CN115287223A - 一株具有多种生防效果的深褐芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农作物防治技术领域，具体涉及一株深褐芽孢杆菌及其应用。所述的深褐芽孢杆菌为深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）novonest927，保藏编号为：CCTCC NO:M2022824，该菌株可用于防控棉花黄萎病、辣椒疫病和西瓜、黄瓜枯萎病等病害，及由烟草花叶病毒引起的作物病毒病及作物线虫病害。与现有杀菌剂和杀虫剂无交互抗药性。与目前使用化学合成农药防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点，具有广阔的应用前景。

Description

一株具有多种生防效果的深褐芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于农作物防治技术领域，具体涉及一株具有多种生防效果的深褐芽孢杆菌及其应用。

背景技术

深褐芽孢杆菌Bacillus atrophaeus是一种需氧的、革兰氏阳性杆状细菌，该菌能产生抗逆芽孢，在抗低温、抗盐碱、抗辐射等方面表现突出，因此具有抗逆性强、无致病性、安全可靠等特点。深褐芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的黑色变种，其对病原菌同样具有较强的拮抗活性，近年来成为植物病害生物防治的研究热点。

关于深褐芽孢杆菌的报道，多集中于真菌病害防控方面，如立枯丝核菌、链格孢菌、灰葡萄孢、瓜果腐霉菌、早疫菌、辣椒疫霉菌等引起的病害。另外，外施的拮抗菌的存活、生长以及抗性成分的产生，都无法避免外界环境的巨大影响，因此芽孢杆菌在作物的定殖能力对防控效果有重要影响。关于深褐芽孢杆菌定殖能力的报道较少，辛海峰等报道了XM5菌株在小麦麦穗内部有良好的定殖能力，黄大野等报道了GQ260菌株在枸杞根部具有良好的定殖能力。在病毒病防控方面，沈硕等报道了E20303对马铃薯Y病毒具有一定的活性。深褐芽孢杆菌单一菌株的功能和应用范围有限。

本发明提供的深褐芽孢杆菌novonest 927是从新疆棉花根际土壤分离的一株对作物病害具有良好防治效果的芽孢杆菌，其在防治防治棉花黄萎病、辣椒疫病、西瓜和黄瓜枯萎病，在棉花根部具有良好的定殖能力，在烟草花叶病毒等引起的作物病毒病和作物根结线虫病中，具备广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为深褐芽孢杆菌novonest 927，其保藏号为CCTCC NO:M 2022824。

本发明的另一个目的在于提供了深褐芽孢杆菌novonest 927的液体发酵液的制备方法。

本发明的最后一个目的在于提供深褐芽孢杆菌novonest 927在制备植物病原菌，病毒或线虫抑制剂中的应用，特别是用于制备防治棉花黄萎病、辣椒疫病、西瓜和黄瓜枯萎病、烟草黑胫病或烟草根腐病，烟草花叶病毒引起的作物病毒病和作物根结线虫病。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人自棉花重病田块的健康棉花植株根际土壤中分离一株具备多种生防效果的菌株，经鉴定为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，已于2022年06月07日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：Bacillus atrophaeus novonest927；保藏编号为CCTCC NO: M2022824；地点：中国，武汉，武汉大学。

深褐芽孢杆菌novonest 927在LB培养基菌落生长良好，菌落乳白色(图1)。

本发明的保护范围包括：

深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)novonest927在防治植物病原菌病中的应用，所述的植物病原菌病为棉花黄萎病、辣椒疫病、西瓜和黄瓜枯萎病、烟草黑胫病或烟草根腐病。

深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)novonest927在防治烟草花叶病毒病中的应用。

深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)novonest927在防治根结线虫病中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供了一种深褐芽孢杆菌，与现有技术相比，本发明提供的深褐芽孢杆菌的同时具有抗菌，抗线虫，抗病毒的生防功能，可以防控真菌病害、病毒病和线虫，与现有杀菌剂和杀虫剂无交互抗药性，本发明的深褐芽孢杆菌首次被报道具有线虫抑制能力。

(2)与目前使用化学合成农药防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点。

(3)本发明筛选到的深褐芽孢杆菌还具有在棉花根系定殖特性。

附图说明

图1novonest927菌株菌落形态。

图2novonest927抑菌活性示意图。

图3novonest927防控棉花黄萎病示意图。

图4novonest927防控辣椒疫病示意图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

深褐芽孢杆菌novonest 927的获得：

申请人自棉花重病田块的健康棉花植株根际土壤中分离一株具备多种生防效果的菌株，经16s rDNA结合生理生化鉴定后属于深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)(图1，表1)，已于2022年06月07日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：Bacillusatrophaeus novonest 927；保藏编号为CCTCC NO:M2022824；地点：中国，武汉，武汉大学。

在本发明中，深褐芽孢杆菌novonest927或被简称为novonest927。

形态特征：菌落圆形，乳白色。

菌株生理生化特性：

表1菌株novonestv927生理生化特性–碳源利用

+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应

实施例2：

深褐芽孢杆菌novonest 927的发酵(以下培养基配方中的百分数均为质量分数)：

1)一级种子培养：500ml三角瓶中装有100ml一级种子培养基，121℃湿热灭菌20min，取novonest 927冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在35℃，180rpm摇床振荡培养12h；一级种子培养所用培养基的原料及用量为：甘露糖2％，蛋白胨2％，酵母提取物1％，氯化钠1.5％，培养基pH为7；

2)二级种子培养：500L发酵罐中装有350L二级种子培养基，121℃湿热灭菌20min，将 200ml一级种子接种于二级种子培养基中；在35℃培养16h；控制罐压0.05Mpa，搅拌转速200rpm，通气比1:1，二级种子培养所用培养基的原料及用量为：甘露糖2％，酵母抽提物4％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.01％，培养基pH 7；

3)发酵：20吨发酵罐中装有12吨novonest 927发酵培养基，121℃湿热灭菌20min，将 200L二级种子液移种于发酵培养基中，控制罐0.05Mpa，搅拌转速180rpm，通气比1:1.2，在37℃培养40h；发酵所用培养基的原料及用量为：甘薯粉3.0％、豆粕2.0％、酵母提取物1％、磷酸二氢钾0.02％、硫酸镁0.02％，培养基pH7；

4)芽孢脱落30-40％时结束发酵。芽胞数90亿cfu/mL。

以上述相同的发酵参数，对深褐芽孢杆菌GQ260(CN114350552A)进行发酵，发酵培养基参考CN114350552A，发酵后计数芽胞数90亿cfu/mL。

实施例3：

深褐芽孢杆菌novonest927的抑菌活性：

将植物病原菌从斜面活化至PDA平板备用。采用对峙培养法进行离体抑菌试验，将灭菌滤纸片置于PDA平板两端，随后滴入novonest 927发酵液10μL。24h后用4mm打孔器接入上述病原菌菌碟，以接无菌水作为空白对照，以深褐芽孢杆菌GQ260作为菌株对照(发酵条件同实施例2的novonest927，发酵后计数芽胞数90亿cfu/mL)，病原菌和滤纸片距离为25mm。带对照长满平板后统计各处理和对照菌落直径，并计算抑菌率。

同时以相同的病原菌检测CN114350552A中公开的深褐芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus) GQ260的抑菌效果。

抑菌率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100％

离体抑菌试验表明，novonest927对棉花黄萎病原菌(Verticillium dahliae)、辣椒疫病病原菌(Phytophthora capsici)、西瓜和黄瓜枯萎病病原菌(Fusarium solani)等具有良好的抑菌活性(图2，表2)。

抑菌实验表明，两株深褐芽孢杆菌，都有不同程度的抑菌能力，对于相同菌株的抑制效果不同，说明，两株菌的抑菌有效成分不同。

表2深褐芽孢杆菌novonest 927和GQ260菌株离体抑菌活性

实施例4：

novonest 927防治棉花黄萎病及其定殖能力：

棉花黄萎病及在棉花根系定育苗钵，四叶期备用，将棉花黄萎病菌接种于PDA平板上， 25℃培养7d，然后接种到察氏培养基中，25℃、130r/min振荡培养7d，3层纱布过滤，获得孢子悬浮液。将novonest 927发酵液稀释5倍灌根棉花，10mL/棵，对照灌清水，5d 后灌棉花黄萎病菌，5mL/棵。待对照充分发病后统计对照和处理病情指数，并计算防效。

0级为无症状，1级为轻度边缘黄化，2级为中度边缘黄化，3级为中度枯萎和可见坏死，4级为严重枯萎和落叶。

病情指数＝∑(各级植株数×级别)/(调查总株数×最高代表级别)×100。

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

将novonest 927在含不同梯度浓度利福平LB平板进行抗性突变体筛选，获得抗性突变菌株，并按照实施例2发酵，将发酵液对棉花、西瓜和枸杞根部进行灌根，10mL/棵，14d后取出棉花，用无菌水反复冲洗根部3次，将根部剪下并称取1g，研磨并稀释后，涂布于含300μg·mL^-1的利福平的LB平板，37℃培养24h后计数，测定novonest 927在棉花和西瓜和枸杞根系的定殖能力。

试验表明，novonest 927对棉花黄萎病具有良好的防控效果，防效达到80.51％(图3)， novonest 927定殖具有寄主选择性，这种定殖能力有助于菌株对棉花黄萎病的防控。。

表3novonest 927对棉花黄萎病防控效果

处理	病情指数	防效(％)
			novonest 927	11.72	80.51
对照	60.12	-

表4novonest 927在棉花根系根际定殖能力

作物	定殖量(cfu·g)
		棉花	8.3×10<sup>6</sup>
西瓜	2.1×10<sup>3</sup>
		枸杞	2.8×10<sup>3</sup>

实施例5：

novonest 927防控辣椒疫病

将辣椒种子使用1％次氯酸钠浸泡5min，随后用无菌水冲洗3次，30℃催芽露白后播种于72孔穴盘，基质为草炭：蛭石：珍珠岩＝3:1:1(V：V：V)，辣椒长至4叶期时进行试验。

将辣椒疫霉从斜面活化至V8平板，28℃培养7d，随后使用无菌水冲洗平板，并用双蒸水浸没，光照培养10d诱发游动孢子囊产生。将菌丝和孢子囊洗脱，双层灭菌纱布过滤，转至4℃冰箱放置30min，然后室温放置30min促进游动孢子释放。使用无菌水将孢子浓度调至2×10⁴个·mL^-1备用。

将novonest 927发酵液稀释5倍灌根辣椒，10mL/棵，对照灌清水，5d后灌辣椒疫霉孢子悬液，1mL/棵。待对照充分发病后统计对照和处理病情指数，并计算防效。

分级标准：0级：无症状；1级：叶子轻微萎蔫，茎部有黑色病变；2级：植株30％-50％发病；3级：植株50％-70％发病；4级：植株70％-90％发病；5级：植株死亡。

病情指数＝∑(各级植株数×级别)/(调查总株数×最高代表级别)×100。

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

研究结果表明，novonest 927对辣椒疫病具有良好的防控效果，防效达到85.76％(图4)。

表5novonest 927对辣椒疫病防控效果

处理	病情指数	防效(％)
			novonest 927	11.84	85.76
对照	83.12	-

实施例6：

novonest 927对根结线虫离体活性及防控烟草根结线虫效果

离体试验：取南方根结线虫卵块用2％次氯酸钠表面消毒后用无菌水孵育出二龄线虫备用.用96孔板进行毒力测定，每孔吸取试验用二龄南方根结线虫30头左右；加入实施例2 制备的novonest 927发酵液，定量(200μL)过滤除菌后的上清液，加入1％的氯霉素抑制；发酵液上清设置3个重复，并用清水作为空白对照，以实施例2制备的GQ260菌株作为菌株对照；20℃温育，分别于24h、48h、72h，在倒置显微镜下观察线虫存活情况；线虫死活判断以针触之不动判定为死亡.死亡率按以下公式统计：

线虫死亡率＝(线虫死亡数/供试线虫数)×100％

线虫校正死亡率＝[(处理线虫死亡率-对照死亡率)/1-对照死亡率]×100％

离体试验结果表明，72h后，novonest 927对根结线虫离体校正死亡率为83.71％，具有明显的抗虫作用，而GQ260死亡率为0。

田间试验位于湖北省恩施州鹤峰县燕子乡，烟草移栽定植15d后灌根实施例2制备的 novonest 927发酵液200倍，间隔15d灌根一次，200mL/棵，对照灌清水，每个处理3次重复，每个重复40m²，试验共灌根3次，采收前统计各处理根结指数并计算防效。

烟草病害发生情况按GB/23222-2008烟草病虫害分级及调查方法进行调查。

根结指数＝∑(各级植株数×级别)/(调查总株数×最高代表级别)×100。

防治效果＝(对照根结指数-处理根结指数)/对照根结指数×100％

试验结果表明，novonest 927对烟草根际线虫具有一定的防控效果，防效达到54.85％。

表6novonest 927菌剂对烟草根结线虫田间防效

处理	根结指数	防效(％)
			novonest 927	29.06	54.85
对照	64.37	-

实施例7：

novonest 927防控烟草花叶病毒病

试验位于湖北省恩施州鹤峰县燕子乡，烟草移栽定植30d后，实施例2制备novonest 927 发酵液200倍喷雾处理烟叶，间隔10d喷雾一次，共三次，对照喷清水。每个处理4次重复，每个重复60棵烟叶。待对照重复发病后统计各处理病情指数，并计算防效。

烟草病毒病分级标准(按株分级)，0级:全株无病。1级:心叶脉明或轻微花叶，植株无明显矮化。3级:1/3叶片花叶但不变形，或植株矮化为正常株高的3/4以上。5级: 1/3～1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或植株矮化为正常株高的2/3～3 /4。7级:1/2～2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2～2 /3。9级:全株叶片花叶，严重变形或坏死，或植株矮化为正常株高的1/2以上。

病情指数＝∑(各级植株数×级别)/(调查总株数×最高代表级别)×100。

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

试验结果表明，novonest 927对烟草花叶病毒具有一定的防控效果，防效达到52.56％。

表6novonest 927菌剂对烟草花叶病毒田间防效

处理	病情指数	防效(％)
			novonest 927	18.33	52.56
对照	38.64	-

Claims (4)

1.一种分离的深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus），所述深褐芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO: M2022824。

2.权利要求1所述的深褐芽孢杆菌在防治植物病原菌病中的应用，所述的植物病原菌病为棉花黄萎病、辣椒疫病、西瓜和黄瓜枯萎病、烟草黑胫病或烟草根腐病。

3.权利要求1所述的深褐芽孢杆菌在防治烟草花叶病毒病中的应用。

4.权利要求1所述的深褐芽孢杆菌在防治线虫病中的应用。

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