CN113875478A - 普通青霉和罗伊式乳杆菌混合发酵产物在减轻苹果连作障碍中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了普通青霉和罗伊式乳杆菌混合发酵产物在减轻苹果连作障碍中的应用，属于农业微生物技术领域。本发明研究发现，普通青霉(Penicillium commune)D12和罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)混合发酵产物能够促进苹果幼苗生长，增强根系活力，提高土壤酶和根酶活性，降低丙二醛含量，可培养真菌数量显著降低，可培养细菌数量显著增加，引起苹果连作障碍的镰孢属相对丰度降低，改善土壤微生物群落结构，使其往有利的方向发展，可作为防控苹果连作障碍绿色有效的措施。

Description

普通青霉和罗伊式乳杆菌混合发酵产物在减轻苹果连作障碍 中的应用

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及普通青霉和罗伊式乳杆菌混合发酵产物在减轻苹果连作障碍中的应用。

背景技术

苹果连作障碍是苹果重茬栽培时普遍发生的一种综合病。近年来随着苹果产业的不断发展，尤其是苹果新品种的不断更新以及矮化密植技术的推广，苹果连作障碍已经发展成为影响苹果产业可持续发展的主要问题。国内外研究表明连作障碍的发生与微生物群落结构失衡有密切联系，其中最显著的表现为连作土壤中有害真菌数量的增加，有益细菌数量减少。王功帅和王晓宝等研究表明，造成我国主要苹果产区环渤海湾和西北黄土高原地区苹果连作障碍发生的主要病原菌为镰孢菌属，通过致病性试验发现其对苹果砧木平邑甜茶幼苗有强致病性。因此，抑制病原菌数量，改善土壤的微生物群落结构对防控苹果连作障碍具有重要意义。

在土壤中利用有益微生物来改善微生物环境，对苹果连作障碍进行生物防治是一种绿色环保的方式。在苹果连作障碍研究中，有益微生物大多从健康苹果树根际分离获得，细菌多为枯草芽胞杆菌和假性单芽胞杆菌，真菌有丛枝菌根真菌、木霉和青霉，放线菌以链霉属为主。混合微生物防治是一种生物防治的新思路新热点，优点在于对主要病原菌抑制作用优于单一菌株，并且具有较好的稳定性。丛韫喆等(2020)研究发现拟康氏木霉和黑根霉混合发酵液对苹果链格孢具有良好的抑菌效果，大田试验表明其混合发酵液能够提高苹果叶片防御相关酶SOD、POD以及PAL的酶活力，进而有效防治苹果斑点落叶病。周登博(2013)研究表明6种基质的复合拮抗菌发酵液均能降低香蕉枯萎病的发病率，且防病效果与酶活性呈正相关。

但并非所有的混合生防菌剂都具有极高的活性来稳定抑制病害，混合生防菌剂中的微生物之间存在相互作用，积极的作用能够使对病原物的抑制效率提高，消极的作用却直接导致防效下降。而且，混合生防菌剂中微生物之间会存在很多的潜在的拮抗作用，影响了生防菌剂防效的发挥。对于2种或2种以上的微生物制成的混合生防菌剂，其有效性已不能通过单个微生物在生防菌剂中的表现而预测得出。

青霉菌生命力强，生长速度快，能够通过竞争营养和空间来限制病原菌的生长(王芳等，2013；安婧婧和沈瑞清，2015；王海波等，2016)。并且青霉菌能够产生丰富的次级代谢产物，包括聚酮类、生物碱类、萜类、大环内酯等，普遍具有抑菌活性(张德武等，2018)。有些青霉菌被证实具有一定的溶磷特性，且具有一定的促生效果(彭艳等，2020)。

乳酸菌作为公认的有益微生物，其代谢产生的活性物质被证明具有抗真菌活性，如有机酸、过氧化氢和细菌素，并且细菌素被认为是抗生素最有潜力的替代物。有研究表明，乳杆菌属(Lactobacillus)不仅可以抑制灰霉属和镰孢属等真菌菌丝体和孢子的生长，还可以降解真菌毒素(程波财等，2009；Li et al，2020)。

但目前还未见有将普通青霉和罗伊式乳杆菌混合发酵产物应用于减轻苹果连作障碍的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供普通青霉和罗伊式乳杆菌混合发酵产物在减轻苹果连作障碍中的应用。本发明研究发现，普通青霉(Penicillium commune)D12和罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)混合发酵产物能够促进苹果幼苗生长，增强根系活力，提高土壤酶和根酶活性，降低丙二醛含量，可培养真菌数量显著降低，可培养细菌数量显著增加，引起苹果连作障碍的镰孢属相对丰度降低，改善土壤微生物群落结构，使其往有利的方向发展，可作为防控苹果连作障碍绿色有效的措施。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一方面，提供普通青霉(Penicillium commune)和罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)混合发酵产物在如下(1)或(2)中的应用：

(1)减轻苹果连作障碍；

(2)制备减轻苹果连作障碍的微生物制剂。

上述应用中，所述普通青霉和罗伊式乳杆菌混合发酵产物是由普通青霉发酵产物和罗伊式乳杆菌发酵产物按体积比1：1混合而成。

优选的，所述普通青霉发酵产物中活菌数大于或等于2×10⁹CFU/ml；所述罗伊式乳杆菌发酵产物中活菌数大于或等于3×10⁹CFU/ml。

优选的，所述普通青霉发酵产物由如下方法制备而成：

将活化后的普通青霉接种至PDA液体培养基中，25-30℃、发酵培养4-6天；将发酵液过滤，分离上清液，即制备得到普通青霉发酵产物。

优选的，所述罗伊式乳杆菌发酵产物由如下方法制备而成：

将活化后的罗伊式乳杆菌接种至改良MRS培养基中，37℃条件下培养4-6天，得罗伊氏乳杆菌发酵液；将罗伊氏乳杆菌发酵液混匀至无沉淀，8000r/min离心10min，即得罗伊氏乳杆菌发酵产物。

所述普通青霉(Penicillium commune)为普通青霉D12，其于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；生物保藏号为CGMCC No.11112。

所述罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，编号为CICC 6118。

本发明的第二方面，提供一种减轻苹果连作障碍的微生物制剂，所述微生物制剂是上述普通青霉(Penicillium commune)和罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)混合发酵产物为有效成分。

所述微生物制剂是生物保藏号为CGMCC No.11112的普通青霉D12发酵产物和编号为CICC 6118的罗伊式乳杆菌发酵产物按体积比1:1混合而成。

所述普通青霉D12发酵产物中的活菌数大于或等于2×10⁹CFU/ml；所述罗伊式乳杆菌发酵产物中活菌数大于或等于3×10⁹CFU/ml。

本发明的第三方面，提供一种减轻苹果连作障碍的方法，包括以下步骤：

将上述普通青霉(Penicillium commune)和罗伊式乳杆菌(Lactobacillusreuteri)混合发酵产物或上述微生物制剂施入苹果根际土壤。

本发明的有益效果：

本发明研究发现，在土壤中添加普通青霉D12和罗伊氏乳杆菌混合发酵产物可促进平邑甜茶幼苗生长，增强根系活力，提高土壤酶和根酶活性，降低丙二醛含量，可培养真菌数量显著降低，可培养细菌数量显著增加，引起苹果连作障碍的镰孢属相对丰度降低，改善土壤微生物群落结构，使其往有利的方向发展，其中以普通青霉D12和罗伊氏乳杆菌混合发酵产物效果最佳，可作为防控苹果连作障碍绿色有效的措施。

附图说明

图1为普通青霉D12在玉米粉培养基上与腐皮、层出、轮枝、尖孢镰孢菌的对峙试验；图中，A为尖孢镰孢菌，B为层出镰孢菌，C为轮枝镰孢菌，D为腐皮镰孢菌。

图2为罗伊氏乳杆菌与苹果连作障碍相关有害菌的抑菌试验结果。

图3为不同处理对平邑甜茶幼苗生物量的影响。

图4为不同处理对平邑甜茶幼苗根系呼吸速率的影响。

图5为不同处理的平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性及丙二醛含量。

图6为不同处理土壤真菌群落主坐标分析。

图7为不同处理土壤真菌群落聚类分析。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：

PDA固体培养基：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。

PDA液体培养基：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL。

玉米粉培养基：玉米粉10g，水20ml，121℃高压灭菌20min，备用。

改良MRS培养基：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温80 1.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，蒸馏水1000ml。

实施例1：普通青霉D12发酵产物制备及挥发性成分的鉴定

普通青霉D12分离自种植甘薯的土壤，并将其进行了生物保藏，生物保藏信息如下：

保藏时间：2015年7月14日；

保藏中心：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏号：CGMCC No.11112。

1.普通青霉D12发酵产物的制备

(1)平板活化菌株

挑取D12菌丝于PDA固体培养基上，于27℃培养5d。

(2)种子液制备

500mL PDA液体培养基加入1L的三角瓶，用封口膜或纱布包口，121℃灭菌20min。冷却到室温后挑取平板菌丝于PDA液体培养基中旋转摇床上培养24-36h，培养温度(27±2)℃，摇床转速200r/min。

(3)发酵罐培养条件

将PDA液体培养基装入发酵罐，121℃灭菌30min，冷却至30℃接种种子液，接种量10％(体积比)，培养时间5天，培养温度(27±2)℃，搅拌转速600r/min，通风量1.0L/min，发酵完成即得D12发酵菌液；8层纱网过滤得上清液，即普通青霉D12发酵产物。

2.普通青霉D12发酵产物成分的鉴定

用GC-MS测定挥发性有机物：1L普通青霉D12发酵产物12000r/min离心5min。上清液用1L乙酸乙酯提取3次，合并提取液3次。提取液经旋转蒸发器在37℃下浓缩至干粉。将干粉溶于2mL甲醇(色谱纯)中，过0.22μm滤膜过滤后置于进样瓶中进行GC-MS分析。GC-MS分析条件：毛细管柱为Rtx-5MS(60.0m×0.25μm×0.25mm)，进样口温度为250℃，载气为高纯氦气，流动控制方式为压力，压力为117.6KPa，总流速为14.0mL/min，柱流速为1.00mL/min，线速度为25.6cm/sec，吹扫流速为3.0mL/min。运行程序为50℃保温2min，10℃～180℃加热1min。然后以6℃/min升温至300℃，保温5min。离子源温度200℃，界面温度280℃。采集方式为：Q3扫描，溶剂延迟3min，荷质比45～650m/z，根据光谱数据库NIST 17确定物质的可能结构。采用峰面积归一化法计算各组分的相对质量分数。结果如表1所示：

表1：D12发酵产物的挥发性物质及相对含量

由表1可以看出，D12发酵产物中挥发性物质主要有烷烃、烯烃、酯类、胺类、有机酸和芳香类化合物。D12发酵产物中乙氧基丙烷、1-甲氧基-2-丙醇、2.3-丁二醇、2,2-二甲氧基丙酰胺，苯乙醇，西柏烯和乙偶姻分别占总量的11.84％、9.02％、9.00％、8.66％、6.74％、4.02％和3.68％。其中2.3-丁二醇和乙偶姻是公认的的促生物质。

3.普通青霉D12与苹果连作障碍4种镰孢菌的对峙试验

与腐皮镰孢菌的对峙培养结果表明，在玉米粉培养基上普通青霉D12对其抑制率最高，达到了88.1％，对尖孢镰孢菌的抑制率为71.6％，对层出镰孢菌的抑制率达到了66.2％，拮抗系数达到Ⅱ级(图1)。普通青霉D12对腐皮镰孢菌的拮抗系数达到Ⅰ级，即将腐皮镰孢菌的菌落全部覆盖(表2)。一般的对峙试验是在PDA培养基上进行，本研究设置玉米粉培养基的对峙试验的目的是探讨一下普通青霉D12在玉米粉为营养源的培养基上能否快速生长，能否继续发挥拮抗作用，为玉米粉下一步作为普通青霉D12的菌肥载体提供参考依据。

表2：普通青霉D12对四种镰孢菌的抑制率

实施例2：罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)发酵产物的制备及成分鉴定

1.罗伊式乳杆菌发酵产物的制备

将购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号为CICC 6118的罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)活化接入改良MRS培养基中，37℃条件下培养5天，即得罗伊氏乳杆菌发酵液；罗伊氏乳杆菌发酵液混匀至无沉淀，8000r/min离心10min，即得罗伊氏乳杆菌发酵产物。

2.罗伊式乳杆菌发酵产物成分的鉴定

用GC-MS测定挥发性有机物，1L发酵产物12000r/min离心5min。上清液用1L乙酸乙酯提取3次，合并提取液3次。提取液经旋转蒸发器在37℃下浓缩至干粉。将干粉溶于2mL甲醇(色谱纯)中，过0.22μm滤膜过滤后置于进样瓶中进行GC-MS分析。GC-MS分析条件：毛细管柱为Rtx-5MS(60.0m×0.25μm×0.25mm)，进样口温度为250℃，载气为高纯氦气，流动控制方式为压力，压力为117.6KPa，总流速为14.0mL/min，柱流速为1.00mL/min，线速度为25.6cm/sec，吹扫流速为3.0mL/min。运行程序为50℃保温2min，10℃～180℃加热1min。然后以6℃/min升温至300℃，保温5min。离子源温度200℃，界面温度280℃。采集方式为：Q3扫描，溶剂延迟3min，荷质比45～650m/z，根据光谱数据库NIST 17确定物质的可能结构。采用峰面积归一化法计算各组分的相对质量分数。结果如表3所示：

表3：罗伊氏乳杆菌发酵产物的挥发性物质及相对含量

由表3可以看出，罗伊氏乳杆菌发酵产物中挥发性物质主要有酯类、醇类、有机酸和芳香类化合物。罗伊氏乳杆菌发酵产物中噻唑烷、乙醛酸乙酯分别占总量的13.18％、10.86％。

3.罗伊氏乳杆菌与苹果连作障碍相关有害菌的对峙试验

罗伊氏乳杆菌大多用于益生菌保健食品的生产，本发明采用平板对峙法将编号CICC6118的罗伊氏乳杆菌与苹果连作障碍相关有害菌(层出、腐皮、尖孢、串珠镰孢菌、立枯丝核菌、链格孢菌)进行了对峙试验，结果发现，编号CICC 6118的罗伊氏乳杆菌对有害菌具有拮抗作用(图2)。

实施例3：盆栽试验

1.试验设计：

盆栽试验于2019年1-10月在山东农业大学南校区国家苹果工程实验中心及苹果重茬与微生物实验室进行。盆栽试验所用土壤取自山东省泰安市满庄镇32年生的富士苹果园，从距离苹果树干80cm、深10～40cm的区域，多点随机取土，混匀。土壤类型为砂土，有机质含量约8.3g·kg^-1，硝态氮含量约11.76mg·kg^-1，铵态氮含量约5.76mg·kg^-1，速效钾含量约116.64mg·kg^-1，速效磷含量约10.42mg·kg^-1，土壤pH 5.66。

苹果常用砧木品种平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)。2019年1月将用水浸泡过的种子与湿润细沙混匀，于4℃左右层积40天，待种子萌动露白后在育苗盘中播种育苗。于四月中旬选取有6片真叶且长势整齐无病虫害的幼苗移栽到外径29cm、内径25cm的泥瓦盆中进行盆栽试验，每盆两株幼苗，统一进行肥水管理。

试验设四个处理：连作对照(CK)、D12发酵产物处理(R1)、罗伊氏乳杆菌发酵产物处理(R2)、D12发酵产物和罗伊氏乳杆菌发酵产物按体积比1:1混合处理(R3)；D12发酵产物由实施例1制备得到，罗伊氏乳杆菌发酵产物由实施例2制备得到。

每个处理20个重复。六月中旬按每盆80ml施入相应的发酵产物。之后进行正常的肥水管理，各个处理的肥水管理保持一致。各处理于7月23号、8月23号、9月23号取样并测定相关指标。

2.测定指标：

生物量：使用卷尺、游标卡尺、天平测量株高、地径、鲜重及干重。

根系形态：使用用专业版Win RHIZO(2007年版)根系分析系统测定根系形态。

根系呼吸速率：参照毛志泉等(2004)的方法使用Oxy-Lab氧电极自动测定系统测定根系呼吸速率。

土壤酶活性：脲酶活性测定采用比色法，过氧化氢酶测定采用滴定法，磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，蔗糖酶活性测定采用比色法(关松荫，1986)。

根酶活性和根系丙二醛含量：超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)法，酶的活性以U·min^-1·g^-1FW表示；过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法，酶的活性以U·min^-1·g^-1FW表示；过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用紫外吸收法，酶活性以U·min^-1·g^-1FW表示。丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法(赵世杰等，2002)。

土壤中可培养细菌真菌数量：细菌真菌数量的测定采用稀释平板培养计数法(程丽娟和薛泉宏，2000)。

土壤微生物测定：取9月23号样品，称取0.25g土壤样品，使用MIO-BIO Power SoilDNA Isolation Kit土壤DNA试剂盒按照试剂盒使用说明书步骤提取和纯化土壤微生物DNA。并经1.2％琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测，检测合格后进行双向测序，真菌ITS区通用引物为ITS1-F和ITS1-R进行PCR扩增，设计目标区域和带有“5’Miseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3’”的融合引物。并采用两步PCR扩增的方法构建文库。于2％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收。之后使用FTC-3000TM real-time PCR仪进行定量，将样本按照等摩尔比混匀后完成文库制备，使用Miseq测序仪将文库进行测序。由上海微基生物科技有限公司进行高通量测序。其中：

通用引物如下：

ITS1-F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；

ITS1-R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。

融合引物如下：

F：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特异引物-3'；

R：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特异引物-3'。

3.普通青霉D12和罗伊氏乳杆菌混合发酵产物对平邑甜茶幼苗促进生长作用

由表4可以看出，在施加发酵产物的三个处理中，其幼苗株高、地径、鲜重、干重趋势表现为混合发酵产物处理(R3)>普通青霉D12发酵产物处理(R1)>罗伊氏乳杆菌发酵产物处理(R2)。在三个月份中普通青霉D12发酵产物处理(R1)和发酵产物混合处理(R3)在促进平邑甜茶幼苗生长方面效果显著，其幼苗的株高、地径、鲜重、干重与连作对照的相比均有不同程度的增加且达到显著差异(图3)。

表4：不同处理对平邑甜茶生物量的影响

为了对根系进行准确分析，使用根系扫描仪分析了8月23号各个处理的根长、表面积、直径、体积、根尖数。施用菌液对幼苗根系的根长、表面积、直径、体积、根尖数有促进作用。由表5可知，与对生物量的影响趋势相一致，R1、R2、R3根系的根长、表面积、直径、体积与连作CK相比有差异显著。

表5：不同处理对平邑甜茶幼苗根系生长的影响

注：“根长”表示的是整个植株所有根的长度之和。

4.施用普通青霉D12和罗伊氏乳杆菌混合发酵产物，平邑甜茶幼苗根系胡速率呼吸速率增强，SOD、POD和CAT活性显著增加，土壤中脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性显著提高。

由图4可以看出，在八月，各处理平邑甜茶幼苗根系呼吸速率较高，七月份和九月份各处理平邑甜茶幼苗根系呼吸速率较低。在三个月份中普通青霉D12发酵产物处理(R1)、罗伊氏乳杆菌发酵产物处理(R2)和发酵产物混合处理(R3)的平邑甜茶幼苗根系呼吸速率较连作处理的相比均显著增加。普通青霉D12菌液处理(R1)的幼苗根系呼吸速率增加了9.31％、6.77％、15.96％。罗伊氏乳杆菌菌液处理(R2)的幼苗根系呼吸速率增加了9.31％、6.82％、7.98％。菌液混合处理(R3)的幼苗根系呼吸速率增加了19.20％、5.86％、17.04％。

由表6可知，从七月到九月这段时间，各个处理脲酶活性呈现出先降低后升高的趋势。各个处理磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性呈现出先升高后降低的趋势。在七月到九月这三个月，普通青霉D12发酵产物处理(R1)和混合发酵产物处理(R3)的土壤中脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性显著增加。

表6：不同处理对土壤酶活性的影响

由图5可知，从八月到九月这段时间，平邑甜茶幼苗根系超氧化物歧化酶活呈下降趋势，过氧化物酶和过氧化氢酶活性呈上升趋势，丙二醛含量呈上升趋势。施用发酵产物后，平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性均有不同程度的提高在八月份，普通青霉D12菌液处理(R1)幼苗的POD和CAT活性与连作的相比分别增加了27.07％、101.90％。罗伊氏乳杆菌菌液处理(R2)幼苗的SOD、POD和CAT活性与连作的相比分别增加了35.76％、11.38％、106.88％。菌液混合处理(R3)幼苗的SOD、POD和CAT活性与连作的相比分别增加了113.00％、49.96％、140.39％。

施用菌液后，平邑甜茶幼苗根系丙二醛含量下降，与连作对照相比达到显著差异。在八月，普通青霉D12菌液处理(R1)幼苗根系丙二醛含量与连作的相比降低了17.33％。在八月和九月菌液混合处理(R3)幼苗苗根系丙二醛含量与连作的相比分别降低了18.40％、23.40％。

5.改善连作土壤微生物群落结构，使其往有利的方向发展

由表7可知，从七月到九月这段时间，各处理可培养细菌和真菌呈现不断增加的趋势。普通青霉D12发酵产物处理(R1)、罗伊氏乳杆菌发酵产物处理(R2)和混合发酵产物处理(R3)土壤中细菌数量有不同程度的增加，真菌数量有不同程度的降低，且都与连作对照(CK)达到显著差异。

表7：不同处理土壤中细菌和真菌数量的变化

由图6中主坐标分析结果可以看出，沿PC1轴方向，对照与三个发酵产物处理明显分开。沿PC2轴方向，单一发酵产物处理(R1)和(R2)与混合发酵产物处理(3)明显分开。PCoA分析结果进一步表明，施用发酵产物对连作土壤真菌群落影响较大，并且单一发酵产物处理(R1)和(R2)与混合发酵产物处理(R3)对连作土壤真菌群落影响是不同的。

由图7中聚类分析结果可以看出，连作对照(CK)单独一个分支说明施入发酵产物后引起了微生物群落发生改变，单一发酵产物处理(R1)和(R2)与混合发酵产物处理(R3)又分别处在不同的分支，说明单一发酵产物处理(R1)和(R2)与混合发酵产物处理(R3)对连作土壤真菌群落影响是不同的，与主坐标分析结果相一致。

在属水平，各处理土壤样品中相对丰度前五的属为腐质霉属Humicola、被孢霉属Mortierella、镰孢菌属Fusarium、链格孢属Alternaria、普鲁兰久浩属Guehomyces。与对照相比，施加发酵产物后，土壤中腐质霉属Humicola、被孢霉属Mortierella的相对丰度增加，镰孢菌属Fusarium、链格孢属Alternaria的相对丰度降低(表8)。

表8：不同处理土壤真菌属水平的相对丰度

综上，在施加发酵产物的三个处理中，其幼苗株高、地径、鲜重、干重趋势表现为混合发酵产物处理(R3)>普通青霉D12发酵产物处理(R1)>罗伊氏乳杆菌发酵产物处理(R2)。并且在八月份和九月份，混合发酵产物处理(R3)幼苗的株高、鲜重和干重都与普通青霉D12发酵产物处理(R1)、罗伊氏乳杆菌发酵产物处理(R2)存在显著差异。与连作CK相比，R3根系的根长、表面积、直径、体积、根尖数显著增加，与普通青霉D12发酵产物处理(R1)、罗伊氏乳杆菌发酵产物处理(R2)幼苗相比显著增加。因此，将普通青霉D12发酵产物和罗伊氏乳杆菌发酵产物复配后得到的混合发酵产物对于减轻苹果连作障碍具有显著的协同增效作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学，山东惠美农牧发展有限公司

<120> 普通青霉和罗伊式乳杆菌混合发酵产物在减轻苹果连作障碍中的应用

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttggtcatt tagaggaagt aa 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctgcgttct tcatcgatgc 20

Claims (10)

1.普通青霉(Penicillium commune)和罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)混合发酵产物在如下(1)或(2)中的应用：

(1)减轻苹果连作障碍；

(2)制备减轻苹果连作障碍的微生物制剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述普通青霉和罗伊式乳杆菌混合发酵产物是由普通青霉发酵产物和罗伊式乳杆菌发酵产物按体积比1：1混合而成。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述普通青霉发酵产物中活菌数大于或等于2×10⁹CFU/ml；所述罗伊式乳杆菌发酵产物中活菌数大于或等于3×10⁹CFU/ml。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述普通青霉发酵产物由如下方法制备而成：

将活化后的普通青霉接种至PDA液体培养基中，25-30℃、发酵培养4-6天；将发酵液过滤，分离上清液，即制备得到普通青霉发酵产物。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述罗伊式乳杆菌发酵产物由如下方法制备而成：

将活化后的罗伊式乳杆菌接种至改良MRS培养基中，37℃条件下培养4-6天，得罗伊氏乳杆菌发酵液；将罗伊氏乳杆菌发酵液混匀至无沉淀，8000r/min离心10min，即得罗伊氏乳杆菌发酵产物。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述普通青霉(Penicillium commune)为普通青霉D12，其生物保藏号为CGMCC No.11112；所述罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的保藏编号为CICC 6118。

7.一种减轻苹果连作障碍的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂是上述普通青霉(Penicillium commune)和罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)混合发酵产物为有效成分。

8.根据权利要求7所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂是生物保藏号为CGMCC No.11112的普通青霉D12发酵产物和保藏编号为CICC 6118的罗伊式乳杆菌发酵产物按体积比1:1混合而成。

9.根据权利要求8所述的微生物制剂，其特征在于，所述普通青霉D12发酵产物中的活菌数大于或等于2×10⁹CFU/ml；所述罗伊式乳杆菌发酵产物中活菌数大于或等于3×10⁹CFU/ml。

10.一种减轻苹果连作障碍的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1-6任一项所述的普通青霉(Penicillium commune)和罗伊式乳杆菌(Lactobacillus reuteri)混合发酵产物或权利要求7-9任一项所述的微生物制剂施入苹果根际土壤。

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