CN104946567A - 一株深褐芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株深褐芽孢杆菌及其应用。本发明的深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919具有稳定、高效、广谱的抗菌性能。该菌能够产生生物膜，具有强的产嗜铁素、几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶能力，表明该菌株具有较强的生防潜力。该菌株的发酵液对培养11d的接种了番茄灰霉病菌的番茄的防效为100％(JZB120050菌株发酵液5倍稀释液处理组的防效为48％、JZB120028菌株发酵液处理组的防效为50％、JZB120028菌株发酵液5倍稀释液处理组的防效为26％、空白对照组、3％多抗霉素1000倍液处理组和50％多菌灵1000倍液处理组的防效均为0％)，说明该菌株对番茄灰霉病菌具有有效的抑制作用。该菌株对人、畜安全，没有环境污染问题，培养条件简单、容易保存，适于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一株深褐芽孢杆菌及其应用。
背景技术
由植物病原真菌引起的植物真菌病害对农业的增产增收造成了巨大威胁，长期以来，选择抗病品种和施用化学农药成为防治真菌病害的首选。农药作为农业的重要生产资料，对于食品的安全生产影响重大，化学农药是作物病害防治中最重要的植保投入品，其在病害防治方面发挥了巨大作用。但是，化学农药的长期大量使用不仅导致了药物残留引起的食品安全隐患，还对环境和生态平衡构成了巨大的压力。与化学农药相比，生物农药具有持效期长、低毒、对人畜和天敌安全等特点，其有效成分属于天然产物，环境兼容性好，有利于农业的可持续发展，是一类理想的植保替代产品。因此，研究和应用生物农药是农产品安全生产的关键环节和国际农业高技术领域竞争的焦点之一；大力发展生防产品是冲破绿色堡垒的要求，是促进农业可持续发展的要求，是人们的健康意识和环保意识不断提高的要求，也是农药产业发展的必然趋势。
芽孢杆菌(Bacillus spp.)在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力，且其生长快，营养简单。芽孢杆菌能产生耐热、抗逆的芽孢，其芽孢具有抗逆性强、利于保藏的特点，又能忍受极端的外部环境而长期存活，可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型，与化学农药混用也不会失活，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，因此有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，是一种理想的生防微生物。
由于几丁质普遍存在于真菌细胞壁，几丁质酶可以通过降解真菌细胞壁从而达到抑制或杀死病原真菌的目的。几丁质酶不仅对病原真菌细胞壁具有直接破坏作用，而且几丁质酶的产生还会与抑菌物质产生协同增效作用。同时几丁质酶的编码基因还可为转基因抗病植物或构建高效生防工程菌株提供基因资源。因此，具几丁质酶活性的生防微生物在植物病害生物防治中具有很大的开发及利用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制多种病原真菌和细菌。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株深褐芽孢杆菌。
本发明所提供的深褐芽孢杆菌是深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.10919。该菌种已于2015年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
本发明的深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919为短杆状，直或近直，菌体单个或成对排列；有芽孢，椭圆形，在菌体中部、偏端或顶端；在液体培养基中生长良好，为好氧菌；在LB固体培养基上生长迅速，培养三天后培养基逐渐变黑；菌落表面干燥不透明，边缘不整齐。
所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的生理生化特征为革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验、接触酶试验、吲哚试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验和淀粉水解试验均为阳性结果，苯丙氨酸脱氨酶试验、硫化氢产生试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、V-P试验和M-R试验均为阴性结果。
所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919能够利用糊精、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-半乳糖、N-乙酰基-D-葡萄糖、熊果苷、D-纤维二糖、D-果糖、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、3-甲基-D-乳糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、6-O-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-洛酮糖、D-核糖、水杨苷、蔗糖、D-海藻糖、D-木糖、L-苹果酸、丙酮酸甲酯、丙酮酸、L-天冬酰胺酸、2,3-丁二醇、丙三醇、腺苷、肌苷、胸苷、尿苷、5'-单磷酸胸苷、D-L-α-磷酸甘油等作为碳源；不能利用α-环糊精、淀粉、菊糖、甘露聚糖、L-树胶醛糖、D-阿拉伯糖、L-海藻糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、m-肌醇、α-D-乳糖、乳果糖、D-松三糖、D-蜜二糖、α-甲基-D-半乳糖、β-甲基-D-半乳糖、α-甲基-D-甘露糖、D-棉籽糖、L-鼠李糖、景天庚酮聚糖、D-山梨醇、水苏糖、木糖醇、醋酸、α-羟基丁酸、p-羟基苯乙酸、α-酮戊酸、乳酰胺、D-乳酸甲酯、L-乳酸、D-苹果酸、琥珀酸甲酯、丙酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、酰基-L-乳酰胺谷氨、L-丙氨酸氨、D-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、丁二胺、5'-单磷酸腺苷、5'-单磷酸尿苷、6-磷酸-D-果糖、1-磷酸-α-D-葡萄糖、6-磷酸-D-葡萄糖等作为碳源，-环糊精、苦杏仁苷、龙胆二糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-甘露醇、D-塔格糖、松二糖、γ-羟基丁酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸等作为碳源。
所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919产嗜铁素、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶，不产磷酸酯酶，尤其是具有强的产嗜铁素、几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的能力，这是生防菌的关键性生防指标。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物的下述任一种用途：
1、病原菌抑制剂，它的活性成分是所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物；
2、病害抑制剂，它的活性成分是所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物；
3、所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物在抑制病原菌中的应用；
4、所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物在制备病原菌抑制剂中的应用；
5、所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物在抑制病害中的应用；
6、所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物在制备病害抑制剂中的应用。
上述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物的任一种用途中，所述病原菌为下述至少一种：
A、植物灰霉病菌；
B、植物枯萎病菌；
C、植物赤霉病菌；
D、植物纹枯病菌；
E、植物全蚀病菌；
F、植物根腐病菌；
G、植物褐腐病菌；
H、植物炭疽病菌；
I、植物轮纹病菌；
J、植物或蘑菇细菌性病菌。
其中，所述植物灰霉病菌可为番茄灰霉病菌(如灰葡萄孢[Botrytis cinereaPer.ex Fr.])或草莓灰霉病菌(如Botrytis cinerea Persoon)；所述植物枯萎病菌可为甘蓝枯萎病菌(如尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporumSchl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen])、西瓜枯萎病菌(如Fusariumoxysporum f.sp.niveum)或棉花枯萎病菌(如尖孢镰刀菌萎蔫专化型[Fusariumoxysporum Schl.f.sp.vasinfectum(Atk)Snyder&Hansen])；所述植物根腐病菌可为豌豆镰孢根腐病菌(如茄镰孢豌豆专化型[Fusarium solani f.sp.pisi])或百合根腐病菌(如尖孢镰孢病菌[Fusarium oxysporum Schlecht.])；所述植物赤霉病菌可为小麦赤霉病菌[如禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)]；所述植物纹枯病菌可为小麦纹枯病菌(如Rhizoctonia cerealis)；所述植物全蚀病菌可为小麦全蚀病菌[Gaeumannomyces graminis(Sacc.)ArX&Olivier var.tritici J.Walker]；所述植物褐腐病菌可为桃褐腐病菌[如链核盘菌(Monilinia fructicola(wint.)Rehm)]；所述植物炭疽病菌可为葡萄炭疽病菌[如胶孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides Penz.e t Sacc.)]；所述植物轮纹病菌可为苹果轮纹病菌[如Botryosphaeria dothidea(Moug.)Ces.et de Not.]；所述植物细菌性病菌可为黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)、茄子青枯病菌(如Ralstoniasolanacearum)或大白菜黑腐病菌-野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv.campestris(Pam.)Dowson]；所述蘑菇细菌性病菌可为平菇褐斑病菌[如托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii Paine)]。
上述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物的任一种用途中，所述病害为下述至少一种：
a、植物灰霉病；
b、植物枯萎病；
c、植物赤霉病；
d、植物纹枯病；
e、植物全蚀病；
f、植物根腐病；
g、植物褐腐病；
h、植物炭疽病；
i、植物轮纹病；
j、植物或蘑菇细菌性病。
其中，所述植物灰霉病可为番茄灰霉病或草莓灰霉病；所述植物枯萎病可为甘蓝枯萎病、西瓜枯萎病或棉花枯萎病；所述植物根腐病可为豌豆根腐病或百合根腐病；所述植物赤霉病可为小麦赤霉病；所述植物纹枯病可为小麦纹枯病；所述植物全蚀病可为小麦全蚀病；所述植物褐腐病可为桃褐腐病；所述植物炭疽病可为葡萄炭疽病；所述植物轮纹病可为苹果轮纹病；所述植物细菌性病可为黄瓜角斑病、茄子青枯病或大白菜黑腐病；所述蘑菇细菌性病可为平菇褐斑病。
其中，所述番茄灰霉病可由番茄灰霉病菌-灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.exFr.)引起，所述草莓灰霉病可由草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea Persoon)引起，所述甘蓝枯萎病可由甘蓝枯萎病菌-尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporumSchl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen]引起，所述西瓜枯萎病可由西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)引起，所述棉花枯萎病可由棉花枯萎病菌-尖孢镰刀菌萎蔫专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.vasinfectum (Atk)Snyder&Hansen]引起，所述豌豆根腐病可由豌豆镰孢根腐病菌-茄镰孢豌豆专化型(Fusarium solani f.sp.pisi)引起，所述百合根腐病可由百合根腐病菌-尖孢镰孢病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.)引起，所述小麦赤霉病可由小麦赤霉病菌-禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)引起，所述小麦纹枯病可由小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)引起，所述小麦全蚀病可由小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis(Sacc.)ArX&Olivier var.tritici J.Walker)引起，所述桃褐腐病可由桃褐腐病菌-链核盘菌(Monilinia fructicola(wint.)Rehm)引起，所述葡萄炭疽病可由葡萄炭疽病菌-胶孢炭疽菌[Colletortrichum gloeosporioidesPenz.e t Sacc.)引起，所述苹果轮纹病可由苹果轮纹病菌[Botryosphaeriadothidea(Moug.)Ces.et de Not.]引起，所述黄瓜角斑病可由黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)引起，所述茄子青枯病可由茄子青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起，所述大白菜黑腐病可由大白菜黑腐病菌-野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris(Pam.)Dowson]引起，所述平菇褐斑病可由平菇褐斑病菌-托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasiiPaine)引起。
上述病原菌抑制剂和上述病害抑制剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述病原菌抑制剂和所述病害抑制剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述病原菌抑制剂和所述病害抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，上述病原菌抑制剂和上述病害抑制剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
为解决上述技术问题，本发明还提供了培养所述深褐芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的方法。
本发明所提供的培养所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCCNo.10919的方法，包括将所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCCNo.10919在用于培养深褐芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物可从所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的发酵液中获得。所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述深褐芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919，除去液体培养物(发酵液)中的所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919即得到所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的代谢物。
上述液体培养基可为发酵培养基。
所述培养温度可为26-30℃，具体可为30℃；所述培养时间可为12-72h，具体可为18、24、48、60或72h。
为解决上述技术问题，本发明还提供了制备所述病原菌抑制剂或所述病害抑制剂的方法。
本发明所提供的制备所述病原菌抑制剂或所述病害抑制剂的方法，包括将所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919或深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCC No.10919的代谢物作为活性成分，得到所述病原菌抑制剂或所述病害抑制剂的步骤。
制备所述病原菌抑制剂或所述病害抑制剂的方法，可包括在液体培养基中培养所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCC No.10919，收集发酵液，得到所述病原菌抑制剂或所述病害抑制剂的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供的下述1)-5)中任一种应用：
1)所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCC No.10919在生产嗜铁素中的应用；
2)所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCC No.10919在生产几丁质酶中的应用；
3)所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCC No.10919在生产纤维素酶中的应用；
4)所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCC No.10919在生产淀粉酶中的应用；
5)所述深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCC No.10919在生产蛋白酶中的应用。
实验证明，本发明的深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCCNo.10919具有稳定、高效、广谱的抗菌性能，对植物病原真菌番茄/草莓灰霉病菌、甘蓝/西瓜/棉花枯萎病菌、豌豆镰孢根腐病菌、尖孢镰孢病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、小麦全蚀病菌、桃褐腐病菌、葡萄炭疽病菌和苹果轮纹病菌等13种病原真菌的抑菌带宽均在0.8-2.40cm之间，具有较强的抑制真菌的效果；对平菇褐斑病菌和黄瓜角斑病菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径分别为5.0cm和4.0cm；对茄子青枯病菌的抑制作用较弱，抑菌圈直径为3.8cm。该菌能够产生生物膜，具有强的产嗜铁素、几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的能力，该菌产生几丁质酶的酶活性为7.8U/mL发酵液(30-60％硫酸铵沉淀)，这些是生防菌的关键性生防指标，表明该菌株具有生防潜力，值得深入研究并值得开发成生防制剂。本发明的深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的发酵液对培养11d的接种了番茄灰霉病菌的番茄的防效为100％(JZB120050菌株发酵液5倍稀释液处理组的防效为48％、JZB120028菌株发酵液处理组的防效为50％、JZB120028菌株发酵液5倍稀释液处理组的防效为26％、空白对照组、3％多抗霉素1000倍液处理组和50％多菌灵1000倍液处理组的防效均为0％)，说明该菌株对番茄灰霉病菌具有有效的抑制作用。深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919对人、畜安全，没有环境污染问题，培养条件简单、容易保存，适于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
保藏说明
菌种名称：深褐芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus atrophaeus
菌株编号：JZB120050
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年05月27日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10919
附图说明
图1为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的菌落及菌体形态。其中，图A为在LB培养基上菌落形态；图B为在PDA培养基上菌落形态；图C为菌体形态(革兰氏染色，10×100油镜下显微观察)；图D为芽孢形态(芽孢染色，10×100油镜下显微观察)。
图2为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的16SrDNA序列的PCR扩增产物和16S-23S rDNA之间的ITS序列PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。其中，泳道M代表D2000Marker；泳道1为16S rDNA序列的PCR扩增产物；泳道2为16S-23S rDNA之间的ITS序列PCR扩增产物。
图3为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的抑菌谱。其中A为甘蓝枯萎病菌-尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen]；B为西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.niveum)；C为棉花枯萎病菌-尖孢镰刀菌萎蔫专化型[Fusariumoxysporum Schl.f.sp.vasinfectum(Atk)Snyder&Hansen]；D为豌豆镰孢根腐病菌-茄镰孢豌豆专化型(Fusarium solani f.sp.pisi)；E为百合根腐病菌-尖孢镰孢病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.)；F为小麦赤霉病菌-禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum Schwabe)；G为小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)；H为小麦全蚀病菌[Gaeumannomyces graminis(Sacc.)ArX&Ol ivier var.tritici J.Walker]；I为番茄灰霉病菌-灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)；J为草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea Persoon)；K为桃褐腐病菌-链核盘菌[Monilinia fructicola(wint.)Rehm]；L为苹果轮纹病菌(Botryosphaeriadothidea(Moug.)Ces.et de Not.)；M为葡萄炭疽病菌-胶孢炭疽菌(Colletortrichum gloeosporioides Penz.e t Sacc.)；N为黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)；O为平菇褐斑病菌——托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii Paine)；P为茄子青枯病菌(Ralstonia solanacearum)；Q为大白菜黑腐病菌-野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestrispv.campestris(Pam.)Dowson]。
图4为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919生物膜形成能力的检测结果。
图5为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的生防指标检测结果。其中，A为嗜铁素检测；B为纤维素酶检测；C为几丁质酶检测；D为蛋白质酶检测。
图6为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919发酵液对番茄灰霉病的防效测定结果。其中，A为第7d调查；B为第11d调查；其中，A和B的从左至右横排的5个番茄果实依次是JZB120050菌株发酵液处理组，JZB120050菌株发酵液5倍稀释液处理组，3％多抗霉素1000倍液处理组，50％多菌灵1000倍液处理组和空白对照组的果实。
图7为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的几丁质酶活性检测。其中，左图为空白对照，右图为加2％(质量百分含量)几丁质粉的LB液体培养基培养的JZB120050菌株的几丁质酶活性检测；左图中0-30％代表不加几丁质粉经0-30％硫酸铵沉淀，0-60％代表不加几丁质粉经30％-60％硫酸铵沉淀，0-80％代表不加几丁质粉经60％-80％硫酸铵沉淀；右图中2-30％代表加几丁质粉经0-30％硫酸铵沉淀，2-60％代表加几丁质粉经30％-60％硫酸铵沉淀，2-80％代表加几丁质粉经60％-80％硫酸铵沉淀。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的病原菌公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验：
番茄灰霉病菌-灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)(李兴红等.北京地区番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测.植物保护.2012.38(4)：141-143)；
草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea Persoon)(朱宝成等.草莓灰霉病菌的培养、毒素提取及生物测定.植物病理学报.1994,24(3)：239-243)；
甘蓝枯萎病菌-尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen](李明远等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定.植物保护.2003，29(3)：44-45)；
西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)(耿丽华等.西瓜枯萎病菌生理小种鉴定技术体系的建立和验证.中国蔬菜.2010(20)：52-56)；
棉花枯萎病菌-尖孢镰刀菌萎蔫专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.vasinfectum(Atk)Snyder&Hansen](李明桃.棉花枯萎病的研究.农业灾害研究.2012,2(04)：1-3,16)；
豌豆镰孢根腐病菌-茄镰孢豌豆专化型(Fusarium solani f.sp.pisi)(向妮等.豌豆镰孢根腐病菌的鉴定及其致病基因多样性.中国农业科学.2012，45(14)：2838-2847)；
百合根腐病菌-尖孢镰孢病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.)(安智慧等.百合根腐病病原鉴定及防治方法.中国蔬菜.2010(3)：23-24)；
小麦赤霉病菌-禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)(Rubella S.Goswami&H.Corby Kistler.Heading for disaster:Fusarium graminearum oncereal crops.Molecular Plant Pathology.2004,5(6):515-525)；
小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)(纪兆林等.小麦纹枯病菌毒素对小麦植株的作用.扬州大学学报(农业与生命科学版).2011,32(3)：55-59)；
小麦全蚀病菌[Gaeumannomyces graminis(Sacc.)ArX&Olivier var.tritici J.Walker](刘卫国.药剂处理对小麦全蚀病防效及其产量因素的影响.湖北农业科学.2012,51(16)：3483-3484,3487)；
桃褐腐病菌-链核盘菌[Monilinia fructicola(wint.)Rehm](王菲等.桃褐腐病的发生与防治.果树花卉.2012，05：58-59)；
葡萄炭疽病菌-胶孢炭疽菌(Colletortrichum gloeosporioides Penz.e tSacc.)(李利霞等.葡萄炭疽病菌S R AP遗传多样性分析.中国农学通报.2012，28(12)：230-235)；
苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea(Moug.)Ces.et de Not.)(张宏霞等.苹果轮纹病的发生规律及防治技术初探.安徽农学通报.2011,17(20)：78-79)；
平菇褐斑病菌——托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii Paine)(金丹等.一种平菇褐斑病病原菌的鉴定.食用菌学报.200916(1)：89-91)；
黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)(A.T.Alleyne，K.Rowe，M.James.Identification of Pseudomonas syringae pv.lachrymans inBarbados by rep-PCR.Journal of Agricultural Science and Technology B1.2011：593-597)；
茄子青枯病菌(Ralstonia solanacearum)(封林林等.茄子青枯病抗性材料的鉴定及性状观察.长江蔬菜.2000，10：35-37)；
大白菜黑腐病菌-野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestrispv.campestris(Pam.)Dowson](翟文慧等.大白菜黑腐病鉴定的湿度试验及其苗期与成株期抗病性的相关分析.中国蔬菜.2010(10)：59-63)。
下述实施例中相关培养基的配置：
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL。
LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g,用蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0-7.2。
LB固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g,琼脂15g，用蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0-7.2。
KB固体培养基：蛋白胨20g，MgSO4·7H2O 1.5g，K2HPO41.5g，甘油10mL，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL，pH 6.8，121℃灭菌30min。
CM0002培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，MnSO4·H2O 5mg，蒸馏水1000mL，调pH至7.0，121℃湿热灭菌20min。
CM培养液的配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，用蒸馏水定容至1000mL，pH7.4，121℃湿热灭菌20min。
种子培养基/发酵培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏3g，MnSO4·H2O5mg，用蒸馏水定容至1000mL，pH 7.2-7.4。
实施例1、深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的分离及鉴定
一、深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的分离
对采自内蒙古的50份土壤样品进行如下操作：取土壤样品1g，再加入9mL无菌水，振荡15min，使其充分溶解，混匀后在沸水浴中高温水浴处理10min，期间振荡2-3次。震荡结束后吸取1mL原液加入装有9mL无菌水的试管中，得到10﹣1倍的稀释液，然后进行逐级稀释，分别得到稀释倍数为10﹣2-10﹣6的稀释液；分别吸取100μL不同稀释倍数的稀释液至CM0002培养基平板上，用涂布棒涂匀，做好标记，每个梯度重复3次；再将涂好的平板倒置放于37℃恒温箱中过夜培养。培养结束后挑选菌落特征不同的单菌落，划线纯化培养在CM0002培养基平板上，并编号，倒置放于37℃恒温箱中过夜培养，再保存(刘国红，芽孢杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变研究，福建农林大学，2009)。
结果表明，从采自内蒙古的50份土壤样品中共分离得到207株细菌，经对甘蓝枯萎病菌、西瓜枯萎病菌及番茄灰霉病菌等植物病原真菌的生物活性初筛和复筛，从中得到一株抑菌活性高的菌株，编号为JZB120050，即为本申请的深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919(简称为JZB120050菌株)。
二、深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的鉴定
1、形态学鉴定
深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的形态学特征如下：菌体短杆状，直或近直，菌体单个或成对排列；有芽孢，椭圆形，在菌体中部、偏端或顶端；在液体培养基中生长良好，为好氧菌；在LB固体培养基上生长迅速，培养三天后培养基逐渐变黑；菌落表面干燥不透明，边缘不整齐(图1)。
2、生理生化测定
生理生化测定结果显示：深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCCNo.10919是革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验、接触酶试验、吲哚试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验和淀粉水解试验均为阳性结果，苯丙氨酸脱氨酶试验、硫化氢产生试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、V-P试验和M-R试验均为阴性结果。
3、碳源利用鉴定
采用美国Biolog微生物自动分析系统，以水为空白孔对照，对95种不同碳源进行了分析，结果表明，深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919能够利用如下碳源：糊精、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-半乳糖、N-乙酰基-D-葡萄糖、熊果苷、D-纤维二糖、D-果糖、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、3-甲基-D-乳糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、6-O-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-洛酮糖、D-核糖、水杨苷、蔗糖、D-海藻糖、D-木糖、L-苹果酸、丙酮酸甲酯、丙酮酸、L-天冬酰胺酸、2,3-丁二醇、丙三醇、腺苷、肌苷、胸苷、尿苷、5'-单磷酸胸苷和D-L-α-磷酸甘油等碳源。
不能够利用如下碳源：α-环糊精、淀粉、菊糖、甘露聚糖、L-树胶醛糖、D-阿拉伯糖、L-海藻糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、m-肌醇、α-D-乳糖、乳果糖、D-松三糖、D-蜜二糖、α-甲基-D-半乳糖、β-甲基-D-半乳糖、α-甲基-D-甘露糖、D-棉籽糖、L-鼠李糖、景天庚酮聚糖、D-山梨醇、水苏糖、木糖醇、醋酸、α-羟基丁酸、p-羟基苯乙酸、α-酮戊酸、乳酰胺、D-乳酸甲酯、L-乳酸、D-苹果酸、琥珀酸甲酯、丙酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、酰基-L-乳酰胺谷氨、L-丙氨酸氨、D-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、丁二胺、5'-单磷酸腺苷、5'-单磷酸尿苷、6-磷酸-D-果糖、1-磷酸-α-D-葡萄糖、6-磷酸-D-葡萄糖等碳源。
可疑利用如下碳源：、苦杏仁苷、龙胆二糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-甘露醇、D-塔格糖、松二糖、γ-羟基丁酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸等碳源。
4、分子鉴定
采用常规方法提取深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCCNo.10919的基因组DNA进行16S rDNA序列的PCR扩增及分析，选择通用引物27F(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGGATACCTTGTTACGACTT-3')，以提取的基因组DNA作为模板，PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，30个循环；72℃补充延伸10min，4℃保存。
采用常规方法提取深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCCNo.10919的基因组DNA进行16S-23S rDNA之间的ITS序列PCR扩增及分析(刘国红，芽孢杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变研究，福建农林大学，2009)，采用引物ITS-F(5'-TCGCTAGTAATCGCGGATCAGC-3')和ITS-R(5'-GCATATCGGTGTTAGTCCCGTCC-3')，以提取的基因组DNA作为模板，PCR扩增条件为95℃预变性45s；94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃补充延伸10min，4℃保存。
16S rDNA序列的PCR扩增和16S-23S rDNA之间的ITS序列PCR扩增的体系均为25μL扩增体系，包含：10pmoL引物各1μL，超纯dNTP Mixture 1μL，2.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)0.5μL，10×PCR Buffer(TaKaRa)2.5μL，基因组DNA模板1μL，ddH2O 18μL。
PCR扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳分析，检测到目标条带后，PCR产物直接送至公司测序，利用DNAMAN version 5.2.2和GenBank上的BLAST比对及分析序列，利用CLUSTALX 1.83和Mega 5.0软件构建系统发育树。
结果表明，16S rDNA序列的PCR扩增得到1451bp的片段(图2)，其序列如SEQ IDNo.1所示，与Bacillus atrophaeus strain NMB28(Genbank登录号KF056326)的同源性是100％，16S-23S rDNA之间的ITS序列的PCR扩增得到628bp的片段(图2)，其序列如SEQ ID No.2所示，与Bacillus atrophaeus strain NMB28(Genbank登录号是KF056327)的序列同源性是100％，结合形态特征、生理生化特性、Biolog碳源分析和分子序列鉴定结果，将该菌株鉴定为深褐芽孢杆菌(B.atrophaeus)。深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的16S rDNA序列如SEQID No.1所示，核苷酸序列长度为1451bp；16S-23S rDNA之间的ITS序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸序列长度为628bp。
深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919已于2015年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.10919。
实施例2、深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919的抑菌谱的测定
供试病原菌：
番茄灰霉病菌-灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)；
草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea Persoon)；
甘蓝枯萎病菌-尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen]；
西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)；
棉花枯萎病菌-尖孢镰刀菌萎蔫专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.vasinfectum(Atk)Snyder&Hansen]；
豌豆镰孢根腐病菌-茄镰孢豌豆专化型(Fusarium solani f.sp.pisi)；
百合根腐病菌-尖孢镰孢病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.)；
小麦赤霉病菌-禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)；
小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)；
小麦全蚀病菌[Gaeumannomyces graminis(Sacc.)ArX&Ol ivier var.tritici J.Walker]；
桃褐腐病菌-链核盘菌[Monilinia fructicola(wint.)Rehm]；
葡萄炭疽病菌-胶孢炭疽菌(Colletortrichum gloeosporioides Penz.e tSacc.)；
苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea(Moug.)Ces.et de Not.)；
平菇褐斑病菌——托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii Paine)；
黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)；
茄子青枯病菌(Ralstonia solanacearum)；
大白菜黑腐病菌-野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestrispv.campestris(Pam.)Dowson]。
以上植物病原真菌和细菌是由中国农业大学植物病理学系和北京市农林科学院植物保护环境保护研究所提供。
选择农业生产上常见的植物病原真菌番茄/草莓灰霉病菌、甘蓝/西瓜/棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、豌豆镰孢根腐病菌、尖孢镰孢病菌、桃褐腐病菌、葡萄炭疽病菌和苹果轮纹病菌等为指示真菌，采用平板对峙培养法进行植物病原真菌抑菌实验。具体操作如下：将深褐芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919(以下简称JZB120050菌株)在LB固体培养基上28℃恒温培养48h。植物病原真菌在PDA平板上25℃-28℃恒温培养3-4天，自菌落边缘用直径0.7cm的无菌不锈钢打孔器打制带病原菌琼脂片；用无菌接种针挑取病原菌菌片，菌丝面朝下接种于PDA平板中心处，同时在距病原真菌菌片两侧均约3.00cm处用无菌接种环划线JZB120050菌株，以仅接病原菌的平板为对照，每个处理三次重复，25℃-28℃恒温培养5-7天，测量病原真菌边缘与JZB120050菌株的菌落带宽中心之间的抑菌带宽度。
选择黄瓜角斑病菌、茄子青枯病菌、大白菜黑腐病菌和平菇褐斑病菌等植物病原细菌为指示细菌，采用双层培养法进行植物病原细菌抑菌实验。具体操作如下：将活化的JZB120050菌株点种在KB培养基平板的中心处，28℃培养40h，用3mL氯仿以其蒸汽杀死JZB120050菌株，静置10-12h，以便氯仿蒸气挥发完全。将活化好的靶标病原细菌制备成108cfu/mL菌悬液。吸取100μL菌悬液加入3mL融化后冷却至50℃的1％水琼脂中，迅速混匀，立即倒入氯仿已杀死JZB120050菌株的平板上，铺成均匀的薄层，28℃培养36h，观察抑菌效果并用十字交叉法测量抑菌圈直径。
结果表明，当培养4-5天时，仅接各种病原真菌的平板上菌丝近乎长满整个平板时，JZB120050菌株对所选择的13种植物病原真菌的抑菌带宽均在0.8-2.4cm之间，具有较强的抑制真菌的效果。JZB120050菌株对所选择的植物病原细菌中，对平菇褐斑病菌和黄瓜角斑病菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径分别为5.0cm和4.0cm；对茄子青枯病菌的抑制作用较弱，抑菌圈直径为3.8cm，对大白菜黑腐病菌无明显抑菌活性，具体见表1和图3。多次重复该试验均得到同样的稳定抑菌效果，因此表明JZB120050菌株具有稳定、高效、广谱的抗菌性能。
表1、JZB120050菌株的抑菌谱测定结果
注：抑菌带宽≤0.8cm记为+，0.8-1cm之间记为++，1-2cm之间记为+++，≧2cm记为++++；“/”表示未测该项内容；“--”表示未有明显抑菌效果；表中数据为3次重复数值的平均值。
以本发明人之前从内蒙古土壤样品中分离的对灰葡萄孢菌(Botrytis cinereaPer.ex Fr.)和尖孢镰孢病菌(F.oxysporum Schlecht.)具有抗菌活性的深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120028(简称JZB120028菌株)作为对照菌株，和本申请的JZB120050菌株，按照上述植物病原真菌抑菌实验方法分别以灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)和尖孢镰孢病菌(F.oxysporum Schlecht.)为病原菌同时进行植物病原真菌抑菌实验，实验设三次重复，每次重复每个处理设三个平板。结果表明JZB120028菌株对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)的抑菌带宽度为1.80cm，JZB120050菌株对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)的抑菌带宽度为2.40cm，JZB120028菌株对尖孢镰孢病菌(F.oxysporum Schlecht.)的抑菌带宽度为1.50cm，JZB120050菌株对尖孢镰孢病菌(F.oxysporum Schlecht.)的抑菌带宽度为1.90cm,JZB120050菌株对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)的抑菌能力是JZB120028菌株1.33倍，JZB120050菌株对尖孢镰孢病菌(F.oxysporumSchlecht.)的抑菌能力是JZB120028菌株1.27倍。
实施例3、深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919生防相关功能检测
一、生物膜形成能力测定
1、菌种培养：采用聚丙烯管微孔板培养法，取一环活化培养16-18h的JZB120050菌株种子液接种于5mL LB培养液中，30℃振荡培养过夜，获得JZB120050菌株的菌液。取10μL JZB120050菌株的菌液接种于盛有0.5mL CM培养液的聚丙烯管中，30℃静止培养12-24h。
2、生物膜检测：采用结晶紫染色法，培养终止后倒掉培养液，用去离子水清洗，贴壁细胞用1％结晶紫染色2min，水洗，观察生物膜的形成，按下述分级标准进行统计：0级：未形成生物膜，染色后未发现紫色环带；1级：初步形成了生物膜，染色后依稀可见紫色环带；2级：形成了较明显的生物膜，染色后可见紫色环带；3级：形成较明显生物膜，染色后较清晰的紫色环带；4级：形成明显生物膜，结晶紫染色后可见非常清晰的紫色环带。
结果表明，JZB120050菌株有较强的生物膜形成能力，属于4级(图4)。形成生物膜是细菌适应自然环境的主要方式之一，生物膜可以增强机体免疫吞噬作用，保护菌体免受不利环境条件的侵袭，有利于其在环境中的定殖，在生防菌的抗病机制中起着重要作用。从这个角度分析，表明JZB120050菌株具有较强的生防潜力。
二、生防相关指标检测
1、嗜铁素的检测嗜铁素检测用培养基(CAS培养基)(Schwyn B.and Nei landsJ.B.Universal chemical assay for the detection and determination ofsiderophores[J].Analytical Biochemistry,1987,160:47-56)：由4种溶液组成(溶液1-3及casamimo acid)，4种溶液混合前单独灭菌。
溶液1(CAS/HDTMA)：①CAS溶液：60.5mg CAS(铬天青)溶解在50mL水中；②铁溶液：1mM FeCl3·6H2O溶解于浓度为10mM的HCl水溶液中,pH为2.0；③HDTMA溶液：72.9mg溴化十六碳烷基三甲氨溶解于40mL水中。把溶液①与10mL溶液②混合后加入溶液③中并搅拌均匀，把得到的蓝黑色液体灭菌，该液体即CAS/HDTMA溶液。
溶液2(Salts/Buffer溶液)：①Salts溶液(750mL)：KH2PO40.3g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0g，溶解在750mL去离子水中；②PIPES：哌嗪-1,4-二乙磺酸30.24g，溶解于①Salts溶液中，以50％(W/V)的KOH溶液调节pH至6.8，加入15.0g琼脂定容至800mL，高压灭菌冷却至50℃，即得到Salts/Buffer溶液。
溶液3(750mL)：葡萄糖2g，甘露醇2g，MgSO4·7H2O 493mg，CaCl211mg，H3BO31.4mg，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·2H2O 1.17mg，Na2MoO4·2H2O 1mg，CuSO440μg，溶解在750mL去离子水中，高压灭菌。
溶液3冷却至50℃后加入溶液2与30mL过滤除菌的10％(W/V)casamimo acid混合，再加入溶液1，缓慢搅拌(避免产生泡沫)，铺平板，该平板即为嗜铁素检测平板。将活化好的JZB120050菌株接种于嗜铁素检测平板上,28℃培养24、48、60、72h观察菌落外围是否产生黄色晕圈。由于嗜铁素竞争培养基中EDTA螯合的铁离子，使培养基由蓝色变成黄色，因此菌落周围黄色晕圈出现表明嗜铁素的产生。
2、几丁质酶的检测检测用胶态几丁质培养基(陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京：中国农业出版社.1995，494)：胶体几丁质2.5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH为7.0。将活化好的JZB120050菌株接种于胶态几丁质培养基平板上，28℃培养24、48、60、72h后观察菌落外围透明圈的产生，出现透明圈表明几丁质酶的产生。
3、蛋白酶的检测检测用脱脂牛奶琼脂培养基：脱脂奶粉20g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL。将活化好的JZB120050菌株接种于脱脂牛奶琼脂培养基平板上，28℃培养24、48、60、72h后观察菌落外围透明圈的产生，出现透明圈表明蛋白酶的产生。
4、纤维素酶的检测检测用纤维素刚果红培养基(Teather R.N.and Wood P.J.Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration andcharacterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen[J].Appliedand Environment Microbiology,1982,43:777-780)：MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO40.5g，纤维素1.88g，刚果红0.2g，琼脂14.0g，明胶2.0g，蒸馏水1000mL，pH为7.0。将活化好的JZB120050菌株接种到纤维素刚果红培养基平板上，于28℃培养48、60、72h观察菌落周围红色水解圈的产生，出现红色水解圈表明纤维素酶产生。
5、磷酸酯酶的检测检测用Pikovskaya’s琼脂培养基(Pikovskaya R.I.Mobilization of phosphorus in soil in connection with vital activity of somemicrobial species[J].Mikrobiologiya,1948,17:363-370)：酵母提取物0.5g，葡萄糖10.0g，Ca3(PO4)25.0g，(NH4)2SO40.5g，KCl 0.2g，MgCl20.1g，MnSO4·H2O0.1mg，FeSO40.1m g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。将活化好的JZB120050菌株接种到Pikovskaya’s琼脂培养基平板上，于28℃培养48、60、72h后观察菌落周围透明圈的产生，出现透明圈表明磷酸酯酶的产生。
结果表明，JZB120050菌株能够产嗜铁素、几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶(图5)，不能够产磷酸酯酶，尤其是具有强的产嗜铁素、几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的能力，这是生防菌的关键性生防指标，表明JZB120050菌株具有生防潜力，值得深入研究并值得开发成生防制剂。
实施例4、深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919对番茄灰霉病的离体检测
以本发明人之前从内蒙古土壤样品中分离的对灰葡萄孢菌(Botrytis cinereaPer.ex Fr.)和尖孢镰孢病菌(F.oxysporum Schlecht.)具有抗菌活性的深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120028(简称JZB120028菌株)作为对照菌株，和本申请的JZB120050菌株进行以下实验。
一、生防菌株发酵液的制备
将JZB120050菌株在LB固体培养基划线培养24h后，接种一环到种子培养基(500mL三角瓶50mL装量)中，30℃、180rpm摇培18h后，以3％接种量接种到发酵培养基(500mL三角瓶100mL装量)中，30℃、180rpm摇培48h，即得到JZB120050菌株的发酵液(三角瓶内的所有培养物)。该发酵液中，JZB120050菌株的菌体和芽孢总数为3.5×109cfu/mL。
将上述JZB120050菌株替换为JZB120028菌株，按照上述实验方法得到JZB120028菌株的发酵液。JZB120028菌株的发酵液中，JZB120028菌株的菌体和芽孢总数为3.0×109cfu/mL。
二、JZB120050菌株对番茄灰霉病的离体检测
挑选成熟度、物理状态尽量一致的新鲜番茄果实，先用无菌接种针在每个番茄果实腰周围等距离刺4个约4mm(深)×3mm(宽)的伤口，待伤口晾干后，在番茄果实上的四个伤口处接种10μL的步骤一制备的JZB120050菌株发酵液，待发酵液被完全吸收后，在处理处均接种10μL浓度为106个孢子/mL的番茄灰霉病菌(灰葡萄孢)孢子悬浮液，获得JZB120050菌株发酵液处理组。除将JZB120050菌株发酵液分别替换为JZB120050菌株发酵液5倍稀释液(将JZB120050菌株发酵液用4倍体积的无菌水稀释)、50％多菌灵可湿性粉剂(江阴市农药二厂有限公司)1000倍液、3％多抗霉素可湿性粉剂(潍坊天达植保有限公司)1000倍液及清水外，其它操作均相同，分别获得JZB120050菌株发酵液5倍稀释液处理组、50％多菌灵可湿性粉剂1000倍液处理的化学农药对照组(简称50％多菌灵1000倍液处理组)、3％多抗霉素可湿性粉剂1000倍液处理的生物农药对照组(简称3％多抗霉素1000倍液处理组)和清水处理的空白对照组。将JZB120050菌株发酵液分别替换为步骤一的JZB120028菌株发酵液和JZB120028菌株发酵液5倍稀释液(将JZB120028菌株发酵液用4倍体积的无菌水稀释)外，其它操作均相同，分别获得JZB120028菌株发酵液处理组和JZB120028菌株发酵液5倍稀释液处理组。实验重复三次，每次重复每组处理选择五个番茄果实。将处理过的番茄果实均放置在20℃-22℃，昼夜光照湿度为90％以上的条件下保湿培养，每天观察病情发生情况，用带有1mm2小格的标尺测量病斑的面积，用病斑的面积计算对番茄灰霉病的防效。计算公式如下：防效＝(C-T/C)×100％，其中C为空白对照组病斑的平均面积，T为各处理的病斑平均面积。采用SPSS11.5进行数据统计，用Duncan’s新复极差多重比较法进行显著差异性分析(P＜0.05)。
结果表明，JZB120050菌株发酵液处理组、JZB120050菌株发酵液5倍稀释液处理组、JZB120028菌株发酵液处理组、JZB120028菌株发酵液5倍稀释液处理组中番茄果实中番茄灰霉病病斑的扩展被明显的抑制，病斑面积和发病率均显著低于其它各个对照处理组(图6和表2)。其中，在接种后的第7d调查时：JZB120050菌株发酵液处理组和JZB120050菌株发酵液5倍稀释液处理组的番茄果实均未出现病斑，对番茄灰霉病菌的防效均为100％；JZB120028菌株发酵液处理组开始出现病斑，但未出现可见的番茄灰霉病菌霉层，JZB120028菌株发酵液5倍稀释液处理组的番茄果实出现灰番茄霉病斑和番茄灰霉病菌的霉层，JZB120028菌株发酵液处理组对番茄灰霉病菌的防效为85％，JZB120028菌株发酵液5倍稀释液处理组对番茄灰霉病菌的防效为60％；而空白对照组(防效为20％)、3％多抗霉素1000倍液处理组(防效为25％)和50％多菌灵1000倍液处理组(防效为21％)的三个处理在每个番茄的4个接种处均出现明显的病斑和番茄灰霉病菌的霉层。在接种后的第11d调查时：JZB120050菌株发酵液处理组的所有番茄果实仍未出现任何病斑，每个番茄上的接种处已经完全皱缩为一个干的小孔，对番茄灰霉病菌的防效为100％；JZB120050菌株发酵液5倍稀释液处理组出现明显的番茄灰霉病斑和番茄灰霉病菌的霉层，对番茄灰霉病菌的防效为48％；JZB120028菌株发酵液处理组出现明显的番茄灰霉病斑和番茄灰霉病菌的霉层，对番茄灰霉病菌的防效为50％；JZB120028菌株发酵液5倍稀释液处理组出现明显的番茄灰霉病斑和番茄灰霉病菌的霉层，对番茄灰霉病菌的防效为26％；空白对照组、3％多抗霉素1000倍液处理组和50％多菌灵1000倍液处理组的番茄果实已经完全被浓密灰色的番茄灰霉病菌霉层覆盖。由此结果可以看出，JZB120050菌株对番茄灰霉病菌的发生和蔓延起到了有效的控制作用，并且JZB120050菌株对番茄灰霉病菌的发生和蔓延效果显著高于JZB120028菌株。
表2、不同处理在番茄果实上对番茄灰霉病菌的离体防效测定结果
注：表中数据为三次重复的平均值，相同字母表示差异不显著(P＜0.05)。
实施例5、深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No.10919产几丁质酶活性的检测
用加2％(质量百分含量)几丁质粉的LB液体培养基培养JZB120050菌株，在30℃条件下180rpm震荡培养3-6d获得JZB120050菌株发酵液，离心收集上清液；对同一批发酵上清液等量分成多份，分别进行硫酸铵分级沉淀，将收集的0-30％硫酸铵沉淀、30％-60％硫酸铵沉淀和60％-80％硫酸铵沉淀分别用0.05M磷酸缓冲液(PB)溶解后进行透析和冷冻干燥，分别获得JZB120050菌株的0-30％硫酸铵沉淀物、30％-60％硫酸铵沉淀物和60％-80％硫酸铵沉淀物，并采用PB对上述硫酸铵沉淀物分别溶解成终浓度均为50mg/mL的溶液，采用几丁质酶检测平板(胶态几丁质培养基平板)分别对上述三种硫酸铵沉淀物溶解液进行几丁质酶活性检测。
除将加2％(质量百分含量)几丁质粉的LB液体培养基替换为不加几丁质粉的LB液体培养基外，其它操作均不变，获得空白对照。结果表明(图7)，JZB120050菌株的30％-60％硫酸铵沉淀物和60％-80％硫酸铵沉淀物中几丁质酶的活比较大，几丁质酶检测平板上出现了明显的透明圈。同时利用DNS(3，5—二硝基水杨酸法)检测30％-60％硫酸铵沉淀物和60％-80％硫酸铵沉淀物中的几丁质酶的酶活，分别为7.8U/mL发酵液和4.36U/mL发酵液。另外，可以加2％几丁质粉的方式诱导该菌更大量的分泌几丁质酶，从而更好地抑制靶标病原菌的生长。
Claims (10)
1.深褐芽孢杆菌，其特征在于：所述深褐芽孢杆菌的菌株号为JZB120050，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.10919。
2.病原菌抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的深褐芽孢杆菌和/或权利要求1所述的深褐芽孢杆菌的代谢物。
3.根据权利要求2所述的病原菌抑制剂，其特征在于：所述病原菌抑制剂对下述至少一种病原菌具有抑制作用：
A、植物灰霉病菌；
B、植物枯萎病菌；
C、植物赤霉病菌；
D、植物纹枯病菌；
E、植物全蚀病菌；
F、植物根腐病菌；
G、植物褐腐病菌；
H、植物炭疽病菌；
I、植物轮纹病菌；
J、植物或蘑菇细菌性病菌。
4.病害抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的深褐芽孢杆菌和/或权利要求1所述的深褐芽孢杆菌的代谢物。
5.根据权利要求4所述的病害抑制剂，其特征在于：所述病害为下述至少一种：
a、植物灰霉病；
b、植物枯萎病；
c、植物赤霉病；
d、植物纹枯病；
e、植物全蚀病；
f、植物根腐病；
g、植物褐腐病；
h、植物炭疽病；
i、植物轮纹病；
j、植物或蘑菇细菌性病。
6.培养权利要求1所述深褐芽孢杆菌的方法，包括将所述深褐芽孢杆菌在用于培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
7.制备权利要求2或3所述病原菌抑制剂，或权利要求4或5所述病害抑制剂的方法，包括将权利要求1所述的深褐芽孢杆菌和/或权利要求1所述的深褐芽孢杆菌的代谢物作为活性成分，得到所述病原菌抑制剂或所述病害抑制剂的步骤。
8.权利要求1所述的深褐芽孢杆菌和/或权利要求1所述的深褐芽孢杆菌的代谢物的下述1)-4)中任一种应用：
1)权利要求1所述的深褐芽孢杆菌和/或权利要求1所述的深褐芽孢杆菌的代谢物在抑制病原菌中的应用；
2)权利要求1所述的深褐芽孢杆菌和/或权利要求1所述的深褐芽孢杆菌的代谢物在制备病原菌抑制剂中的应用；
3)权利要求1所述的深褐芽孢杆菌和/或权利要求1所述的深褐芽孢杆菌的代谢物在抑制病害中的应用；
4)权利要求1所述的深褐芽孢杆菌和/或权利要求1所述的深褐芽孢杆菌的代谢物在制备病害抑制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述病原菌为下述至少一种：
A、植物灰霉病菌；
B、植物枯萎病菌；
C、植物赤霉病菌；
D、植物纹枯病菌；
E、植物全蚀病菌；
F、植物根腐病菌；
G、植物褐腐病菌；
H、植物炭疽病菌；
I、植物轮纹病菌；
J、植物或蘑菇细菌性病菌；
所述病害为下述至少一种：
a、植物灰霉病；
b、植物枯萎病；
c、植物赤霉病；
d、植物纹枯病；
e、植物全蚀病；
f、植物根腐病；
g、植物褐腐病；
h、植物炭疽病；
i、植物轮纹病；
j、植物或蘑菇细菌性病。
10.下述1)-5)中任一种应用：
1)权利要求1所述的深褐芽孢杆菌在生产嗜铁素中的应用；
2)权利要求1所述的深褐芽孢杆菌在生产几丁质酶中的应用；
3)权利要求1所述的深褐芽孢杆菌在生产纤维素酶中的应用；
4)权利要求1所述的深褐芽孢杆菌在生产淀粉酶中的应用；
5)权利要求1所述的深褐芽孢杆菌在生产蛋白酶中的应用。
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