CN114574369B - 一株桃色顶孢霉mr-47及其应用 - Google Patents

一株桃色顶孢霉mr-47及其应用 Download PDF

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Abstract

一株桃色顶孢霉(Acremoniumpersicinum)MR‑47及其应用，涉及生物防治领域。该菌株已于2022年1月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:62209。该菌株MR‑47对多种植物病原菌具有较强的抗菌活性，抑菌率达62～74％；该菌株MR‑47能使木贼镰刀菌菌丝出现膨大、缢缩、断裂及扭曲畸形等现象，拮抗木贼镰刀菌的生长，抑菌率达60％；该菌株MR‑47可明显降低防风根腐病的病情指数，防效达75.05％；该菌株MR‑47具有较强的广谱抑菌抗性及土壤定殖能力；该菌株MR‑47具有一定的生防潜力和促生作用，可用于制备防治植物病原菌的绿色生物农药。

Description

一株桃色顶孢霉MR-47及其应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一株桃色顶孢霉(Acremoniumpersicinum)MR-47及其应用。
背景技术
中药材是中医药发展的重要物质基础，我国是世界上规模最大、品种最多、生产体系最完整的中药材生产大国。在中药材种植生产过程中病虫害、农药残留超标、违规使用激素等是影响中药材产量和质量的重要问题，备受关注。
生物防治具有绿色安全、持续、广谱、无污染等特点，生防菌的开发与应用成为防治植物病害的热点。中药材产业是农业发展的重要产业之一，近年来，利用拮抗微生物防治中药材土传病害研究取得一些进展，例如解淀粉芽孢杆菌对人参灰霉病，球毛壳菌对人参黑斑病、锈腐病及疫病病菌，木霉菌对人参根部病害、西洋参立枯病菌及黄芪根腐病菌等药用植物病原菌有较强的拮抗作用，丛枝菌根真菌(arbuscular mycohrizal fungi，AMF)能减轻由镰刀菌(Fusarium)、腐霉菌(Pythium)、丝核菌(Rhizoctonia)等属内的病原真菌对药用植物所造成的危害程度，枯草芽孢杆菌B1、B2均能够减少当归、黄芪等的病害，提高产量。因此，以生防菌为主的中药材病害生物防治技术的研究与应用已成为生物防治的热点，对中药材产业的绿色可持续发展具有重要意义。
防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schisck.为伞形科防风属植物，以未抽花茎植株的干燥根入药。味辛、微甘、性温，具有止痉、祛风解表、胜湿止痛的功效。近年来，防风用量不断增加，价格逐年上涨，并出口韩国、日本及东南亚各国，栽培面积逐渐扩大。防风根腐病在防风的栽培地区发病范围和发病程度逐步上升，造成防风大面积减产。木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)是引起防风根腐病的主要病原菌，也是一种世界性的土壤真菌，通过入侵根部成为优势种，并破坏维管束组织来减少根部内生真菌。防风根腐病发病初期根部产生褐色腐烂病斑，发病后期，染病根茎部有黑褐色、水渍状、长条形的腐烂病斑。地上部分叶片变黄、细小，最后整株枯死，已成为严重危害防风根茎类中药材的病害之一。目前，对于防风根腐病主要采用恶霉灵、百菌清、多菌灵、代森锰锌可湿性粉剂等化学农药进行防治。然而长期使用化学农药不仅容易导致农药残留，还会形成抗药性、破坏生态平衡、造成环境污染并且对人类身体健康构成威胁。因此，筛选并鉴定可拮抗防风根腐病病原菌木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)及其他病原菌的生防菌具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47及其应用，该桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47对防风根腐病病原菌具有显著拮抗效果，且具有抑菌谱广、生态安全、拮抗活性强、生防效果好等优点。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一株桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47，该菌株已于2022年1月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:62209。
作为优选的实施方式，该菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选的实施方式，该菌株在Gen Bank数据库中的登录号为OK287149.1。
本发明的一株桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47在制备用于抑制植物病原菌的生物抑菌剂中的应用。
作为优选的实施方式，所述植物病原菌包括尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、细极链格孢(Alternaria tenuissima)、鹅掌楸链格孢(Alternaria liriodendra)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。
作为优选的实施方式，所述生物抑菌剂的活性成分为桃色顶孢霉(Acremoniumpersicinum)MR-47的菌体、发酵孢子液、发酵代谢产物或发酵粗提物。
本发明的一株桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47在防治防风根腐病病原菌木贼镰刀菌中的应用。
本发明的一株桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47在促进植株生长中的应用。
作为优选的实施方式，所述植株为防风。
本发明的有益效果是：
本发明的桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47，分离自人工栽培的防风根际土壤，通过其形态特征、生理生化特征和分子鉴定结果，将菌株MR-47鉴定并确定为桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)。
本发明的桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47具有较广的抑菌谱，显著区别于其他顶孢霉菌株，该菌株MR-47对多种植物的病原真菌具有显著的抑菌活性，尤其是对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、细极链格孢(Alternaria tenuissima)、鹅掌楸链格孢(Alternarialiriodendra)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpondestructans)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、防风根腐病病原菌木贼镰刀菌(Fusarium equisetum)的抑菌率达到62～74％。
本发明的桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47与防风根腐病病原菌木贼镰刀菌(Fusarium equisetum)生长对峙实验中，该菌株MR-47能够使木贼镰刀菌菌丝出现膨大、缢缩、断裂以及扭曲畸形等现象，抑菌率达到60％以上。
本发明的桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47具有遗传稳定性，在土壤中定殖能力强，可将其应用于植物种植栽培过程施入土壤而防病治病。
本发明的桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47的发酵孢子液对防风根腐病的盆栽防治效果显示：发病率和发病程度均显著降低，1×107CFU/mL浓度的菌株MR-47发酵孢子液对防风根腐病防治效果达75.05％，病情指数为16，显著提高了防风的株高以及根鲜重。说明该菌株MR-47对防风根腐病具有显著的防治效果，其菌体、发酵孢子液、发酵代谢产物以及发酵粗提物可制备成生物抑菌剂，作为绿色生物农药，用于防风根腐病以及其他药用植物或作物病害的防治，本发明的桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47在农业及医药领域具有极大的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中分离得到的菌株MR-47对木贼镰刀菌的抑菌效果。图中，a为木贼镰刀菌对照；b为菌株MR-47与木贼镰刀菌对峙。
图2为实施例2中菌株MR-47的形态特征。图中，a为菌株MR-47菌落特征；b为菌株MR-47显微特征。
图3为实施例2中构建的系统进化树图。
图4为实施例4中菌株MR-47对木贼镰刀菌菌丝生长的影响。图中，a为木贼镰刀菌对照；b为断裂、缢缩；c为膨大、扭曲畸形、粗细不均。
图5为实施例5中标记菌株MRRif-47在土壤中的定殖量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1桃色顶孢霉MR-47的分离纯化和筛选
实验方法：
1、供试土壤样本采用五点取样法，于2019年7月从吉林农业大学药用植物园(43°48′23″N，125°24′57″)采集的人工栽培的防风根际土，装于无菌自封袋中，放入4℃冰箱内保存，备用。
2、采用稀释涂布法分离土壤中的真菌，防风根际土土样风干后称取10g放入装有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中，震荡摇匀30min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；待土样分散后依次以10倍梯度稀释得到各浓度土壤稀释液；分别取稀释梯度为10-3、10-4和10-5的稀释液各200μL涂布于PDA培养基平板中，在25℃倒置暗培养2～3d，根据菌落生长情况，从不同稀释梯度平板上挑取形状、颜色、大小等不同的单菌斑进行分离纯化，置于4℃冰箱保存备用。
3、以防风根腐病病原菌木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)为靶标菌，采用两点杯碟对峙法对分离出的真菌进行筛选。用8mm打孔器在纯化好的根际真菌与病原菌木贼镰刀菌边缘打孔，将病原菌菌饼接入PDA平板培养皿中心，在距病原菌菌饼25mm的两个对称分别接入从土壤分离得到的真菌，以不接待测真菌只接病原菌为对照，重复3次。置于25℃黑暗下倒置培养7d，计算每株菌株的抑菌率。抑菌率＝(RC-RP)/RC×100％，RC为对照趋势半径，RP为处理趋势半径。
实验结果：
通过稀释涂布法共分离到104株真菌菌株，将分离得到的真菌菌株与木贼镰刀菌做生长对峙实验，筛选出29株对木贼镰刀菌具有抑菌效果的拮抗菌株，其中，菌株MR-47对木贼镰刀菌有较强抑菌效果(见图1)，其抑菌率为69.26％，因此，选定菌株MR-47作为本发明的研究目标菌株。
实施例2桃色顶孢霉MR-47的鉴定
实验方法：
1、选取已纯化的菌株MR-47接种于PDA培养基上，25℃暗培养14d，根据其菌落形态、菌丝直径、孢子大小、形态和着生方式对其进行形态学鉴定，并参照《真菌鉴定手册》初步决定菌株分类地位。
2、采用试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0提取菌株MR-47的基因组总DNA。采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)PCR扩增菌株MR-47的ITS rDNA并进行序列测定。PCR反应体系：Master Mix 12.5μL、ITS11μL、ITS41μL、rDNA 2μL、ddH2O 8.5μL，扩增程序为94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。扩增的PCR产物交由上海生工进行测序，将菌株MR-47的rDNA拼接序列的测定结果用BLAST工具在Gen Bank数据库中进行同源序列对比。利用BLAST的结果，通过MEGA 7.0软件构建菌株MR-47的系统发育树，并将基因序列提交至Gen Bank获得登录号。
实验结果：菌株在PDA培养基中28℃暗培养14d，菌落直径为53-55mm，菌丝密实、绒毡状、无白边，形成环状轮纹，菌落正面淡粉色；背面有放射状皱纹、呈橙褐色，有橙黄色分泌物渗入培养基中(见图2-a)。菌丝无色，产孢瓶体自菌丝侧生，不分枝、细长、近无色，长20-35μm，基部宽1.5-3μm，端部变窄，宽1-2.5μm。分生孢子无色、近球形，直径为3-6μm(见图2-b)。根据菌落及显微形态鉴定该菌株为枝顶孢属。
菌株MR-47的ITS序列长度为476bp(SEQ ID NO.1)。将该序列与Gen Bank数据库中的核酸序列进行同源性比对，发现菌株MR-47与桃色顶孢霉(KT315412.1)的相似度达99.77％。选择相似性较高的菌株的ITS序列构建系统发育树(见图3)，并提交序列获得登录号(OK287149.1)。结合形态特征及ITS系统发育树结果最终确定菌株MR-47为桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)。
3、保藏
本发明所筛选的一株桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47，已于2022年1月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼(广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为：GDMCC No:62209。
实施例3桃色顶孢霉MR-47的抑菌谱
实验方法：
采用平板对峙法测定桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐皮镰刀菌Fusarium solani、恶疫霉Phytophthora cactorum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、细极链格孢Alternariatenuissima、鹅掌楸链格孢Alternaria liriodendra、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans的抑菌谱，具体操作步骤同实施例1中的步骤3。
实验结果：
桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47对9种病原真菌均具有较强抑菌作用，其中对恶疫霉与毁灭柱孢菌的抑制作用最强，达到70％以上，分别为72.22％与74.07％；对立枯丝核菌的抑菌效果较弱，仅40.74％；对其他几种真菌的抑菌率均达到62～70％，表明桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47具有较为广谱的抑菌能力，具有开发成生物抑菌剂的巨大潜质。
实施例4桃色顶孢霉MR-47发酵液对防风木贼镰刀菌菌丝的影响
实验方法：
将待测菌株挑取两个菌饼，接入含有100mL PDB培养基的250mL三角瓶中，于170rpm/min，25℃条件下震荡培养7d。取三层纱布进行过滤，所得滤液经12000rpm/min离心去掉沉淀后，用孔径0.22μm微孔滤膜进行抽滤，即得无菌发酵液。无菌发酵液与木贼镰刀菌对峙培养下，挑取两菌落相交接部位菌丝制成玻片，于显微镜下观察待测菌株发酵液作用后木贼镰刀菌菌丝形态特征。
实验结果：
在光学显微镜下，对照菌丝光滑顺直、粗细均匀(见图4-a)；而与桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47发酵液对峙生长的病原菌菌丝形成断裂、缢缩(见图4-b)、膨大、扭曲畸形、粗细不均(见图4-c)等现象，说明桃色顶孢霉可通过产生代谢产物抑制病原菌生长。
实施例5桃色顶孢霉MR-47在土壤中的定殖能力
实验方法：
利用抗生素标记法标记桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47，在含有5、10、20、40、80、100、150、200和300μg/mL等不同浓度利福平的PDB培养基中对菌株MR-47进行逐级诱导，筛选出抗利福平浓度达300μg/mL的菌株MRRif47，经遗传稳定性和生防稳定性检测后保存、备用。收集标记菌株MRRif47分生孢子(1×108CFU/mL)拌土，每盆土300g，孢子悬液30mL，设置3组平行。拌土结束后第7、14、21、28、35天分离土壤中的菌株MRRif47。菌株MRRif47的分离：采用梯度稀释法同实施例1中的步骤2，取稀释梯度10-4浓度溶液200μL涂布于含有300μg/mL利福平的PDA培养皿中，3次重复，3天后统计每个培养皿中菌落数量，计算含菌量(CFU/g)。
实验结果：
标记菌株MRRif-47接种10代后可稳定生长于含300μg/mL利福平的PDA培养基中，且较菌株MR-47的形态变化不明显，表明标记菌株MRRif-47具有遗传稳定性。将标记菌株MRRif-47与防风木贼镰刀菌对峙培养5d后，抑菌率大于60％，说明利福平标记对菌株的抑菌能力无显著影响。标记菌株MRRif-47在土壤中随定殖时间的延长，菌落数呈先下降后上升并最终下降的趋势(见图5)。第21d含菌量最低，为5.57×106CFU/g，而第28d含菌量最大，达到8.38×106CFU/g，并于第35d土壤中活菌量仍可保持较高水平，表明菌株MR-47具备定殖能力，可将其应用于盆栽防病研究。
实施例6桃色顶孢霉MR-47对盆栽防风的防病促生效果研究
实验方法：
挑选长势均匀健康的1年生防风幼苗，栽入育苗钵中。分别刮取25℃PDA平板上培养10d的病原菌木贼镰刀菌与桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47培养物，制成孢子悬液，调整其浓度为1×107CFU/mL。在根部及茎基部划伤口接种病原菌10mL，之后接种桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47孢子悬液10mL，以接种清水为阴性对照，以接种多菌灵500倍液50mL、枯草芽孢杆菌可湿性粉剂50mL、哈茨木霉粉剂50mL为阳性对照。接种30d取出植株并清洗根部，观察植株病情并计算病情指数与防效，同时测定防风株高、根长、株鲜重、根鲜重、株干重、根干重等生长指标。
防风根腐病发病分为9级。0级：健株，无病斑；1级：全株10％以下的叶片发病；3级：全株11～25％的叶片发病；5级：全株26～50％的叶片发病；7级：全株51～75％的叶片发病；9级：全株76％以上的叶片发病。
病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100；
防治效果＝(对照病情指-处理病情指数)/对照病情指数×100％。
实验结果：
菌株MR-47对防风根腐病的盆栽防治效果(见表1)表明，与阴性对照相比，采用灌根的方法接种菌株MR-47和农药代森锰锌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉后，发病率和发病程度均显著降低。1×107CFU/mL浓度的菌株MR-47发酵孢子液对防风根腐病防治效果达到75.05％，病情指数为16。农药枯草芽孢杆菌对防风根腐病防效为49.99％，明显低于菌株MR-47，具有显著差异。说明菌株MR-47对防风根腐病具有显著的防治效果。
表1菌株MR-47对防风根腐病盆栽防效
处理 用量/mL 病情指数 防效/％
CK 50 64.14±2.18a
70％代森锰锌 800倍稀释液50 24.66±2.11c 61.54±3.3b
10亿/g枯草芽孢杆菌 100倍稀释液50 32.07±5.66b 49.99±8.82b
10亿/g哈茨木霉 100倍稀释液50 30.85±4.29bc 51.89±6.7b
0.1亿/g菌株MR-47孢子 10 16±4.23d 75.05±6.6a
表中数据为8次重复的平均值±标准误，不同小写字母，表示不同处理防风防病效果差异显著(LSD法，P>0.05)；并且接种处理30d后，各处理组防风的生长情况(见表2)表明，与对照相比，菌株MR-47显著促进了防风的株高以及根鲜重的生长，而对防风根长生长及株鲜重、株干重、根干重无明显促进作用。
表2不同处理对防风盆栽促生效果
Figure BDA0003536050720000091
表中数据为8次重复的平均值±标准误，不同小写字母，表示差异显著(LSD法，P>0.05)。
综合可见，桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)MR-47对盆栽防风的防病促生效果明显高于其他农药。因此，以桃色顶孢霉的菌体、发酵孢子液、发酵代谢产物以及发酵粗提物可开发成生物抑菌剂，用于防风等药用植物生产的绿色农药。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 一株桃色顶孢霉MR-47及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 476
<212> DNA
<213> 人工(DNA)
<400> 1
ctcccaaccc ctgtgacata cctactgttg cttcggcggg accgccccgg caggcgcccg 60
ccggggacat caaactcttg attgttatag tggcattctc tgagtaaaac atacaaataa 120
gtcaaaactt tcaacaacgg atctcttggc tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg 180
cgataagtaa tgcgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg 240
cccgctagta ttctggcggg catgcctgtc tgagcgtcat ttcaaccctc gcccccggct 300
ttttgctggg agcggtgttg gggatcggcc gcccgtcact gggaggccgg ccccgaaata 360
gagtggcgac cacgccgtgt gctcctctgc gtagtagtaa atcacctcgc aggcggacag 420
cggtgcggcc tgccgtaaaa cccccaactc tttctggtga cctcagatca ggtaga 476

Claims (5)

1.一株桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）MR-47，其特征在于，该桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）MR-47已于2022年1月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No : 62209。
2.如权利要求1所述的一株桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）MR-47在制备用于抑制植物病原菌的生物抑菌剂中的应用，其特征在于，所述植物病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、腐皮镰刀菌（Fusarium  solani）、细极链格孢（Alternaria tenuissima）、鹅掌楸链格孢（Alternaria  liriodendra）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon  destructans）、恶疫霉（Phytophthora cactorum）或灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物抑菌剂的活性成分为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）MR-47的菌体或发酵孢子液。
4.如权利要求1所述的一株桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）MR-47在防治防风根腐病病原菌木贼镰刀菌中的应用。
5.如权利要求1所述的一株桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）MR-47在促进防风植株生长中的应用。
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