CN111349590B

CN111349590B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治马铃薯晚疫病中的应用

Info

Publication number: CN111349590B
Application number: CN202010353837.XA
Authority: CN
Inventors: 李本金; 王荣波; 刘裴清; 林金龙; 陈庆河; 翁启勇
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-04-29
Also published as: CN111349590A

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治马铃薯晚疫病中的应用，属于农作物病害防治技术领域。所述的解淀粉芽孢杆菌菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GZ5，已于2019年11月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.18987。本发明所述解淀粉芽孢杆菌GZ5发酵液可有效抑制马铃薯晚疫病菌的生长。所述菌株GZ5是从福建省光泽县健康番茄根围土壤中获得，与环境相容性好，无毒、无致病性，且抑菌谱广，对马铃薯早疫病菌、马铃薯灰霉菌、枇杷炭疽病菌、核盘菌、金线莲炭疽病菌、金线莲拟盘多毛孢菌、立枯丝核菌、红豆杉叶枯病菌、番石榴焦腐病菌等多种病原菌都有拮抗作用，具有良好的开发应用前景。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治马铃薯晚疫病中的应用

技术领域

本发明涉及一种防治马铃薯晚疫病的生防菌菌株及其应用，属于农作物病害防治技术领域。

背景技术

由晚疫病菌（Phytophthora infestans (Mont)de Bary）侵染引起的晚疫病是马铃薯生产上一种毁灭性的病害，在世界各马铃薯主产区均有发生和流行，严重威胁着马铃薯的生产，其造成的危害、防治难度及对社会影响已超过水稻稻瘟病和小麦条锈病，被视为国际第一大作物病害。晚疫病在我国发生普遍而严重，每年因感晚疫病造成约80亿元人民币的经济损失，已成为限制我国马铃薯生产和实现产业化的第一大障碍。

目前为止，马铃薯晚疫病防治主要还是依赖培育抗病品种和使用化学药剂，其中栽培抗病品种是防治晚疫病最经济、最有效、最简便的方法，但是由于晚疫病菌群体的易变异致使很多抗病品种逐渐丧失了原有的抗性，而在短时间内选育出具有水平抗疫病的新品种是非常困难的。农药对农业的发展虽然起着重要的作用，但随着社会的发展，伴随化学农药引起的安全及环境问题也日益凸现。使用化学农药不仅缺乏长期的有效性，而且对食品和环境的污染、对人类健康潜在的危害、对非靶标生物的影响，以及导致病原菌抗药性产生等问题，现已受到越来越多的质疑。在当今人们越来越关注自己的生存环境，以及越来越提倡绿色生活的时代，探索有效的生防措施无疑具有重大的理论和现实意义。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)广泛分布在自然界中，易于分离培养，并且具有广谱的抗菌活性，不污染环境，对人畜无毒，抗逆能力强，稳定性好。它能够产生多类高效的活性代谢产物，有效地抑制真菌和其它细菌的活性，同时促进植物生长并诱导生物体自身产生抗性，多方面控制植物病原菌的生长和对生物体的侵害作用。目前该菌已广泛应用于水果、蔬菜、花卉等各种农作物病害防治，但其用于防治晚疫病的研究则鲜有报道。本实验室前期分离获得了一株具有生防作用的解淀粉芽孢杆菌GZ5，研究其活体及发酵液对马铃薯晚疫病病菌菌丝生长抑制作用，并通过盆栽试验测定该菌株发酵液对马铃薯晚疫病的防治效果，研究结果为马铃薯晚疫病的生物防治和该生防菌的深入开发应用提供实践依据。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前马铃薯晚疫病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治马铃薯晚疫病中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一株解淀粉芽孢杆菌，经形态观察、培养特征观察和分子生物学研究鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) GZ5，已于2019年11月21月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.18987。

解淀粉芽孢杆菌GZ5发酵液的制备过程如下：

将所述的菌株接种于LB液体培养基中37℃，180 r/min，培养24 h，制成种子液，取10 mL种子液接种于发酵培养基中。经优化后得到的发酵培养基配方为：10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、5 g氯化钠和15 g琼脂粉加蒸馏水定容至1000 mL，溶解并调pH为7.0-7.2。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量5%(v/v)、装瓶量100mL /250mL，发酵培养基pH值7.0-7.2，37℃，180 r/min，培养48 h，制成浓度约为10⁸CFU/ml的菌株GZ5发酵液。

所述解淀粉芽孢杆菌菌株在防治马铃薯晚疫病中的应用：

其应用方式有以下两种：

1）在马铃薯幼苗期或成株期灌根使用：在马铃薯幼苗期或成株期连续使用2~3次，每次间隔7~10 d；

2）与有机肥混合制成菌肥使用。

所述的解淀粉芽孢杆菌菌株在防治马铃薯早疫病菌、马铃薯灰霉菌、枇杷炭疽病菌、核盘菌、金线莲炭疽病菌、金线莲拟盘多毛孢菌、立枯丝核菌、红豆杉叶枯病菌、番石榴焦腐病菌引起病害中的应用。

本发明有益效果：

1、本发明筛选出的解淀粉芽孢杆菌GZ5抑制作用强，能够明显抑制马铃薯晚疫病菌的生长。由于该菌株分离自福建省光泽县番茄根围土壤，与土壤生态和谐相容，且是生物制剂，因此没有化学农药使用带来的一系列问题，可减少农业污染，且能有效防治马铃薯晚疫病。

2、本发明筛选出的解淀粉芽孢杆菌GZ5抑菌谱广，对多种病原菌具有抑制作用，如马铃薯早疫病菌、马铃薯灰霉菌、枇杷炭疽病菌、核盘菌、金线莲炭疽病菌、金线莲拟盘多毛孢菌、立枯丝核菌、红豆杉叶枯病菌、番石榴焦腐病菌等，具有良好的开发应用前景。

3、本发明解淀粉芽孢杆菌菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，是一种理想的生防细菌。

附图说明

图1菌株GZ5在LB培养基上的菌落形态。

图2菌株GZ5活体对马铃薯晚疫病病原菌菌丝生长的抑制作用。

图3菌株GZ5发酵液对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用。

图4菌株GZ5对供试其它病原菌的抑菌作用。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例一拮抗菌的分离鉴定

l、土样采集与菌株分离

轻轻铲去健康番茄植株根际周围的表土，使用土壤取样器取5-10 cm深度的土壤样品，将其倒人已经灭菌备用的自封袋内，做好实时记录，带回实验室分离。每份土壤随机称取10 g置于装有90 mL 无菌水及少量玻璃珠的250 mL 三角瓶中，瓶口固定封口膜后放在200 r/min摇床上震荡30 min，静置5 min后，用移液枪分别吸取1 ml土样悬浮液，加入盛有9 ml 无菌水的试管后充分混匀，即为10^-2倍土样稀释液，采用同样的方法，依次制备10^-3、10^-4 、10^-5 、10^-6倍土样稀释液。将制备好的各梯度倍数的土样稀释液分别取100 ul均匀涂布在LB平板中，封上封口膜，平板倒置于37℃生化培养箱中培养2-4 d。观察生长出细菌菌落的颜色、形态、透明度等特征，并挑取不同类型单菌落重新纯化，将获得的纯培养移入LB斜面，置于4 ℃冰箱中保存、备用。

采用平板对峙法进行马铃薯晚疫病菌拮抗菌株的筛选。取备用的黑麦培养基和LB培养基，微波炉熔解后等比例混合倒板。用直径7mm的打孔器在活化后的马铃薯晚疫病菌菌落边缘同一直径打取菌饼，然后将菌饼接种在黑麦培养基与LB等比例混合培养皿正中央，同时在距离菌饼相对两侧2.5 cm处，用接种环蘸取在LB培养基上已活化的待测拮抗菌液划线，以在平板中央仅接种同样大小的马铃薯晚疫病菌菌饼作为对照，每个处理重复3次，放置在20 ℃恒温培养箱中培养，待对照组生长至平板边缘时，测量抑菌带大小。

、形态特征观察

将抑菌最明显的拮抗菌株GZ5划线接种于LB培养基(l0 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、5g氯化钠和15 g琼脂粉加蒸馏水定容至1000 mL，溶解并调pH为7.0-7.2，高压灭菌备用) 。37℃培养48 h后进行菌落特征和形态特征观察。菌落特征：该菌株菌落为圆形，乳白色，不透明，边缘整齐，中央凸起，表面湿润、略黏稠(图1)。形态特征：菌株GZ5革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，两端钝圆，内生芽孢，芽孢囊不膨大，芽孢椭圆形，中生到次端生。根据形态特征初步判断菌株GZ5属于芽孢杆菌属(Bacillus sp)。

、16S rDNA 序列分析

基因组提取试剂盒提取菌株GZ5基因组DNA后，采用通用引物L1: 5-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3’和L2: 5-GTGCCAAGGCATCCACC-3’，进行 16S rDNA 的PCR扩增。回收PCR扩增产物，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序，序列全长为1000bp（请见序列）。将所得序列提交到GenBank 数据库进行BLAST 分析比对，发现其与解淀粉芽孢杆菌有99%以上的序列同源性。

序列：

GTGCAAGGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGATTTATTTCGAAGCAACGCGAAGATCTTACCAGTTTTGACATCCTCTGATATCCTAGAGATAGACGTCCCT。

结合形态学特征和培养特征，将菌株GZ5 鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

实施例二：菌株GZ5活体对马铃薯晚疫病病原菌菌丝生长的抑制作用

取备用的黑麦培养基和LB培养基，微波炉熔解后，等比例混合倒板。在黑麦培养基与LB等比例混合培养皿正中央接种马铃薯晚疫病菌菌丝块（D=7 mm），在距离菌丝块相对两侧2.5 cm处，用接种环蘸取板上的GZ5菌液划线，以只接同样大小的马铃薯晚疫病菌菌丝块为对照，重复3次，放置在20 ℃恒温培养箱中培养，统计抑菌率。结果如图2所示，当对照马铃薯晚疫病菌长满培养皿时，试验组马铃薯晚疫病菌的生长呈现规避解淀粉芽孢杆菌GZ5的现象，培养14 d后抑菌率为67.14%，说明解淀粉芽孢杆菌GZ5对马铃薯晚疫病菌菌丝生长有较强的抑制作用。

实施例三：菌株GZ5发酵液对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用

将菌株GZ5发酵液2 mL加入到融化的20 mL冷却至45 ℃左右的黑麦培养基中混合倒平板，制成菌株GZ5发酵液的抑菌平板，在平板中央接种直径大小为7 mm马铃薯晚疫病菌菌丝块。将2 mL LB液体培养基加入到融化的20 mL冷却至45 ℃左右的黑麦培养基中混合倒平板，同样在平板中央接种直径大小为7 mm马铃薯晚疫病菌菌丝块为对照。重复3次，置于20℃培养箱中培养，以十字交叉法测量菌落生长直径，计算抑菌率。结果如图3所示，菌株GZ5发酵液能够明显抑制马铃薯晚疫病菌菌丝生长，培养14 d后菌落生长直径为21 mm，菌丝生长抑制率达76.23%。

实施例四：菌株GZ5活体对供试其它病原菌的抑菌作用

在PDA与LB培养基等比例混合培养皿正中央接种直径为7 mm的马铃薯早疫病菌、马铃薯灰霉菌、枇杷炭疽病菌、核盘菌、金线莲炭疽病菌、金线莲拟盘多毛孢菌、立枯丝核菌、红豆杉叶枯病菌、番石榴焦腐病菌菌丝块，在距离菌丝块相对两侧2.5 cm处，用接种环蘸板上GZ5菌液划线，以未接GZ5菌液为对照，每个处理重复3次，放置在28 ℃恒温培养箱中培养，统计抑菌率。结果如图4所示，解淀粉芽孢杆菌GZ5对测定的马铃薯早疫病菌、马铃薯灰霉菌、枇杷炭疽病菌、核盘菌、金线莲炭疽病菌、金线莲拟盘多毛孢菌、立枯丝核菌、红豆杉叶枯病菌、番石榴焦腐病菌等9种病原菌菌丝生长均有不同程度抑制作用，菌丝生长抑制率分别为63.75%、52.31%、70.83%、63.75%、65.38%、67.00%、63.10%、54.59%、56.58%。

实施例五菌株GZ5发酵液盆栽防效试验

选取3~5叶大小马铃薯晚疫病高感品种（费乌瑞它）苗，每株苗浇灌50 ml GZ5菌株发酵液（约10⁸ CFU /ml），24 h后每株灌根接种浓度约为5×10⁴个/mL的马铃薯晚疫病菌孢子囊悬浮液（预先在4℃冰箱内静置2-3 h）20 ml，接种4 d后再浇灌一次100 ml 菌株GZ5发酵液，以68％金雷水分散粒剂（瑞士先正达作物保护有限公司）喷雾处理作为农药对照，以清水处理作为空白对照，每个处理20株苗，每处理3次重复。待发病后每天调查发病情况，统计发病率和病情指数，直至清水对照发病率达到80%以上时结束实验。

病情分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶片面积的5%以下；

3级：病斑面积占整个叶片面积的6%-10%；

5级：病斑面积占整个叶片面积的11%-20%；

7级：病斑面积占整个叶片面积的21%-50%；

9级：病斑面积占整个叶片面积的50%以上。

病情指数（%）=[∑病级叶片数×代表数值)／(最重病级数×总叶片数)]×100%

防治效果（%）=[(空白对照病情指数－处理病情指数)／空白对照病情指数]×100%

实验结果见表1，该结果表明供试解淀粉芽孢杆菌GZ5发酵液能够显著降低马铃薯晚疫病的病情指数，防治效果达63.1%，高于化学农药68％金雷水分散粒剂（100g/667hm²）的防治效果57.15%。温室盆栽实验结果说明，GZ5菌株能够有效防治马铃薯晚疫病，表现出良好的应用潜力。

表1 解淀粉芽孢杆菌GZ5发酵液对马铃薯晚疫病的防治效果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治马铃薯晚疫病中的应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcaagggc ggcgtgctat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtga tttatttcga agcaacgcga agatcttacc 960

agttttgaca tcctctgata tcctagagat agacgtccct 1000

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtcgtaaca acgtagccgt 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgccaaggc atccacc 17

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌菌株在防治马铃薯晚疫病中的应用，其特征在于，所述的菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZ5，已于2019年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18987；应用方式有以下两种：

2）与有机肥混合制成菌肥使用。

2.权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌菌株在防治马铃薯早疫病菌、马铃薯灰霉菌、枇杷炭疽病菌、核盘菌、金线莲炭疽病菌、金线莲拟盘多毛孢菌、立枯丝核菌、红豆杉叶枯病菌、番石榴焦腐病菌引起病害中的应用。