CN109880775A - 一株苏云金芽孢杆菌novonest4及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业微生物领域，公开了一株苏云金芽孢杆菌novonest4及其应用，所述的苏云金芽孢杆菌为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）novonest4，保藏编号为：CCTCC NO:M2018443，该菌株首次被报道在叶部施用具有防治鳞翅目害虫的作用的同时，具有土壤施用降解多菌灵及对作物促生增产作用，在农业生产中具有广阔的应用前景。

Description

一株苏云金芽孢杆菌novonest4及其应用
技术领域
本发明属于属于农业微生物领域，具体涉及一株苏云金芽孢杆菌novonest4及其应用。
背景技术
化学农药的使用对于病虫草害的防治和挽回作物损失起到了关键作用，极大提高了农业生产效率，促进了近代农业的发展。然而，随着化学农药的使用，产生了环境污染、农药残留和抗药性等问题。随着社会的进步和人民生活水平的提高，迫切需要更为安全有效的防治病虫草害手段。
微生物降解具有高效、廉价和安全等优点，成为处理各种有机污染物的有效措施。近年来，通过微生物降解农药残留污染已经得到了广泛的关注，生物修复公司已经将降解微生物及其制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸易发展有限公司已成功生产“比亚”生物降解剂可用于去除有机磷类农药残留。
苏云金杆菌，简称Bt，是一种革兰氏阳性细菌，日本科学家首次在死亡的蚕中分离出该菌，并发现该菌可有效杀死某些鳞翅目害虫。研究证实，苏云金芽孢杆菌可产生伴孢晶体，又被称为杀虫晶体蛋白，苏云金芽孢杆菌可产生伴孢晶体，又被称为杀虫晶体蛋白。苏云金芽孢杆菌产生的杀虫蛋白可在碱性条件下溶解，并且该杀虫蛋白被靶标昆虫取食后可在昆虫体内的碱性环境中降解为活性肽物质，经过化学降解或酶解作用之后可转化成具有广谱杀虫活性的毒素。大多数苏云金芽孢杆菌菌株产生的杀虫蛋白对鳞翅目昆虫具有明显的毒性效果，也有一些菌株产生的杀虫蛋白对双翅目和鞘翅目物种也具有毒性。但并非所有的苏云金芽孢杆菌都对鳞翅目害虫具有杀灭功能，需要通过大量的筛选来获得对目标害虫具有高毒力的菌株。
苏云金杆菌除了具有对上述害虫的活性之外，也有关于促生、杀线虫和降解农药的报道。如发明人曾经提供了一株NBIN863菌株，该菌具有杀番茄根结线虫及促生作用，但无抗鳞翅目害虫的功能；Bt-1菌种具有降解嘧菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯和甲氰菊酯等农药的功能。关于多菌灵降解菌已有一些报道，如短小芽孢杆菌NY97-1菌株，家玲红球菌dj1-6-2菌株，红串红球菌XJ-D菌株等，苏云金杆菌降解多菌灵为首次报道。然而，具有降解农药活性的微生物较多，仅具有一种单一功能微生物使用成本较高，而一种微生物具有农药活性、降解农药活性和菌肥促生特性会大大提高微生物的使用效率，进一步提质增效。
发明内容
一株分离的苏云金芽孢杆菌，所述的苏云金芽孢杆菌命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)novonest4，保藏编号为：CCTCC NO:M2018443。
一株分离的苏云金芽孢杆菌的应用，该菌株可用于制备成具有多重效果的微生物制剂，包括用于降解多菌灵，促进植物生长以及用于防治鳞翅目害虫。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一株分离的苏云金芽孢杆菌，通过杀鳞翅目害虫活性和降解多菌灵活性双重功能性筛选获得，通过16s rDNA结合生理生化鉴定进一步确定为苏云金芽孢杆菌，该菌株已于2018年7月4日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)novonest4；保藏编号为：CCTCC NO:M2018443；地点：中国，武汉，武汉大学。
该菌在NA培养基菌落生长良好，菌落乳白色，镜检观察到芽孢和伴孢晶体。
一株分离的苏云金芽孢杆菌的应用，包括利用该芽孢杆菌制备成作物微生物制剂，该制剂同时具备降解多菌灵，促进作物生长，防治鳞翅目害虫的效果。
以上所述的应用中，优选的，所述的作物为：茶叶、党参、厚朴、白术、黄连、水稻、玉米、小麦、大豆、番茄、甘蓝、辣椒或黄瓜；
以上所述的应用中，优选地，所述的鳞翅目害虫为茶尺蠖、茶毛虫、玉米螟、水稻二化螟、小菜蛾、茶青虫或斜纹夜蛾。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供了一株苏云金芽孢杆菌，该菌株抗逆性强，易于大量发酵，首次报道对多菌灵具有降解活性，具有重要的应用价值。
(2)菌株兼具杀虫和促生活性，使用方便，无残留和污染，可以有效减少化肥和农药施用。
附图说明
图1苏云金杆菌novonest4显微镜(1000X)观察照片示意图。
图2苏云金杆菌novonest4防治茶尺蠖效果示意图；
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
苏云金芽孢杆菌novonest4的获得及鉴定：
苏云金芽孢杆菌novonest4来自于湖北省生物农药工程研究中心苏云金杆菌资源库，同时进行杀鳞翅目害虫活性和降解多菌灵活性筛选，获得该双重功能菌株。该菌株通过16s rDNA结合生理生化鉴定进一步确定其分类学地位(表1，表2)，已于2018年7月4日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)novonest4；保藏编号为CCTCC NO:M2018443；地点：中国，武汉，武汉大学。
在本发明中，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)novonest4或被简称为novonest4。
该菌在NA培养基菌落生长良好，菌落乳白色，镜检观察到芽孢和伴孢晶体。
表1苏云金芽孢杆菌novonest4生理生化特性–酶活、碳源氧化
+：阳性反应；-：阴性反应；
表2苏云金芽孢杆菌novonest4生理生化特性—利用碳源产酸
+：阳性反应；-：阴性反应；
实施例2：
苏云金芽孢杆菌novonest4的发酵：
1)一级种子培养：500ml三角瓶中装有200ml一级种子培养基，120℃湿热灭菌15-30min，取苏云金芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在35℃培养10h；
一级种子培养所用培养基为：葡萄糖1％(g/L，以下同)，牛肉膏2％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，培养基pH为7；
2)二级种子培养：在400L发酵罐中装有150L二级种子培养基，120℃湿热灭菌30min，将200ml一级种子接种于二级种子培养基中；在35℃培养10h；控制罐压0.05Mpa，搅拌速度120rpm，通气比1:1.0。
二级种子培养所用培养基为：葡萄糖2％，酵母抽提物1％，蛋白胨2％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠1％，硫酸镁0.05％，培养基pH调为7；
3)发酵：在40m3发酵罐中装有25m3苏云金芽孢杆菌活菌发酵培养基，120℃湿热灭菌30min，将200L二级种子接种于苏云金芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.04Mpa，搅拌转速100rpm，通气比1:0.5，在35℃培养36h；
发酵所用培养基的原料及用量为：玉米淀粉1％、花生饼粉2％、鱼粉1％、酵母浸粉0.5％、蛋白胨0.5％％、磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，培养基pH7。
4)芽孢和晶体40％分离时结束发酵，经计数，芽孢数为5×109cfu/mL，作为发酵液原液，用于以下实施例。
实施例3：
苏云金芽孢杆菌novonest4对茶尺蠖杀虫活性
以实施例2制备的苏云金芽孢杆菌novonest4发酵液原液，采用浸叶饲喂法进行检测，即用无菌水配制100倍和200倍Bt溶液，以清水作为对照，试验设置3个重复，浸泡茶叶十分钟后取出，晾干后供茶尺蠖初孵幼虫取食，2d、3d、4d和5d后进行统计，各处理置于25℃、相对湿度80％、光照2000lx人工培养箱，每天定期检查，记录试虫死亡数量。室内试验表明，苏云金杆菌novonest4稀释100倍和200倍对茶尺蠖均具有良好的防治效果(图2)。
表3苏云金杆菌novonest4对茶尺蠖的防效
限于篇幅，本申请文本中仅记载了苏云金芽孢杆菌novonest4对茶尺蠖的杀虫活性数据，在实际检测中，该菌株对茶毛虫、玉米螟、水稻二化螟、小菜蛾、茶青虫和斜纹夜蛾都具有良好的杀灭效果。
实施例4：
苏云金芽孢杆菌novonest4降解多菌灵效果：
1)基础培养基体积为180ml(500ml三角瓶)，加入80mg的50％多菌灵可湿性粉剂，随后加入20毫升实施例2制备的BT发酵液原液，以不加BT无菌水的为对照，于30℃摇床培养(170rmp/min)，7d后取样测定，将对照和处理5ml基础培养基悬浮液转入50ml分液漏斗，用10ml二氯甲烷萃取三次，下层有机相经过无水硫酸钠合并于250ml圆底烧瓶。置旋转蒸发仪上减压浓缩至近干，然后用氮气吹干。用甲醇定容至10ml，使用HPLC进行检测；
所述的基础培养基的配方是：NH4NO3 1.0克，K2HPO4 1.5克，KH2PO4 0.5克，MgSO40.2克，NaCl 0.5克，水定容至1升。
2)称取1000g(干重)未施用多菌灵土壤，加入多菌灵，使多菌灵浓度达到50mg/kg，随后加入novonest4发酵液，使土壤中的novonest4浓度为108个芽孢/克土，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，10d后取样测定多菌灵在土壤中的残留量。结果见表4，在摇瓶中对多菌灵降解率为53.45％，土壤中对多菌灵降解率达到35.40％。
表4苏云金芽孢杆菌novonest4对多菌灵降解率
培养基 无机盐培养基 土壤
降解率 53.45％ 35.40％
实施例5：
苏云金芽孢杆菌novonest4对茶叶促生效果：
试验于2018年8月于湖北黄冈英山县茶园进行，海拔107米，夏茶采收结束后在茶树根部喷施novonest4发酵液，含量为5×109cfu/mL，用量20L/亩，以不喷施BT发酵液为对照。于2018年10月统计发芽密度和一芽二叶重。施用novonest4后对茶叶具有明显的促生作用，发芽密度提高26.34％，百芽重提高22.86％(表5)。
表5苏云金杆菌novonest4对茶叶促生效果
处理 发芽密度(0.1m<sup>2</sup>) 百芽重/g
苏云金杆菌novonest4 101.7 38.48
CK 80.5 31.32
限于篇幅，本申请文本中仅记载了苏云金芽孢杆菌novonest4对茶叶具有促生效果的数据，在实际检测中，该菌株对茶叶、党参、厚朴、白术和黄连等中药材、水稻、玉米、小麦、大豆、番茄、甘蓝、辣椒和黄瓜都具有促生效果。

Claims (4)

1.一株分离的苏云金芽孢杆菌，所述的苏云金芽孢杆菌为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）novonest4，保藏编号为：CCTCC NO: M2018443。
2.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在制备成作物微生物制剂中的应用。
3.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在制备成同时促进植物生长，防治鳞翅目害虫和降解多菌灵制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述的植物为茶叶、党参、厚朴、白术、黄连、水稻、玉米、小麦、大豆、番茄、甘蓝、辣椒或黄瓜；所述的鳞翅目害虫为茶尺蠖、茶毛虫、玉米螟、水稻二化螟、小菜蛾、茶青虫或斜纹夜蛾。
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