耐贮藏特性，在常温贮藏20d后仍具有良好的抑菌活性。

Description

一株具有抑菌活性的植物乳杆菌AB-3及其应用
【技术领域】
本发明涉及一株分离自四川泡菜中的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)AB-3，以及该植物乳杆菌在发酵食品、抑制致病菌以及在生物农药和果蔬保鲜剂中的应用。
【技术背景】
植物的所有侵染性病害中，真菌性病害数量最为繁多，约占所有病害数量的70％以上。甜瓜疫霉病是由甜瓜疫霉菌(Phytophthora drechsleriTucker)感染甜瓜植株引起的真菌病害，甜瓜疫霉病是甜瓜生产上重要病害，一旦发病则难于控制。叶、茎和果实均可被侵染。目前，化学防治是控制甜瓜疫霉病的主要措施，但是长期使用化学农药会使病原菌产生抗药性，而且其化学残留和污染环境等弊端不符合现代社会所提倡的绿色无公害产品。
甜瓜枯萎病由尖镰孢菌甜瓜专化型(属半知菌亚门真菌)引致的植物病害，发病突然，症状包括严重的点斑、凋萎或叶、花、果、茎或整株植物的死亡。类似地，目前通常采用化学防治手段。
因此，现有技术中缺乏这类作物病害的绿色、无公害防治方法，即生物防治，例如采用益生菌治理病虫害，实现资源丰富、选择性强、无残留、无污染、成本低、兼防兼治、增产增收、保持生态平衡、能起到长效的意义。其中具有天然安全性的乳酸菌是生物防治的研究热点。
乳酸菌的抑菌机理主要表现在以下五个方面：一是乳酸菌产生乙酸、丙酸、乳酸和苯乳酸等有机酸，使环境中的pH值显著降低且保持酸性，抑制不耐酸有害菌的生长繁殖；二是乳酸菌产生抗生素或细菌素的蛋白质或肽类物质，对有害菌有抑制或杀灭作用；三是乳酸菌产生的过氧化氢能激活过氧化氢酶—硫氰酸系统，抑制或杀灭有害菌；四是乳酸菌产生的二氧化碳可抑制部分霉菌和革兰氏阴性菌；五是乳酸菌通过拮抗作用与有害菌竞争营养物质，从而达到抑菌作用。
【发明内容】
本发明的目的是提供一株具有抗甜瓜疫霉活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-3，该植物乳杆菌已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9655。
本发明还提供含有上述所述的植物乳杆菌的组合物。
本发明还提供上述植物乳杆菌抑制致病菌的应用，所述制致病菌包括：
(1)大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌；和
(2)甜瓜疫霉菌、娄地青霉、甜瓜枯萎菌和苹果炭疽。
本发明还提供上述植物乳杆菌在发酵乳、食品添加剂或保健食品中的应用，以及在植物生物农药或果蔬保鲜剂中的应用。
本发明的另一目的是提供所述菌株(L.plantarum AB-3)抑制甜瓜疫霉菌、娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽活性的应用。
本发明的另一目的是提供所述菌株(L.plantarum AB-3)抑大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的应用。
本发明的植物乳杆菌(L.plantarum)AB-3是经过筛选的、从四川泡菜中分离出的具有抗菌活性的乳酸菌。
a.菌株分离方法:
先将从四川采集的泡菜样品做前处理，再梯度稀释后(10-4，10-5，10-6)涂布于含有放线菌酮(0.1wt％，OXID公司)和硫酸粘菌素(0.1wt％，OXID公司)的MRS琼脂平板培养基或者M17琼脂平板培养基(OXID公司)上，30℃厌氧培养48h～72h，挑取单菌落，转接于TPY增菌培养液中，30℃培养24h～48h，划线接种于MRS琼脂培养基(OXID)，30℃培养24h～48h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌，暂定为乳酸菌。将菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h～48h后，做进一步鉴定和保存。
b.分子生物学鉴定:
将供试菌株接种于TPY增菌培养液中，30℃恒温培养24h，经TPY传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
采用通用引物，正向引物是27f(对应于Escherichia coil 8-27位碱基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物是1495r(对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，以菌体DNA为扩增模板PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定，确定为植物乳杆菌，其系统发育树状图见图3。
c.形态学特性:
观察所得植物乳杆菌L.plantarum AB-3的形态，具有以下特征：细胞呈直杆状，有圆形末端，长3.0-8.0μm，宽0.9-1.2μm，呈单个、成对，或短链状出现(见图1)，有些菌能减少硝酸盐，偶尔有些菌株表现出拟过氧化氢酶活性。
d.菌落形态特性:
观察所得植物乳杆菌L.plantarum AB-3，其在MRS培养基上生长形成乳白色菌落，不透明，圆形，表面光滑，中央凸起，直径约为1.2-1.5mm(见图2)。
植物乳杆菌抑菌性能测定
e.植物乳杆菌上清液的制备方法：
以广泛采集的347株植物乳杆菌作为筛选本发明的具有抑制致病菌活性植物乳杆菌的来源，该347株植物乳杆菌由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供，它们分别分离自内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古国地区的传统发酵食品中。把冻存管中的保藏液接种到5mL的MRS培养基中，震荡混匀，37℃恒温培养24h，以2％的接种量连续活化三代，取第三代的发酵液(37℃恒温培养24h)以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。
f.打孔法测定植物乳杆菌AB-3的抗甜瓜疫霉菌活性：
将在PDA培养基(OXOID公司)上活化好的甜瓜疫霉菌用PBS缓冲液洗下来制成105cfu/mL的孢子菌悬液，把菌悬液按1％(V/V)接入PDA培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。
在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。选取小孔周围有明显和较大抑菌圈(抑菌圈>30.00mm)的植物乳杆菌作复筛菌株。
g.植物乳杆菌AB-3对娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽的抑制活性测定
用打孔法检测该菌对娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽的抑制活性，与抑制甜瓜疫霉菌的试验相同，把霉菌孢子悬液加到PDA培养基中，制成菌板，利用打孔法加入相应的植物乳杆菌的MRS上清液，最后检测抑菌圈直径。
h.不同浓度的发酵上清液对抑菌活性的影响：
植物乳杆菌发酵液经真空冷冻浓缩将其浓度分别浓缩为原浓度的2倍和4倍以及通过等体积稀释法将原发酵液浓度稀释2倍。以未处理的发酵上清作对照，通过打孔法，测量抑菌圈直径并观察抑菌效果。
i.不同发酵时间对发酵上清液抑菌活性的影响
将植物乳杆菌菌株接种于MRS液体培养基中进行活化，活化2代后，将第3代的菌株分别接种于多个MRS液体培养基中继续培养，从0小时开始，每两小时取出三个平行样，在600nm下测定植物乳杆菌的OD值，制作菌株的生长曲线，并按照上述琼脂扩散法测定各个不同时间点发酵上清液的抑菌效果。
j.不同温度对发酵上清液抑菌活性的影响
将筛选得到植物乳杆菌的发酵上清液分别在50、60、70、80、100℃水浴中加热10min，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照，利用上述的打孔法测定菌株上清液经不同浓度处理后的抑菌活性。
k.不同pH对发酵上清液抑菌活性的影响
将筛选得到植物乳杆菌的发酵上清液分别用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl溶液调pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。以未处理的植物乳杆菌发酵上清为对照，利用上述的打孔法测定不同pH条件下发酵上清液的抑菌活性。
l.蛋白酶处理对发酵上清液抑菌活性的影响
将植物乳杆菌发酵上清液分别用1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，分别加入1mg/mL胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K，于37℃水浴处理2h，然后在100℃下煮沸灭活3min终止酶反应，再将pH调节至原来发酵上清液的pH，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照，利用上述的琼脂扩散法测定不同pH条件下发酵上清液的抑菌活性。
m.常温贮藏对发酵上清液抑菌活性的影响
将筛选得到菌株的发酵上清液分别在常温下放置3d、5d、10d、15d、20d，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照，利用上述的打孔法测定不同贮藏时间发酵上清的抑菌率。
n.L.plantarum AB-3对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的抑制活性测定。
以本实验室保藏的大肠杆菌O157:H7(Escherchia coli O157:H7)、鼠伤沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)和弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri CMCC 51592)等3株肠道致病菌为指示菌，三株菌分别用不同的液体培养基活化，LB液体培养基用于肠杆菌O157:H7的活化和传代；NB液体培养基用于鼠伤沙门氏菌、弗氏志贺氏菌的活化和传代，都以2％的量传代活化三代用于抑菌试验。
将指示菌菌悬液稀释到106cfu/mL以1:100的量加到冷至45℃的灭菌MRS培养基中，摇匀后定量加入20mL/平皿，冷却制成含菌平板，在每个平板上用8mm打孔器均匀打出6个小孔并标注菌号。每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS或全脂乳发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。
通过以上方法选育出具有较强抗菌和抑菌(包括对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、甜瓜疫霉菌、娄地青霉、甜瓜枯萎菌和苹果炭疽)性质的植物乳杆菌菌株，命名为植物乳杆菌L.plantarum AB-3。
因此，本发明提供植物乳杆菌L.plantarum AB-3能够作为抑菌剂或抗病毒成分应用到生物农药中。植物乳杆菌L.plantarum AB-3和包含植物乳杆菌L.plantarum AB-3的组合物都可用于抑制、阻止或消除甜瓜枯萎菌、甜瓜疫霉菌、娄地青霉和苹果炭疽引起的植物疾病或危害，并具有对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的抑菌效果。
含有植物乳杆菌L.plantarum AB-3农药组合物可根据施用加工成各种剂型，如粉剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、乳剂、乳油、浓乳剂、乳膏、糊剂、胶体剂、熏烟剂、熏蒸剂、烟雾剂、油剂、颗粒剂、微粒剂等。
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-3具有以下有益效果：
(1)所述植物乳杆菌L.plantarum AB-3能抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的生长；
(2)植物乳杆菌L.plantarum AB-3具有良好的热稳定性，其发酵上清在经过100℃处理后出现抑菌率显著增大的结果；
(3)植物乳杆菌L.plantarum AB-3发酵上清pH调到4.0时仍有较好的抑菌活性；
(4)植物乳杆菌L.plantarum AB-3发酵上清经中性蛋白酶处理后抑菌活性能得到提高；
(5)植物乳杆菌L.plantarum AB-3发酵上清具有耐贮藏特性，在常温贮藏20d后仍具有良好的抑菌活性；
(6)植物乳杆菌L.plantarum AB-3能抑制甜瓜疫霉菌、甜瓜疫霉菌、娄地青霉和苹果炭疽菌的生长，阻止或消除甜瓜疫霉病和甜瓜枯萎病。
本发明涉及的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-3于2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.9655。
附图说明
图1L.plantarum AB-3菌落形态图片
图2L.plantarum AB-3菌体显微镜图片(X1000)
图3L.plantarum AB-3系统发育树状图
图4L.plantarum AB-3在不同浓度时的抑菌圈大小(mm)
图5L.plantarum AB-3不同培养时间时的抑菌圈大小(mm)
图6L.plantarum AB-3不同温度处理后的抑菌圈大小(mm)
图7L.plantarum AB-3不同的pH的下的抑菌圈大小(mm)
图8L.plantarum AB-3经蛋白酶处理后的抑菌圈大小(mm)
图9L.plantarum AB-3常温贮藏后的抑菌圈大小(mm)
图10L.plantarum AB-3对娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽菌的抑菌圈大小(mm)
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实例的限制。
本发明中的试验菌株：所用的347株植物乳杆菌由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离、鉴定并保存，它们分别分离自内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古国地区的传统发酵食品中，347株植物乳杆菌的16S核糖体RNA信息都已上传到NCBI数据库。
本发明所用的指示菌真菌：甜瓜疫霉(Phytophthora drechsleriTucker)、娄地青霉(Penicillium roqueforti)、甜瓜枯萎(尖孢镰刀菌甜瓜专化型，F.oxyspoorum f.sp.Melonis)和苹果炭疽(Glomerellacingulate)由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供，面向所有的研究者开放。
本发明所用的指示菌肠道致病菌：大肠杆菌O157:H7(Escherchiacoli O157:H7)、鼠伤沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)和弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri CMCC 51592)由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供，三株分别用不同的液体培养基活化，LB液体培养基用于肠杆菌O157:H7的活化和传代；NB液体培养基用于鼠伤沙门氏菌、弗氏志贺氏菌的活化和传代，都以2％(V/V)的量传代活化三代用于抑菌试验。
本发明涉及的培养基包括：
MRS培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌。
M17培养基的组成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨5g、酵母粉2.5g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、二钠甘油19g、琼脂11g、蒸馏水1L。
TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温800.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、15g琼脂、蒸馏水1L，121℃、15min灭菌。
MRS液体培养基的组成为：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，121℃、15min灭菌。
LB液体培养基的组成是胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，调节pH至7.0左右，121℃、15min灭菌。
NB液体培养基的组成是蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L，调节pH至7.4左右，121℃、15min灭菌。
植物乳杆菌发酵上清液的制备：把冻存管中的植物乳杆菌保藏液接种到5ml的MRS培养基中，震荡混匀，37℃恒温培养24h，连续活化三代，取第三代发酵液以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。
指示菌：将甜瓜疫霉菌接种在PDA斜面培养基上，在28℃培养箱内培养4-7d，观察其菌落形态及最佳培养时间，使指示菌活力恢复至正常，用含有PBS缓冲液(含0.05％吐温80)清洗其培养基，清洗到90mL的PBS缓冲液中制成105cfu/ml的甜瓜疫霉菌孢子悬液。
甜瓜枯萎菌、苹果炭疽和娄地青霉指示菌的培养(或活化)条件是：将冻存管中的指示菌接种在PDA斜面培养基(OXOID公司)上，在28℃培养箱内培养4-7d，观察其菌落形态铺满PDA培养基，使指示菌活力恢复至正常。
检测抑菌活性时，在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，用游标卡尺测量抑菌圈的大小。
实施例1植物乳杆菌AB-3对甜瓜疫霉菌、娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽的抑制活性测定。
用打孔扩散法进行试验，在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌AB-3的试验编号，每孔加入100μL该植物乳杆菌的MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后28℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小，用游标卡尺测量甜瓜疫霉菌菌株的抑菌圈大小。L.plantarum AB-3的MRS发酵上清液的抑菌效果如表1。
表1 L.plantarum AB-3的对甜瓜疫霉菌抑菌圈大小(mm)
      
L.plantarum AB-3的MRS发酵上清液用打孔法测定的对甜瓜疫霉菌抑菌圈大小为31.29±0.05mm，对甜瓜疫霉菌表现出较强的抑菌活性，此外结合347株植物乳杆菌对甜瓜疫霉抑菌情况统计可知，L.plantarum AB-3是347株植物乳杆菌中具有较强抑制甜瓜疫霉活性的优良菌株。
表2 347株植物乳杆菌对甜瓜疫霉抑菌情况统计
      
注：“高”、“低”、“不抑制”分别代表抑菌圈>30.00mm、8-30mm和<8mm
类似的，用打孔扩散法检测该菌对娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽的抑制活性，与抑制甜瓜疫霉菌的试验方法相同，把霉菌孢子悬液加到PDA培养基中，制成菌板，利用打孔法加入相应的植物乳杆菌的MRS或全脂乳上清液，最后检测L.plantarum AB-3对娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽的抑菌圈直径，结果如图10所示。
结果显示，L.plantarum AB-3对甜瓜疫霉具有优秀的抑菌活性，对娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽表现出良好的抑菌性能。
实施例2L.plantarum AB-3对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的抑制活性测定
分别将指示菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌)菌悬液分别稀释到106cfu/mL以1:100(V/V)的量加到冷至45℃的灭菌MRS培养基中，摇匀后定量加入20mL/平皿，冷却制成含菌平板，在每个平板上用8mm打孔器均匀打出6个小孔并标注菌号。每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS或全脂乳发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测L.plantarum AB-3对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的抑菌圈的大小，结果如表3和表4.
表3 对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的抑菌圈大小(mm)
      
注：“++”表示抑菌圈直径在20-30mm之间
以相同的检测手段检验并统计347株植物乳杆菌的MRS和脱脂乳培养基上清液对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄葡萄球菌和李斯特菌的抑菌圈大小，如表4所示。
表4 347株植物乳杆菌的MRS和脱脂乳培养基上清液的抑菌情况汇总
      
注:‘高’、‘低’和‘不抑制’分别表示的抑菌圈大小为>12mm,8-12mm和<8mm。
如表3所示，植物乳杆菌AB-3在MRS培养基中获取的上清液对三株指示菌均有抑菌活性，抑菌圈大小均为“++”(抑菌圈直径在20-30mm之间)，而在全脂乳中培养后获取的上清液只对大肠杆菌有抑菌活性，其抑菌活性也是“++”，这可能是由培养基的不同造成的，抑制鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的抑菌物质与抑制大肠杆菌的抑菌物质不是同一种物质，而这种物质在MRS培养基培养的条件下产生，在全脂乳培养基培养的条件下不产生。
此外，结合表4可知，与其他植物乳杆菌相比，植物乳杆菌AB-3对三株指示菌的抑菌活性较强，属于具有广谱抑菌活性的植物乳杆菌，是347株菌中的优良菌株。
实施例3：L.plantarum AB-3的MRS发酵液经不同浓度处理后的抑制甜瓜疫霉菌抑菌圈大小
将植物乳杆菌AB-3发酵液经真空冷冻浓缩将其浓度分别浓缩为原浓度的2倍和4倍以及通过等体积稀释法将原发酵液浓度稀释2倍。以未处理的发酵液作对照，通过打孔法，测量对甜瓜疫霉菌抑菌圈大小。
由图4可知，L.plantarum AB-3的抑菌率随浓度的升高而增大，在其浓度为原液浓度的4倍时抑菌率最大为35.3±1.06mm，而在其浓度为稀释2倍时抑菌圈最小为10.12±0.57mm，证明菌株AB-3的抗甜瓜疫霉活性随浓度的增大而增大。
实施例4：L.plantarum AB-3在MRS中的培养时间对其抗甜瓜疫霉菌抑菌率的影响
将植物乳杆菌菌株接种于MRS液体培养基中进行活化，活化2代后，将第3代的菌株分别接种于多个液体培养基中继续培养，从0小时开始，每两小时取出三个平行样，在600nm下测定植物乳杆菌的OD值，并按照上述琼脂打孔法测定各个不同时间点发酵上清液的抑菌效果。以培养时间为横坐标，以OD值和抑菌圈大小为纵坐标绘制菌株生长曲线和抑菌圈变化曲线。
由图5可知，0-10h时，菌株L.plantarum AB-3的发酵上清液无抑菌活性，10h以后，该菌的抑菌圈随着时间和OD值的增大而增大，该菌株在12h左右进入稳定期，而抑菌活性即抑菌圈的大小在14h时也进入一个相对平稳变化的时期，22h是抑菌圈大小达到最大值为23.10±0.00mm，以上分析证明菌株L.plantarum AB-3在22h时有最高的抑菌活性，发酵液应用于生产至少要发酵14h。
实施例5：L.plantarum AB-3抑菌物质对温度的稳定性测定
将植物乳杆菌AB-3的发酵上清液分别在50、60、70、80、100℃水浴中加热10min，以未处理的植物乳杆菌AB-3发酵上清为对照，利用上述的打孔法测定对甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小。
由图6可知，L.plantarum AB-3的发酵上清液经过不同温度处理后，L.plantarum AB-3对于甜瓜疫霉菌的抑菌率都大于22.00mm，且随处理温度的不断升高，该菌对甜瓜疫霉病菌的抑菌活性有升高的趋势，但在经80℃处理后，抑菌活性最小，抑菌圈大小仅为22.84±2.88mm，但在100℃处理10min后该菌的抑菌率显著增大(P>0.05)达到最大值33.28±1.34mm，发生上述现象的原因可能是发酵液加热时抑菌物质发生热分解而产生了一些抑菌活性肽。以上分析证明植物乳杆菌AB-3发酵液中的抑菌物质对高温并不敏感，具有一定的热稳定性。
实施例6：L.plantarum AB-3在不同pH条件下的抑菌活性
将植物乳杆菌AB-3发酵上清液分别用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl溶液调pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。以未经调节的植物乳杆菌AB-3发酵上清液(pH 3.82)为对照，利用上述的打孔法测定不同pH条件下发酵上清液对甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小。
由图7可知，植物乳杆菌AB-3的无菌上清液在酸性条件下抑菌活性强，随着pH的升高，菌株代谢产物的抑菌活性逐渐减弱，抑菌圈大小呈下降趋势，并且在pH>4.0的条件下丧失抑菌活性，说明低pH值是植物乳杆菌代谢产物产生抑菌作用的必要条件。该菌的上清液在pH为2.0的条件下抑菌圈最大，抑菌圈大小为35.65±0.68mm，以上分析证明在pH>4.0环境下抑菌物质可能已经被破坏，并且该菌的抑菌活性在酸性条件下较好，通过以上分析证明该菌株的抑菌活性在酸性条件下可达到最大值。
实施例7：L.plantarum AB-3经不同的蛋白酶处理后的抑菌活性
植物乳杆菌AB-3发酵上清液分别用1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，分别加入1mg/mL胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K，于37℃水浴处理2h，然后在100℃下煮沸灭活3min终止酶反应，再将pH调节至原来发酵上清液的pH，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照，利用上述的打孔法测定经不同蛋白酶处理后发酵上清液的抑菌活性。
由图8可知，植物乳杆菌AB-3发酵上清液经中性蛋白酶酶解后与原液抑菌圈大小相比不降反升，这可能因为抑菌多肽经蛋白酶切割后产生新的抑菌多肽；而经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后，该菌的抑菌率显著降低，但是并未完全消失，这说明该菌株的抑菌物质中除了有蛋白类的抑菌物质外还含有有非蛋白类的抑菌物质。可见植物乳杆菌AB-3发酵上清液对于蛋白酶有良好的耐受性和稳定性。
实施例8：L.plantarum AB-3常温贮藏后的抑菌圈大小
植物乳杆菌AB-3发酵上清液分别在常温25℃下放置3d、5d、10d、15d、20d，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照，利用上述的打孔法测定不同贮藏时间下发酵上清液的抑菌圈大小。
由图9可知，该菌的发酵上清液随着在常温下一段时间，抑菌圈大小并无固定下降趋势，在经20d贮藏后抑菌圈依然可以达到18.96±1.42mm，且在15d还有22.70±0.57mm大小的抑菌圈，表现出较好的抑菌特性，以上分析证明L.plantarum AB-3的发酵上清液的抗甜瓜疫霉菌活性在一但时间内具有保持稳定性的能力。
实施例9：L.plantarum AB-3抑制娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽菌的生长
分别将指示菌娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽菌接种在PDA斜面培养基上，在28℃培养箱内培养4-7d，观察其菌落形态及最佳培养时间，使指示菌活力恢复至正常，用含有PBS缓冲液(含0.05％吐温80)清洗其培养基，清洗到90mL的PBS缓冲液中制成105的娄地青霉、甜瓜枯萎菌和苹果炭疽菌孢子悬液，把菌悬液按1％(V/V)的量接入PDA培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。
在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌AB-3的实验编号，每孔加入100μL该植物乳杆菌的MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后30℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小，用游标卡尺测量菌株的抑菌圈大小。
如图10所示，用打孔法检测到L.plantarum AB-3对娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽菌的抑菌圈直径分别为16.71±0.52mm、13.32±2.78mm和16.62±1.97mm，实验条件下对甜瓜疫霉、娄地青霉、甜瓜枯萎和苹果炭疽均表现出一定的抑菌活性，具有较好的广谱抗霉菌特性。
综上所述，本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-3表现出对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的有效抑制性；表现出对甜瓜疫霉、甜瓜枯萎菌、娄地青霉和苹果炭疽菌的有效抑制性；具有良好的热稳定性，其发酵上清在经过100℃处理后出现抑菌率显著增大的结果；其发酵上清经中性蛋白酶酶解处理后抑菌活性能得到提高；其发酵上清具有耐贮藏特性，在常温贮藏20d后仍具有良好的抑菌活性。

Claims (5)

1.一株具有抑菌活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-3，该植物乳杆菌已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9655。
2.含有如权利要求1所述的植物乳杆菌的组合物。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌抑制致病菌的应用，其特征在于所述制致病菌包括：
(1)大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和弗氏志贺氏菌；和
(2)甜瓜疫霉菌、娄地青霉、甜瓜枯萎菌和苹果炭疽。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌作为发酵剂或食品添加剂在食品中的应用。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌在植物生物农药或果蔬保鲜剂中的应用。
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