CN113502228B

CN113502228B - 微紫青霉菌株、生防剂及应用

Info

Publication number: CN113502228B
Application number: CN202110691176.6A
Authority: CN
Inventors: 尹燕妮; 商庆华; 王宁; 陈云; 马忠华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2041-06-22
Also published as: CN113502228A

Abstract

本发明公开了一种微紫青霉菌株、生防剂及应用。所述微紫青霉菌株的分类命名为微紫青霉(Penicillium janthinellum)PJ1114，保藏号为CGMCC N o.22401。所述微紫青霉菌株PJ1114对禾谷镰刀菌孢子萌发、菌丝生长以及呕吐毒素产量均有较强的抑制作用，可用于小麦赤霉病的防治；利用微紫青霉菌株PJ1114开发的生防剂或生物农药具有很好的应用前景。

Description

微紫青霉菌株、生防剂及应用

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，特别是涉及微紫青霉菌株、生防剂及应用。

背景技术

小麦是世界三大粮食作物之一，是全球范围内种植面积最广泛的粮食作物。在我国，小麦是第二大粮食作物，其种植面积约2400万公顷，总产量约1.2亿吨，是我国半数国民的粮食来源，在国名经济中有着举足轻重的地位。因此，保障小麦的产量和质量，对我国的粮食生产与国民经济具有重大意义。

赤霉病是小麦上的一种流行性、毁灭性真菌病害，主要是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和亚洲镰刀菌(Fusarium asiaticum)引起，禾谷镰刀菌主要分布在黄淮流域及其北部的地区，亚洲镰刀菌主要分布于长江中下流地区。小麦赤霉病一般流行年份可引起10％-30％的产量损失，大流行年份甚至会造成小麦绝收。此外，小麦赤霉病菌在侵染过程以及麦粒储藏期间会产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)等真菌毒素，严重危害粮食安全，人畜生命健康。

目前，小麦赤霉病的防治主要包括培育抗病品种、化学防治和生物防治。其中，培育抗病品种是防治小麦赤霉病最直接、有效的措施，但是小麦赤霉病的抗性是由多基因控制的数量性状，抗赤霉病的小麦品种选育一直是世界性难题；化学防治主要以多菌灵、戊唑醇和氰烯菌酯等化学农药为主，但随着化学农药的大量使用，抗药性问题日益突出，不但使得赤霉病难以控制，还造成环境污染等问题；生物防治具有不易产生抗性、持效期长、对环境污染小、对农作物和人畜安全等优点。因此，利用生防菌株及其代谢物防治小麦赤霉病有助于提高小麦产量，保障小麦的安全，具有经济和生态双重效益。目前，小麦赤霉病的生防研究主要集中在芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和木霉菌(Trichoderma spp.)等微生物。

发明内容

本发明旨在解决小麦赤霉病的防治困难问题，提供了一株微紫青霉菌株、生防剂及应用。所述微紫青霉菌株PJ1114对禾谷镰刀菌孢子萌发、菌丝生长以及呕吐毒素产量均有较强的抑制作用，可用于小麦赤霉病的防治；利用微紫青霉菌株PJ1114开发的生防剂或生物农药具有很好的应用前景。

本发明提供的微紫青霉菌株，分离于安徽省宿州市萧县小麦玉米轮作区植株根际土壤，分类命名为微紫青霉(Penicillium janthinellum)PJ1114，保藏时间为2021年4月9日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N o.22401。

可选的，所述的微紫青霉菌株在防治小麦赤霉病中的应用。

可选的，所述的微紫青霉菌株在抑制禾谷镰刀菌、禾谷丝核菌、禾顶囊壳菌、稻平脐蠕孢菌、坎诺单孢菌、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢菌菌丝生长中的应用。

可选的，所述微紫青霉菌株在抑制禾谷镰刀菌孢子萌发中的应用。

可选的，所述微紫青霉菌株在减少呕吐毒素中的应用。

本发明还提供了一种生防剂，包含所述微紫青霉菌株的发酵液粗提物。

可选的，所述发酵液粗提物通过以下方法制得：

提供所述微紫青霉菌株的发酵液；

将所述发酵液过滤，取滤液进行萃取和蒸发，得到发酵液粗提物；

可选的，所述生防剂还包括溶剂，所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水中的一种或多种。

可选的，将活化的微紫青霉菌株接种于发酵培养液中下培养10～15天，得到所述发酵液。

可选的，活化方法包括：

将微紫青霉菌株从PDA斜面培养基中转接至PDA平板，25℃恒温培养4天后，再转接一代，得到活化的微紫青霉菌株。

可选的，所述发酵培养液为PDB培养液。

可选的，所述生防剂还包括溶剂，所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水中一种或多种。

本发明还提供了防治小麦赤霉病的方法，在小麦抽穗阶段，将所述生防剂稀释后喷施于小麦穗部。

可选的，所述生防剂稀释后的浓度为100-200mg/L。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：

本发明提供了一株微紫青霉PJ1114，该菌株对小麦赤霉病的病原菌具有显著的抑制效果，在平板对峙试验中，能有效抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长；其发酵液提取物能够高效抑制禾谷镰刀菌孢子萌发以及减少呕吐毒素的产生；微紫青霉PJ1114对小麦无致病力，可用于开发针对小麦赤霉病的生物农药或生防剂。

附图说明

图1为菌株PJ1114的菌落形态观察图；

图2为微紫青霉PJ1114的系统发育树；

图3为微紫青霉PJ1114与禾谷镰刀菌的平板对峙试验的结果图，A：禾谷镰刀菌，B：(B1)为禾谷镰刀菌，(B2)为微紫青霉PJ1114；

图4为生防剂对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响结果图，A：不加生防剂，B：实施例4制备的生防剂；

图5为生防剂对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响结果图，A：不加生防剂，B实施例4制备的生防剂；

图6为生防剂对禾谷镰刀菌产呕吐毒素的影响结果图，A：加入甲醇，B：实施例4制备的生防剂；

图7为生防剂对小麦赤霉病的防治效果图，A：小麦穗部喷施清水，B：小实施例4制备的生防剂；

图8微紫青霉PJ1114与其他六种植物致病菌的平板对峙试验的结果图，A：六种致病菌单独培养，其中A1为禾谷丝核菌，A2为禾顶囊壳菌，A3为稻平脐蠕孢菌，A4为坎诺单孢菌；A5为尖孢镰刀菌；A6为灰葡萄孢菌；B：微紫青霉PJ1114与六种致病菌对峙培养。

图9为生防剂对六种植物致病菌菌丝生长的影响图，A：不加生防剂的培养基中单独培养的六种致病菌，其中A1为禾谷丝核菌，A2为禾顶囊壳菌，A3为稻平脐蠕孢菌，A4为坎诺单孢菌；A5为尖孢镰刀菌；A6为灰葡萄孢菌；B：培养基中加入实施例4制备的生防剂。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但本发明不仅限于此。

以下实施例涉及的培养基和试剂组分包括：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉12g，去离子水1L，121℃灭菌20min，自然pH。

马铃薯葡萄糖培养液(PDB培养液)：马铃薯200g，葡萄糖20g，去离子水1L，121℃灭菌20min，自然pH。

YEPD培养液的配制：蛋白胨10g，酵母提取物3g，葡萄糖20g，去离子水定容至1L，pH6.7。

CMC培养液的制备：CMC-Na 15g，酵母膏1g，NH₄NO₃ 1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，去离子水定容至1L。

TBI诱导产毒培养液的配制：蔗糖30g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，腐胺酸盐1.47g，Trace element 200μL，去离子水定容至1L。

实施例1菌株的分离、纯化及筛选

称取1g安徽省宿州市萧县小麦玉米轮作区田间根际土壤样品加入到10mL氯化钠溶液(浓度为0.7mol/L)中，将溶液进行震荡处理1min，混匀后制成土壤悬液，再将土壤悬液用0.7mol/L的氯化钠溶液稀释至10^-1、10^-2、10^-3三个梯度。

吸取1mL的稀释土壤悬液并均匀涂布到PDA平板中，每个梯度涂布3个平板；待PDA平板干燥后，将其置于25℃恒温培养箱中进行培养。每隔24h，挑取出新长出的单菌落，并将其接到PDA平板上进行纯化培养，得到的纯化菌株在4℃无菌环境中进行保存备用，并根据采集地区进行分类、编号。

用内径为6mm的打孔器在土壤中分离的菌株外圈打孔，并接种至直径为9cm PDA平板的一侧，在平板另一侧接种直径为6mm禾谷镰刀菌PH-1菌碟。菌株与禾谷镰刀菌之间的间隔约为6cm。以PDA平板一侧接种禾谷镰刀菌PH-1菌碟另一侧不做处理为阴性对照。菌株放置在25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，7d后观察其抑菌带宽度，并计算菌株对禾谷镰刀菌菌丝生长抑制率的大小。菌丝生长抑制率(％)＝(对照组PH-1菌落直径-处理组PH-1菌落直径)/对照组PH-1菌落直径×100％。其中一株编号为PJ1114的菌株在平板对峙试验中有明显抑制禾谷镰刀菌菌丝生长的作用。

实施例2菌株PJ1114的形态学观察和鉴定

参见图1，菌株PJ1114在PDA平板上恒温(25℃)培养7天后，其菌落生长初期为白色，后逐渐变为青灰色，背面为黄色，扩展过程中菌落边缘有一圈白色菌丝，产生大量分子孢子，呈散射状。

采用真菌ITS测序法对菌株进行测序鉴定，所用引物为真菌通用引物ITS1(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)(SEQ ID NO：1)和ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，)(SEQ IDNO：2)。PCR扩增反应体系为25μL：ddH2O 8μL，Taq Mix 12.5μL，ITS1引物1μL，ITS4引物1μL，DNA模板2.5μL。PCR反应程序为94℃2min；94℃30s，58℃100s，72℃60s，15个循环；16℃保存。PCR扩增产物送至杭州擎科生物科技公司进行序列分析，序列结果如下：

cctgcggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtttatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgcctcacggccgccggggggcacccgcccccgggcccgcgcccgccgaagacaccattgaactctgtctgaagattgcagtctgagcgattagctaaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgcccctccccccgggggggcgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggcttcgtcacccgctctgtaggcccggccggcgcccgccggcgaccccaatcaatctttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataaagccggaggaagttaccgagtgaggg(SEQ IDNO：3)

测序结果在NCBI上进行Blast对比分析并建立系统发育进化树，参见图2，可知其与微紫青霉(Penicillium janthinellum)高度同源，鉴定该菌株为微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)，分类命名为微紫青霉PJ1114，并将其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N o.22401。

实施例3微紫青霉PJ1114与禾谷镰刀菌的平板对峙试验

用内径为6.0mm的打孔器在已活化好的微紫青霉PJ1114外圈打孔，并接种至直径为9cm PDA平板的一侧，在平板另一侧接种直径为6.0mm禾谷镰刀菌PH-1菌碟。微紫青霉菌与禾谷镰刀菌之间的间隔约为6.0cm。以PDA平板一侧接种禾谷镰刀菌PH-1菌碟另一侧不做处理为阴性对照，重复3次。菌株放置在25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，7d后观察其抑菌带宽度，并计算微紫青霉对禾谷镰刀菌菌丝生长抑制率的大小。菌丝生长抑制率(％)＝(对照组PH-1菌落直径-处理组PH-1菌落直径)/对照组PH-1菌落直径×100％。

如图3所示，微紫青霉PJ1114(B2)在与禾谷镰刀菌PH-1(B1)的平板对峙试验中，对禾谷镰刀菌的菌丝抑制率为52.31％。

实施例4生防剂的制备

选择PDB培养液作为微紫青霉PJ1114的发酵培养液，用内径为5.5mm的打孔器在已活化好的微紫青霉菌株外圈打孔，得到5个菌饼；将菌饼接种于装有500mLPDB的1000mL锥形瓶中，随后在25℃，180rpm摇床中培养15d；用四层纱布过滤除去菌球，得到微紫青霉菌抗菌次级代谢产物发酵液；发酵液用乙酸乙酯等体积萃取3次，保留乙酸乙酯层；随后浓缩得到乙酸乙酯层浸膏，即为发酵液粗提物；将发酵液粗提物用2mL甲醇进行溶解，即得到浓度约为200mg/mL的生防剂。

实施例5生防剂对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响

吸取100μL实施例4制备的生防剂加入到40mL PDA培养基中，充分混匀后，均匀倒入直径为9cm的平板中，重复3次。待PDA冷却凝固后，用内径为6mm的打孔器在已纯化的禾谷镰刀菌PH-1外圈打孔，挑取菌碟接种至PDA平板中央。以等体积甲醇作为阴性对照。平板放置于25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，3d后观察PH-1菌丝生长宽度，并计算生防剂对禾谷镰刀菌菌丝生长抑制率的大小。

如图4所示，表明生防剂对禾谷镰刀菌菌丝的生长有显著的抑制作用，菌丝抑制率为96.52％。

实施例6生防剂对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响

禾谷镰刀菌PH-1孢子的制备：用内径为6mm的打孔器在已纯化的禾谷镰刀菌PH-1外圈打孔，挑取5个菌碟，接种至含有150mLCMC培养液的锥形瓶中。将产孢培养液放置在28℃，180rpm摇床中培养3d。用三层滤纸过滤去除菌丝体，所得培养液5000rpm离心10min，去除上清液后，即得到禾谷镰刀菌PH-1孢子。

取100μL终浓度为10⁵个/mL的禾谷镰刀菌PH-1的孢子悬液，向其加入1μL生防剂作为实验组，以不加生防剂为对照组(CK)，每个处理组各取20μL孢子悬浮液置于载玻片上(作5次重复)；玻片置于保湿盒中25℃静止培养，4小时后观察各处理组的孢子萌发情况，计算萌发率。

如图5所示，在不加生防剂的对照组中(图5A)，禾谷镰刀菌PH-1孢子萌发率超过90％，在加入生防剂的试验组中(图5B)，禾谷镰刀菌PH-1孢子不萌发，萌发率为0％。该试验结果表明，微紫青霉菌株PJ1114的发酵产物能够有效抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发。

实施例7生防剂对禾谷镰刀菌产DON毒素的影响

用灭菌的牙签戳取禾谷镰刀菌PH-1菌落边缘的菌球，并接种于YEPD培养液中，25℃，180rpm下培养24h。吸取1mL禾谷镰刀菌PH-1小菌球至2mL离心管中，45Hz研磨60s。随后，吸取1mL研磨后的样品至30mL TBI诱导产毒培养液中，并加入30μL实施例4制备的生防剂，28℃，150rpm摇培7天后，测定呕吐毒素的产量。以等体积甲醇作为阴性对照(CK)。DON毒素检测使用江苏维赛科技生物发展有限公司提供的呕吐毒素(DON)酶联免疫检测试剂盒。

试验结果如图6所示，加入等体积甲醇的对照组中PH-1呕吐毒素平均产量为3467.44μg/g；加入生防剂的试验组中，PH-1呕吐毒素平均产量为707.49μg/g。试验结果表明，微紫青霉菌株PJ1114的发酵产物能高效抑制禾谷镰刀菌DON毒素的产生。

实施例8小麦赤霉病防治试验

取抽穗期小麦，将其茎部置于水中保湿，向其穗部表面喷施稀释1000倍的生防剂，即100ml水中加入100μL生防剂，以喷施100ml无菌水作为对照。25℃保湿培养一天后，向小麦穗部中间的一片颖片内注射10μL浓度为5×10⁵个/ml的禾谷镰刀菌孢子。恒温加湿培养5天后，观察小麦穗部赤霉病发病情况并计算病害指数。病害严重度的分级标准：1级，病穗占全穗的1/4以下；2级，病穗占全穗的1/4-l/2；3级，病穗占全穗的1/2-3/4；4级，病穗占全穗的3/4以上。病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100％。

试验结果如图7所示，微紫青霉生防剂在小麦穗部试验中能有效防止小麦赤霉病的发生，其中，对照组A的病情指数为88.33％，微紫青霉生防剂处理组B的病情指数为21.67％。试验结果表明，微紫青霉菌株PJ1114的生防剂能高效抑制禾谷镰刀菌孢子在小麦穗部的侵染。

实施例9微紫青霉PJ1114对六种植物致病菌的拮抗效果试验

参照实施例3的试验方法，将微紫青霉PJ1114菌株与小麦纹枯病菌—禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦全蚀病菌—禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces graminis)、水稻胡麻叶斑病菌—稻平脐蠕孢菌(Bipolaris oryzae)、甜瓜黑点根腐病菌—坎诺单孢菌(Monosporascus cannonballus)、大豆根腐病菌—尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、草莓灰霉病菌—灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)进行对峙试验。菌株放置在25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，7d后观察其抑菌效果。试验结果如图8所示，相较于病原菌单独培养对照组(图8A)，对峙试验组(图8B)中的六种病原菌菌丝生长受到抑制，有明显的抑菌带。

参照实施例5的试验方法，测试生防剂对六种植物致病菌菌丝生长的影响。

吸取100μL实施例4制备的生防剂加入到40mL PDA培养基中，充分混匀后，均匀倒入直径为9cm的平板中，待平板冷却后，在其中央接种直径为0.6cm的植物致病菌菌碟。试验重复三次，以不加生防剂的PDA平板为对照。平板放置于25℃，光周期12h的培养箱中进行培养，待对照组病原菌菌丝生长到平板边缘后，观察各组菌丝生长宽度，并计算生防剂对不同植物致病菌菌丝生长抑制率的大小。

试验结果如图9所示，相较于对照组(图9A)，加入生防剂的实验组(图9B)六种植物致病菌的菌丝生长缓慢，生防剂对禾谷丝核菌(A1)、禾顶囊壳菌(A2)、稻平脐蠕孢菌(A3)、坎诺单孢菌(A4)、尖孢镰刀菌(A5)和灰葡萄孢菌(A6)菌丝生长均具有显著的抑制作用，菌丝抑制率菌分别为91.89％、88.72％、91.51％、90.98％、91.33％、85.96％。

本发明针对小麦赤霉病防治困难的现状，筛选出一株有效防治小麦赤霉病病的微紫青霉菌株，且其发酵产物能够高效抑制禾谷镰刀菌孢子萌发以及减少呕吐毒素的产生；利用该菌株开发的生防剂或生物农药具有很好的应用前景。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 微紫青霉菌株、生防剂及应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

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<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 592

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

cctgcggaag gatcattacc gagtgagggc cctctgggtc caacctccca cccgtgttta 60

tcgtaccttg ttgcttcggc gggcccgcct cacggccgcc ggggggcacc cgcccccggg 120

cccgcgcccg ccgaagacac cattgaactc tgtctgaaga ttgcagtctg agcgattagc 180

taaatcagtt aaaactttca acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag 240

cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca 300

cattgcgccc cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc tgccctcaag 360

cacggcttgt gtgttgggcc cccgcccctc cccccggggg ggcgggcccg aaaggcagcg 420

gcggcaccgc gtccggtcct cgagcgtatg gggcttcgtc acccgctctg taggcccggc 480

cggcgcccgc cggcgacccc aatcaatctt tccaggttga cctcggatca ggtagggata 540

cccgctgaac ttaagcatat caataaagcc ggaggaagtt accgagtgag gg 592

Claims

1.微紫青霉菌株，其特征在于，分类命名为微紫青霉(Penicillium janthinellum)PJ1114，保藏号为CGMCC No.22401。

2.生防剂，其特征在于，包含如权利要求1所述微紫青霉菌株的发酵液粗提物；

所述发酵液粗提物通过以下方法制得：

提供所述微紫青霉菌株的发酵液；

用纱布将所述发酵液过滤，取滤液进行萃取和蒸发，得到发酵液粗提物；

萃取剂为乙酸乙酯。

3.根据权利要求2所述的生防剂，其特征在于，还包括溶剂，所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水中一种或多种。

4.防治小麦赤霉病的方法，其特征在于，在小麦抽穗阶段，将权利要求2所述生防剂稀释后喷施于小麦穗部。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生防剂稀释后的浓度为100-200mg/L。

6.根据权利要求1所述的微紫青霉菌株在防治小麦赤霉病的应用。

7.根据权利要求1所述的微紫青霉菌株在抑制禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces graminis)、稻平脐蠕孢菌(Bipolaris oryzae)、坎诺单孢菌(Monosporascus cannonballus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)菌丝生长中的应用。

8.根据权利要求1所述微紫青霉菌株在抑制禾谷镰刀菌孢子萌发中的应用。

9.根据权利要求1所述的微紫青霉菌株在减少禾谷镰刀菌产生呕吐毒素中的应用。