CN109136154B - 一株能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的格拉纳达假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的格拉纳达假单胞菌及其应用，所述的格拉纳达假单胞菌为格拉纳达假单胞菌(Pseudomonas granadensis)PF3402，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武昌珞珈山，保藏编号：CCTCC M 2018545，保藏日期：2018年08月17日。本发明通过平板对峙抑菌、防病和盆栽促生实验，首次从阿尔山上的土壤中筛选出能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病的生防菌PF3402，经鉴定该菌株为格拉纳达假单胞菌，同时该菌株还具有促进烟苗生长的作用。试验表明，本发明的PF3402对烟草黑胫病和根黑腐病的病原菌均具有良好的抑制作用，对两种烟草病害的防效均能达到60％以上。

Description

一株能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的 格拉纳达假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的格拉纳达假单胞菌、筛选方法及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

烟草是我国主要经济作物之一，是植烟地区收入的重要来源，现已发现其具有较大的药用和保健价值，且能够作为生物科学最佳的模式材料。但烟草病害制约着烟草的健康生长，尤其是烟草黑胫病、烟草根黑腐病等土传病害的发生会造成烟草减产，发病严重时会造成毁灭性的损失。

烟草黑胫病是烟草生产上危害最严重的土传病害之一，病原物为烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)。该病害多发生于大田成株期，症状主要有“黑胫”、“穿大褂”、“黑膏药”、“碟片状”、“腰烂”，烟草黑胫病属高温高湿型病害，相对湿度高时田间会出现发病高峰，严重时能够造成整株成片死亡。

烟草根黑腐病是世界性的烟草病害，也是我国烟草主要病害之一，其病原物为根串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)。根黑腐病主要发生在烟草根部，幼苗染病时可引起“猝倒”，使整株烟苗毁坏；较大烟株染病则病株叶片变黄、变薄，极大的影响烟草产量和品质，严重发生时可导致烟田绝收。

随着国内烟草种植面积扩大，连作烟田的增多，烟草黑胫病和烟草根黑腐病等土传病害的危害不断加重，在部分烟区已成为影响烟草发展的主要病害。生产上烟田防治土传病害多以化学防治为主，农药的长期使用容易产生环境污染、农药残留和耐药病原菌等问题。

生物防治在烟草土传病害控制方面已经受到学者的重视，有关烟草黑胫病和根黑腐病生防菌的筛选及其菌剂和应用已被广泛研究。我国已公开的对烟草黑胫病有效的生防菌株主要有枯草芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、青霉菌和淡紫拟青霉等几类，而对烟草根黑腐病有效的生防菌较少，且能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病这两种容易混合发生的生防菌株则更少，因此筛选对这两种病害同时有效且对烟草有促生作用的生防菌株具有重要的理论和实践意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一株能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的格拉纳达假单胞菌、筛选方法和应用，该格拉纳达假单胞菌能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病，且能促进烟苗生长。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的格拉纳达假单胞菌，所述的格拉纳达假单胞菌为格拉纳达假单胞菌(Pseudomonas granadensis)PF3402，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武昌珞珈山，保藏编号：CCTCC NO：M2018545，保藏日期：2018年08月17日。

一种能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的格拉纳达假单胞菌的筛选方法，采集内蒙古阿尔山上的土壤，称取1g土壤，加入10ml无菌水中充分振荡获得土壤悬浮液，然后将土壤悬浮液摇匀后进行稀释，取0.1ml稀释液涂布于含8-羟基喹啉的KB固体平板上，28℃培养，至菌落长出后分离纯化，然后筛选出对烟草疫霉和根串珠霉具有抑制效果的菌株，并鉴定，得到格拉纳达假单胞菌PF3402。

一种格拉纳达假单胞菌在同时防治烟草黑胫病和根黑腐病方面的应用。

一种格拉纳达假单胞菌在促进烟草生长方面的应用。

一种格拉纳达假单胞菌在同时防治烟草黑胫病和根黑腐病并促进烟草生长方面的应用。

一种格拉纳达假单胞菌在制备同时防治烟草黑胫病和根黑腐病，和/或，促进烟草生长的菌剂中的应用。

菌剂的制备方法为：将格拉纳达假单胞菌接种于KB培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养16h制备种子菌，种子菌以3％的接种量接种于KB培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液，即为菌剂；发酵液中格拉纳达假单胞菌活菌浓度为10⁹～ 10¹⁰CFU/ml。

KB培养基为：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氢二钾1.5g，七水合硫酸镁1.5g，添加蒸馏水定容至1000ml，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。

菌剂的使用方法为：菌剂用无菌水稀释10倍，使稀释液活菌浓度为10⁸～10⁹CFU/ml，灌根于烟草根部周围；每3d灌根处理1次，共灌根3次。

本发明有益效果：

本发明的目的是生物防治烟草黑胫病和烟草根黑腐病等2种烟草主要病害，因此本发明通过平板对峙抑菌、防病和盆栽促生实验，首次从阿尔山上的土壤中筛选出能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病的生防菌PF3402，经鉴定该菌株为格拉纳达假单胞菌(Pseudomonas granadensis)，同时该菌株还具有促进烟苗生长的作用。试验表明，本发明的格拉纳达假单胞菌对烟草黑胫病和根黑腐病的病原菌均具有良好的抑制作用，对两种烟草病害的防效均能达到60％以上，能够有效降低烟草根茎病害的发病率，其效果与现有的常用化学农药相似。本发明筛选的格拉纳达假单胞菌使用后不会产生抗药性、农药残留、环境污染等化学农药常见问题，对人畜健康、环境友好，符合人们对生态农业的需求。

附图说明

图1为菌株PF3402对烟草疫霉和根串珠霉的平板对峙抑菌试验结果。

图2为菌株PF3402的菌落形态。图左为对照，图右为PF3402处理。

图3为菌株PF3402对烟叶过敏性试验结果。图左为阳性对照，图右为菌株PF3402。

图4为菌株PF3402对烟草盆栽促生试验结果。图左为接种KB培养基，图右为接种菌株 PF3402。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实验材料：

KB培养基：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氢二钾1.5g，七水合硫酸镁1.5g，琼脂20g(仅做固体培养基时添加)，添加蒸馏水定容至1000ml，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。

PDA培养基：马铃薯200g(切成边长约1cm的小块，放入800ml蒸馏水煮沸15min，双层纱布过滤后留取滤液)，葡萄糖20g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌30min。

菌谷培养基：将谷子浸泡6h后用清水洗净，淘尽瘪空壳谷粒，煮至谷粒炸开成半开花状，冷却至半干，分装入500ml三角瓶中高压灭菌1h(115℃)，备用。装入的谷粒量以不超过500ml刻度线为宜。

本发明所用病原菌及其它原料、试剂均可由市场购得。

实施例1、生防菌的分离

在内蒙古阿尔山上采集种植烟草的根际土壤，称取1g土壤，加入10ml无菌水中充分振荡获得土壤悬浮液，然后将土壤悬浮液摇匀后做适当稀释(可进行倍比稀释)，取0.1ml稀释液涂布于含8-羟基喹啉(0.05g/L)的KB固体培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养36h，至菌落长出，挑取大小、颜色或形态不同的菌落在KB固体培养基表面划线分离纯化，获得4株菌株，并分别命名为PF3402、PG3403、PG3101和PG3105。

实施例2、生防菌的筛选

利用平板对峙方法筛选生防菌：将烟草黑胫病病原疫霉和根黑腐病原根串珠霉接种在 PDA培养基上，分别于25℃、28℃条件下培养5～10d，用灭过菌的打孔器将病原菌菌落打成直径为5mm的圆形菌丝块。将病原菌菌块(烟草根串珠霉与烟草疫霉)与分离菌株接入PDA培养基上，病原菌菌块与分离菌株相距20mm，同时设置单独接种病原菌菌块作为对照。每处理3次重复，1周后检查对峙培养结果，结果见表1，其中PF3402对2株病原菌均有最高的抑菌率。

表1阿尔山土壤分离的4株菌株对烟草疫霉和根串珠霉的抑菌结果

分离菌株发酵滤液抑菌活性测定：取培养24h的菌株PF3402，接入100ml KB培养液，于28℃、180rpm摇瓶发酵2d，离心后留滤液，用微孔滤膜过滤2次(4℃下保存)，然后配制含滤液300ml/l的PDA平板，在每板中央接入5mm病原菌菌块1个，于28℃恒温培养， 5d后观察结果。

结果表明，PF3402对烟草疫霉和根串珠霉均有较好的抑制效果(图1)。

实施例3、生防菌鉴定

菌株形态及生理生化：PF3402革兰氏染色阴性，在KB培养基上，28℃培养48h的菌落形态圆形凸起，表面光滑湿润，乳黄色、半透明，挑起菌落粘稠，培养基上有可扩散的荧光颜料(仅紫外UV2上可见)(图2)。5℃能够生长，41℃不能生长。氧化酶、精氨酸二水解酶和明胶液化阳性，不能水解淀粉，硝酸盐还原和反硝化试验、甲基红和VP试验均为阴性。

测序：对菌株PF3402进行测序，鉴定结果为格拉纳达假单胞菌(Pseudomonasgranadensis)。

16SrDNA基因测序结果为：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGT CGAGCGGATGAGAGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTA GGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGT CCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGG ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGTTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGA GGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT GGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAA GGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGC AATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTT CGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGTCG AGCTAGAGTAAGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATA TAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTG CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGAT GTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGA CCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCAC AAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGA CATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCA ACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGAC AAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTAC ACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCC ATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATC GCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACC GCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGG ACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC(SEQ ID NO.1)

实施例4、生防菌对烟叶过敏性试验

将在28℃条件下，培养24h菌龄的格拉纳达假单胞菌PF3402，用10mM MgSO₄配成10⁷～ 10⁸CFU/ml(OD₆₀₀在0.3～0.5)的菌液，对烟草下表皮进行皮下接种，在24℃，60％-80％的高湿度条件下，经24-48h后出现过敏性坏死枯斑的为阳性反应，3d后出现黄斑的为阴性反应，以10mM MgSO₄为阴性对照，以烟草野火菌为阳性对照(YH)。

结果发现，格拉纳达假单胞菌PF3402过敏性试验为阴性反应，因此格拉纳达假单胞菌 PF3402无致病性，可作为烟草土传病害的生防菌(图3)。

实施例5、生防菌的防病试验

格拉纳达假单胞菌PF3402发酵液的制备方法为：将格拉纳达假单胞菌PF3402接种于 KB培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养16h制备种子菌，种子菌以3％的接种量接种于KB培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液；发酵液中格拉纳达假单胞菌活菌浓度为10⁹～10¹⁰CFU/ml。使用时，用无菌水10倍稀释发酵液，稀释液活菌浓度为 10⁸～10⁹CFU/ml。

取长势一致的5～6片真叶烟苗移栽于装有灭菌土与基质的体积比3:1的花盆中，每盆1 株。采用灌根法接种格拉纳达假单胞菌PF3402。缓苗3d后，用少量清水湿润土壤，后用移液枪头将格拉纳达假单胞菌PF3402发酵液灌入烟株根际，8ml/株，并取2ml发酵液淋于茎基部，之后每3d灌根1次，共灌根3次；对照组同样方法接入等量KB培养基(CK)。另外，设置药剂阳性对照组，烟草黑胫病药剂对照为58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂500倍稀释液，烟草根黑腐病药剂对照为70％甲基硫菌灵1000倍稀释液，每株烟苗15ml，第1次灌根7d之后再灌根1次，共灌根2次。在各组最后一次灌根1d后分别接种黑胫病病原疫霉和根黑腐病病原根串珠霉。疫霉接种方法：先用手术刀划伤烟苗茎基部，造成苗茎基部受伤，然后接种烟草黑胫病病原菌菌丝(将保存的烟草黑胫病菌丝接入PDA平板上培养，5～7d后转入菌谷培养基上培养18～20d备用)，接种量为5g/株；根黑腐病病原根串珠霉接种方法：灌根接种，取5ml根黑腐病病原菌孢子悬浮液(浓度为1×10⁶个/ml)对烟苗进行灌根接种。接种病原菌后立即覆土保湿，每天早晚各浇一次水，置于25～28℃温室中培养，定期观察烟苗的发病情况。培养30d后调查、计算发病率、病情指数和防治效果。烟草根茎病害分级标准参照国家标准(GB/T23222-2008)进行，结果见表2、3。

结果表明，格拉纳达假单胞菌PF3402对烟草黑胫病和根黑腐病的防效分别为66.67％和 60.00％。

表2格拉纳达假单胞菌PF3402对烟草黑胫病的盆栽防病结果

注：数据中不同小写字母表示差异达到0.05显著水平。下同。

表3格拉纳达假单胞菌PF3402对烟草根黑腐病的盆栽防病结果

实施例6、盆栽促生试验

取长势一致的5～6片真叶烟苗移栽于装有灭菌土与基质的体积比3:1的花盆中，每盆1 株。采用灌根法接种生防菌，灌根前用少量清水湿润土壤，于根际接种格拉纳达假单胞菌 PF3402发酵液(活菌浓度为10⁸～10⁹CFU/ml)，每株5ml，重复接种3次，间隔为3d，对照组同样方法接入等量KB培养基(CK)。培养条件(24h)10h光照、28℃，14h黑暗、 23℃，75％湿度。待烟苗长至30d后，各处理随机选取10株烟苗，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，按烟草行业标准YC/T 142-1998：《烟草农艺性状调查方法》测量并记载各处理烟株株高、根长、最大叶面积、有效叶片数、根冠比和根活力(表4、图4)。

结果表明，格拉纳达假单胞菌PF3402能够促进烟草株高、根长、最大叶面积、有效叶片数的增加，提高根冠比和根活力，说明格拉纳达假单胞菌PF3402具有良好的促生作用。

表4格拉纳达假单胞菌PF3402对烟草的促生分析

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南省农业科学院植物保护研究所

<120> 一株能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的格拉纳达假单胞菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1498

<212> DNA

<213> 格拉纳达假单胞菌(Pseudomonas granadensis)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60

ggatgagagg agcttgctcc tggattcagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct 120

gcctggtagt gggggacaac gtttcgaaag gaacgctaat accgcatacg tcctacggga 180

gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt 240

ggtgaggtaa tggttcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca 300

cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360

atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag 420

cactttaagt tgggaggaag ggttgtagat taatactctg caattttgac gttaccgaca 480

gaataagcac cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt gcaagcgtta 540

atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcgt taagttggat gtgaaatccc 600

cgggctcaac ctgggaactg cattcaaaac tgtcgagcta gagtaaggta gagggtggtg 660

gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg 720

accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780

accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tgggagcctt gagctcttag 840

tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca 900

aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960

aagaacctta ccaggccttg acatccaatg aactttccag agatggattg gtgccttcgg 1020

gaacattgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080

gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgttatggtg ggcactctaa 1140

ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt 1200

acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt 1260

ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320

agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg 1380

tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagctag tctaaccttc 1440

gggaggacgg ttaccacggt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtaacc 1498

Claims (8)

1.一株能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的格拉纳达假单胞菌，其特征在于，所述的格拉纳达假单胞菌为格拉纳达假单胞菌（Pseudomonas granadensis）PF3402，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武昌珞珈山，保藏编号：CCTCC NO：M 2018545，保藏日期：2018年08月17日。

2.一种如权利要求1所述的格拉纳达假单胞菌在同时防治烟草黑胫病和根黑腐病方面的应用。

3.一种如权利要求1所述的格拉纳达假单胞菌在促进烟草生长方面的应用。

4.一种如权利要求1所述的格拉纳达假单胞菌在同时防治烟草黑胫病和根黑腐病并促进烟草生长方面的应用。

5.一种如权利要求1所述的格拉纳达假单胞菌在制备同时防治烟草黑胫病和根黑腐病，和/或，促进烟草生长的菌剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，菌剂的制备方法为：将格拉纳达假单胞菌接种于KB培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养16h制备种子菌，种子菌以3%的接种量接种于KB培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液，即为菌剂；发酵液中格拉纳达假单胞菌活菌浓度为10⁹～10¹⁰CFU/ml。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，KB培养基为：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氢二钾1.5g，七水合硫酸镁1.5g，添加蒸馏水定容至1000ml，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，菌剂的使用方法为：菌剂用无菌水稀释10倍，使稀释液活菌浓度为10⁸～10⁹CFU/ml，灌根于烟草根部周围；每3d灌根处理1次，共灌根3次。

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