CN110396477B - 一株适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株、菌剂及其应用 - Google Patents

一株适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株、菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株(Trichoderma asperellum)M45a，保藏编号为CCTCC NO:M2019513。该菌株比其他种类的木霉，其耐恶霉灵的能力显著提高，可丰富西瓜枯萎病生物防治菌种资源，应用前景广阔。本发明还发现恶霉灵与木霉菌M45a的协同防治策略上有增效效应，而且恶霉灵的用量相较于现有技术中其他复配菌剂中的用量要显著减少，能实现减少化学杀菌剂对环境的污染目标，表明该菌及其菌剂在生物农药、微生物制剂等相关领域具有较好的开发应用前景。本发明对西瓜等瓜类连作障碍的解决具有重要的理论与现实意义。

Description

一株适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株、菌 剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物及防治病虫害技术领域，具体涉及一株适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株、菌剂及其应用。
背景技术
木霉菌(Trichoderma)属于半知菌门丝孢目，被国际上普遍认为是一种有益生防真菌，广泛存在于土壤，腐烂的木材及蔬菜基质中。木霉菌生存能力强，适应性广，具有对多种植物病原菌的拮抗作用，可防治各类植物的土传病害和部分叶部病害，增强植物抗逆性和修复农化污染的环境，在发展可持续农业中具有越来越重要的作用。目前国际上五大洲60多个国家在使用含有木霉菌成分的生物制剂及生物有机肥，具有安全、环保、绿色的生态优势，但易受到田间复杂环境的影响，存在防效稳定性差、发挥作用慢等问题。近年来建立的生物－化学协同防治策略，既能减少化学杀菌剂对环境的污染，又能提高生物防效的稳定性，在植物病害防治领域得到了广泛而深入的研究，并取得了较好的成效。
恶霉灵是一种化学杀菌剂和土壤消毒剂，在进入土壤后被土壤吸收并有效抑制孢子的萌发和病原真菌菌丝体的正常生长或直接杀灭病菌，目前广泛应用于作物枯萎病的防控技术体系中。生防木霉菌和化学杀菌剂恶霉灵对西瓜枯萎病的防治均有一定的效果，若二者可以协同作用，彼此没有明显干扰，预计生防效果会显著提高，对连作障碍中西瓜枯萎病防控问题的解决具有重要的意义。
而现有的一些木霉菌株其耐受恶霉灵的能力普遍不强，EC50值越高表示越耐受恶霉灵，但是耐受好的菌株并不一定就好，因为耐受好的一般产孢能力差，而生防过程中需要产孢能力和拮抗恶霉灵效果均优良的菌株。本发明通过诱变获得的新菌株不仅耐受恶霉灵浓度高，产孢能力强，更重要的是发现了该新菌株与恶霉灵复配之后，大大增加了枯萎病的防治效果，同时还能大幅度减少恶霉灵的用量，符合绿色生物防治的理念，具有广阔的应用前景。
发明内容
目前，西瓜枯萎病成为西瓜生产中最为严重的病害之一。基于现有技术，木霉的理论研究和实际应用中均需要能对恶霉灵具有耐药性的拮抗木霉菌，实现恶霉灵与木霉菌协同增效防控西瓜枯萎病的方法。本发明正是基于上述技术问题，运用EMS诱变技术筛选获得耐恶霉灵的木霉突变菌株，可丰富西瓜枯萎病生物防治菌种资源，为挖掘探明木霉-化学杀菌剂的互作协同增效机制奠定了基础。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一株适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株(Trichodermaasperellum)M45a，保藏编号为CCTCC NO:M2019513。
所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株，耐受恶霉灵的浓度为1000μg/mL。
进一步的，耐受恶霉灵的浓度为800μg/mL。
更进一步的，耐受恶霉灵的浓度为400μg/mL。
最优选的，耐受恶霉灵的浓度为100μg/mL。
本发明的第二个目的是提供上述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株与恶霉灵复配的制剂，复配液中含有浓度80-150μg/mL的恶霉灵与浓度为105-106cfu/mL的木霉孢子，优选100-150μg/mL的恶霉灵，进一步优选100-120μg/mL的恶霉灵，最优选100μg/mL的恶霉灵。
本发明的第三个目的是提供上述适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株：棘孢木霉突变菌株M45a与恶霉灵协同防控枯萎病技术中的应用。
具体将所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株与恶霉灵复配联用协同防控枯萎病。
所述病害包括西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病和甜瓜枯萎病。
复配液中含有浓度80-150μg/mL的恶霉灵与浓度为105-106cfu/mL的木霉孢子，优选100-150μg/mL的恶霉灵，进一步优选100-120μg/mL的恶霉灵，最优选100μg/mL的恶霉灵。
所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株的应用，复配液与育苗基质质量比为1:10-1:20。
本发明可以将含有M45a的菌丝体、菌饼、发酵液、菌体裂解液或孢子悬液的复配菌剂接种至西瓜的根、茎、叶片上，菌剂中孢子浓度为105-106cfu/ml。
本发明的具有适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)M45a(图1)，已于2019年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M2019513。
所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)M45a通过下述方法获得：
(1)木霉突变体的获取
选取长沙市高桥镇6年连作西瓜根际土壤中分离获得的一株高拮抗尖孢镰刀菌西瓜专化型木霉菌T45，在PDA培养基培养7d后稀释调整至106-107cfu/ml孢子浓度；取EMS溶液(PH为7.0、浓度0.4M)100uL和50uL上述孢子悬液在已灭菌的1.5mL EP管中充分混合，避光震荡处理4.5h，处理温度28℃，处理完毕后，加入50uL的终止剂终止诱变反应；将处理后的孢子悬液涂布于含200ug/ml恶霉灵有效成分的PDA平板上，放置28℃培养2-3d，挑选生长势强的单菌落，5次传代培养。
(2)木霉突变体对峙培养
利用平板对峙法，将木霉菌、尖孢镰刀菌分别接种于PDA培养基平板中，将平板放于28℃培养箱中活化培养72h，然后用打孔器分别取0.5cm在PDA平板上对峙培养，平板直径为90mm，两个菌接种距离50mm，各设3次重复，28℃培养5d，然后测量菌落半径，木霉菌对尖孢镰刀菌的相对生防活性用下面的公式表示：
抑制率(％)Ir＝(R-Ri)/R×100，
R：对照枯萎病菌的生长半径，
Ri：木霉菌对峙培养时枯萎病菌的生长半径。
(3)恶霉灵对木霉突变体产孢能力影响
利用血球计数板稀释同等浓度候选木霉突变株分别置于恶霉灵含量浓度为50、100、200、400、800和1000ug/ml的PD培养基上，以不含恶霉灵为对照，三次重复，28℃280rmp/min条件下，培养7天，采用血球计数法测量木霉的产孢数，确定恶霉灵对不同突变体产孢能力影响。
(4)木霉突变体与恶霉灵复配最适浓度筛选
利用打孔器取镰刀菌FON-10.5mm菌饼，分别和候选木霉突变株0.5mm菌饼置于恶霉灵含量浓度为50、100、200、400、800ug/ml的PDA培养基上，菌饼相距50mm，以不含恶霉灵为对照，三次重复，温度28℃，采用十字交叉法测量木霉在不同浓度恶霉灵培养基上菌落直径大小，检测菌体的生长状况并计算其EC50值与协同系数，确定最适复配浓度。
(5)木霉突变体与恶霉灵增效盆栽试验
利用PD培养液中振荡培养7天的木霉菌配置成浓度为106-107cfu/ml孢子悬浮液，备用；采用温室盆栽法，营养土称取6年连作西瓜根际土壤15kg装盆(尖孢镰刀菌西瓜专化型浓度为103cfu/g)，备用；分别加入1000ml恶霉灵(浓度为200μg/mL)、木霉菌M45a孢子悬浮液(浓度106cfu/mL)、恶霉灵(浓度为100μg/mL)与木霉菌M45a孢子悬浮液(浓度106cfu/mL)混合液加入盆栽土中混拌，以加1000ml清水为对照，处理2天；西瓜种子选用主栽感病品种“早佳8424”用55℃温汤浸种30min后催芽，待胚根长至2mm左右时播种，每盆30株，每处理3次重复，播种后第30天调查枯萎病发病情况并计算防治效果。
本发明所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)M45a在PDA培养基平板上，菌落生长旺盛，气生菌丝发达，菌落变为深绿色，菌落背面也白色；生长温度范围为20-35℃，最适生长温度为28℃，pH生长范围为6.0-8.0，最适pH为7.0；该菌株ITS基因序列与最近有效菌株Trichoderma asperellum T15(MN176379.1)的相似率为99.13％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一株耐恶霉灵的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)M45a是通过EMS诱变技术获得的稳定遗传突变体，比较于野生型木霉菌T45，M45a对镰刀菌属的抑菌活性和对化学杀菌剂“恶霉灵”的耐药性分别提高了13.67％和28.71％，比其他种类的木霉，其耐恶霉灵的能力也显著提高，可丰富西瓜枯萎病生物防治菌种资源，应用前景广阔。
本发明发现恶霉灵与木霉菌M45a的协同防治策略上有增效效应，而且恶霉灵的用量相较于现有技术中其他复配菌剂中的用量要显著减少，能实现减少化学杀菌剂对环境的污染目标，表明该菌及其菌剂在生物农药、微生物制剂等相关领域具有较好的开发应用前景。本发明对西瓜等瓜类连作障碍的解决具有重要的理论与现实意义。
为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
附图说明
图1木霉菌T45及其代表突变菌株的菌落形态图。
具体实施方式
实施例1：木霉菌T45突变体的创制
野生型木霉菌T45来源于长沙市高桥镇6年连作西瓜根际土壤中分离获得的一株高拮抗木霉菌。采用EMS诱变技术创制T45突变体：将木霉菌T45于PDA培养基培养7d后稀释调整至106-107cfu/ml孢子浓度；取EMS溶液(PH为7.0、浓度0.4M)100uL和50uL上述孢子悬液在已灭菌的1.5mL EP管中充分混合，避光震荡处理4.5h，处理温度28℃，处理完毕后，加入50uL的终止剂终止诱变反应；将处理后的孢子悬液涂布于含200ug/ml恶霉灵有效成分的PDA平板上，放置28℃培养2-3d，分别记录菌落生长状况，挑选生长势强的单菌落，5次传代培养。
通过EMS诱变结合200ug/ml恶霉灵筛选共获得35株突变型木霉，依据突变体菌丝形态、菌落颜色大致可表现为致密丛束状、束状稀疏有瘠状同心轮纹，绿色，颜色较深，可分为3类突变体类型，分别取生长势最快突变菌株表示为M45a、M22a和M31a(图1)；随着连续5次传代培养，3个突变菌株抗药性均没有消失，其中M45a后代遗传稳定性最好。
实施例2：棘孢木霉Trichoderma asperellum M45a的筛选与鉴定
利用平板对峙法，将木霉菌(突变菌和自然分离菌)、尖孢镰刀菌(FON、FOM和FOC)分别接种于PDA培养基平板中，将平板放于28℃培养箱中活化培养72h，然后用打孔器分别取0.5cm在PDA平板上对峙培养，平板直径为90mm，两个菌接种距离50mm，各设3次重复，28℃培养5d，然后测量菌落半径，木霉菌对尖孢镰刀菌的相对生防活性用下面的公式表示：
抑制率(％)Ir＝(R-Ri)/R×100，
R：对照镰刀菌的生长半径，
Ri：木霉菌对峙培养时镰刀菌的生长半径。
拮抗能力是衡量生防菌株生防效果的重要因素，将获得的3株突变体和分离获得的10个不同种木霉菌株，分别与尖孢镰刀菌西瓜专化型(FON)、尖孢镰刀菌甜瓜专化型(FOM)和尖孢镰刀菌黄瓜专化型(FOC)在PDA平板上进行了对峙培养，5天时木霉菌落生长旺盛，不同的木霉菌对病原菌菌落产生了抑制程度不同。对峙测定结果显示(表1)，突变株M45a拮抗能力最强，对尖孢镰刀菌各专化型抑制率分别达到了85.6％、81.5％和75％，与野生型木霉菌株T45比较，其抑菌率分别提高了13.67％、11.49％和0％。
表1木霉菌对3种枯萎病菌的抑制效果
Figure BDA0002186439030000061
进一步对突变体M45a的形态和分子鉴定显示：M45a在PDA培养基平板上，菌落生长旺盛，气生菌丝发达，菌落变为深绿色，菌落背面也白色；生长温度范围为20-35℃，最适生长温度为28℃，pH生长范围为6.0-8.0，最适pH为7.0；该菌株ITS基因序列与最近有效菌株Trichoderma asperellum T15(MN176379.1)的相似率为99.13％。
实施例3：恶霉灵对木霉菌的产孢影响
利用血球计数板稀释等量木霉菌(起始孢子总量为106cfu)分别置于恶霉灵含量浓度为50、100、200、400、800和1000ug/ml的50ml PD培养基上，以野生菌T45为对照，三次重复，28℃280rmp/min条件下，培养7天，采用血球计数法测量木霉的产孢数，计算各处理产孢总量以确定恶霉灵对不同突变体产孢能力影响。
结果显示(表2)，比较于未添加恶霉灵的处理，1000ug/ml恶霉灵使得木霉T45和M45a的产孢量分别下降了80和45倍数量级，但差异不算显著，而其它菌株产孢量的下降有显著性差异，表明M45a对1000ug/ml浓度的耐药性最佳；尤其在0-400ug/ml恶霉灵作用下，T45和M45a的产孢量能基本维持稳定，表明恶霉灵的田间施用浓度400ug/ml基本不会限制木霉菌产孢能力；同时，突变菌M45a相对于野生型T45在各处理中没有显著性差异，也说明EMS诱变没有对突变株M45a的产孢产生影响，为该菌的应用奠定了基础。
表2恶霉灵对木霉菌株产孢量影响(单位：个)
Figure BDA0002186439030000071
实施例4：木霉突变株M45a对恶霉灵的耐性试验
利用打孔器取0.5mm镰刀菌FON-1分别和木霉代表菌株及突变株M45a菌饼相距50mm，置于恶霉灵含量浓度为50、100、200、400和800ug/ml的PDA培养基上，以不含恶霉灵为对照，三次重复，温度28℃，采用十字交叉法测量木霉在不同浓度恶霉灵培养基上菌落直径大小，检测菌体的生长状况并计算其EC50值与协同系数，确定最适复配浓度。
表3所示镰刀菌FON-1与生防菌木霉T45的EC50值分别为154.88、381.68，突变菌M45a为491.26，均优于其他木霉菌耐药性，特别是比野生型菌T45的耐药性提高了28.71％，呈显著性差异，说明该木霉突变菌株M45a对恶霉灵的抗药性大大增强。其中，低于200ug/ml的恶霉灵作用下，突变菌株M45a的协同系数S值均大于1.5，表明M45a能体现更好的协同增效效应(表4)。
表3木霉菌株对恶霉灵耐性
Figure BDA0002186439030000081
表4木霉菌株与恶霉灵的协同相关性
Figure BDA0002186439030000082
协同系数＝(处理浓度中镰刀菌抑制率-对照中镰刀菌抑制率)/(处理浓度中木霉菌抑制率-对照中木霉抑制率)
协同系数越大，例如：恶霉灵浓度为50μg/mL时，协同系数为10，说明恶霉灵对木霉菌没有抑制效果，同时对镰刀菌也没有抑制效果；系数越小，恶霉灵浓度为400-800μg/mL时，协同系数为0.68和0.59，说明恶霉灵对镰刀菌有抑制效果的同时，也对木霉菌生长造成了一定抑制。
实施例5：木霉菌株与恶霉灵互配对西瓜枯萎病发生的影响
利用PD培养液中振荡培养7天的木霉菌配置成浓度为106-107cfu/ml孢子悬浮液，备用；采用温室盆栽法，营养土称取6年连作西瓜根际土壤15kg装盆(尖孢镰刀菌西瓜专化型浓度为103cfu/g)，备用；分别加入1000ml恶霉灵(浓度为200μg/mL)、各木霉菌孢子悬浮液(浓度106cfu/mL)、恶霉灵(浓度为100μg/mL)与木霉菌孢子悬浮液(浓度106cfu/mL)混合液加入盆栽土中混拌，以加1000ml清水为对照，处理2天；西瓜种子选用主栽感病品种“早佳8424”用55℃温汤浸种30min后催芽，待胚根长至2mm左右时播种，每盆30株，每处理3次重复，播种后第30天调查枯萎病发病情况并计算防治效果。进一步以同样的试验方式筛选不同浓度恶霉灵与木霉孢子悬浮液互配效果。
前期我们做过很多次试验，低于或者高于105-106cfu/ml防治枯萎病效果相对差些。通过设置5个孢子浓度梯度(5×103cfu/ml、5×104cfu/ml、5×105cfu/ml、5×106cfu/ml和5×107cfu/ml)，采取拌发病土的方式，播种30天调查枯萎病发病率，结果显示各浓度处理下90株西瓜的枯萎病发病率分别63.33％、55.56％、35.56％、48.89％和66.67％。
调查30天的发病情况发现：播种后第10天，对照处理植株出现枯萎病；第12天各处理西瓜植株开始发病，而且病情随时间推移逐渐加剧；待第30天时，发病情况趋于稳定，不再出现新的发病植株。由表5可知，6年连作土壤种植西瓜的对照处理枯萎病发病率达到了90％，而恶霉灵与木霉菌M45a联用、恶霉灵、木霉M45a处理土壤对连作西瓜枯萎病的发生具有一定减缓作用。其中，恶霉灵与木霉菌M45a联用处理西瓜枯萎病发病率为15％，相对防效83.33％(由于实验土壤选取6年连作西瓜土壤，土壤条件非常极端，相对防效达到83.33％效果已经非常显著)，其防效显著高于其它处理。通过不同浓度恶霉灵与木霉菌M45a互配发现，说明100μg/mL和200μg/mL恶霉灵对西瓜枯萎病防效差异不显著，但均显著优于50μg/mL恶霉灵；兼顾考虑减药减施效果，100μg/mL恶霉灵与木霉菌M45a的协同效应最佳，可应用于田间西瓜枯萎病的综合防控技术体系。
表5不同处理对连作西瓜枯萎病发生的防治效果
Figure BDA0002186439030000101
发病率＝发病株数/总株数；相对防效＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率。
表6不同浓度恶霉灵与M45a互配对连作西瓜枯萎病发生的防治效果
Figure BDA0002186439030000102
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.一株适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株（Trichoderma asperellum） M45a，保藏编号为CCTCC NO: M2019513。
2.权利要求1所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株与恶霉灵复配的制剂，其特征在于，复配液中含有浓度80-150μg/mL的恶霉灵与浓度为105-106 cfu/mL的木霉孢子。
3.根据权利要求2所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株与恶霉灵复配的制剂，其特征在于，复配液中含有浓度100-150μg/mL的恶霉灵与浓度为105-106 cfu/mL的木霉孢子。
4.权利要求1所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株的应用，其特征在于，将所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株与恶霉灵复配联用协同防控枯萎病。
5.根据权利要求4所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株的应用，其特征在于，复配液中含有浓度80-150μg/mL的恶霉灵与浓度为105-106 cfu/mL的木霉孢子。
6.根据权利要求5所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株的应用，其特征在于，复配液中含有浓度100-150μg/mL的恶霉灵。
7.根据权利要求4所述的适宜与恶霉灵复配防治瓜类枯萎病的木霉突变菌株的应用，其特征在于，复配液与育苗基质质量比为1:10-1:20。
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