CN104140941A - 苏云金芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苏云金芽孢杆菌及其应用。该苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）SWJS07于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.8423。经单因素实验优化了苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）SWJS07产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。并且长期以来，苏云金芽孢杆菌都被定位于生物农药（对人、畜、植物无毒、无致病性），而关于其生长过程中所产代谢产物具有的新功能的研究报道却较少，通过研究其代谢产物，在开发新型深海菌株及酶制剂的研究中，具有重要意义。

Description

苏云金芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及深海中微生物筛选及发酵领域，具体涉及苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07及其液体发酵产蛋白酶的方法。

背景技术

蛋白酶（protease）是一类非常重要的水解酶，是三大工业用酶之一，销售额约占全球酶制剂市场的60%。其中，来源于细菌的蛋白酶比来源于动物和真菌的更具有开发前景，因为，微生物无处不在，可以在有氧和无氧环境中生存，且生长速度快，它们的代谢产物――微生物酶，可以降解所有天然化合物及大多数人造化学品。所以微生物酶已成为人们获得工业用酶的重要来源，其中微生物来源的蛋白酶占据了世界市场的20%，主要用于蛋白质深加工、皮革、医药、洗涤剂、饲料等行业中。

由于海洋环境的特殊性（高盐、高压、低温、营养稀缺等），使海洋微生物与陆生微生物在代谢系统与防御体上有着明显的差异，其所拥有的独特遗传因子与代谢途径，能够产生化学结构多样、新颖，生理活性独特的代谢产物。是获取新型酶，如极端酶，特别是耐盐、耐碱、耐热、耐冷蛋白酶的重要资源库。此外，人类对生物活性物质的需求越来越迫切，开发新颖的活性物质也成为当前研究的热点。但由于我们对深海微生物的特殊生长需求以及生理特性的了解有限，所以我们能在现有的实验室条件下分离进行培养的还比较少。目前，在100万种以上的海洋微生物中，所研究和鉴定过的海洋微生物约占总数的5%，已发现的活性物质仅约占总数的1%。这些都充分说明了海洋微生物具有深远的开发意义和巨大的开发潜力。

长期以来，苏云金芽孢杆菌都被定位于生物农药（对人、畜、植物无毒、无致病性），而关于其生长过程中所产代谢产物具有的新功能的研究报道却较少，而深海来源产蛋白酶的苏云金芽孢杆菌尚未见报道。本发明中所涉及的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07遗传性质稳定，所产中性蛋白酶活力达1000U/mL以上，在新型酶制剂的开发及工业应用中具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一是提供了一种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

本发明目的之二是提供了一种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07在液体发酵生产蛋白酶中的应用。

本发明中可生产蛋白酶的深海菌株为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07，该菌于2013年１１月１日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8423。

对保藏编号为CGMCC No.8423的菌株进行形态学及生理生化鉴定，有以下特征：

表1 菌株形态特征

注：“+”表示90%以上菌株呈阳性，“-”表示90%以上菌株呈阴性，表2同。

表2 生理生化特征

 保藏号为CGMCC No. 8423菌株经16S rDNA鉴定，测得基因片段长度为1295bp，具体基因序列见序列表1。将获得的基因序列输入Genbank，应用Blast程序将获得的基因序列与数据库中基因序列进行对比。结果显示与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的16S rDNA序列的同源性为99%。将此结果结合菌株形态学及生理生化鉴定特征，确定该菌为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

保藏号为CGMCC No.8423菌株通过单因素试验对其液体发酵产蛋白酶条件进行了优化。

本发明具有如下优点和技术效果：

本发明公开了苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07及其产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。由于该菌株来源于深海，所分泌蛋白酶具有特殊的性质。并且长期以来，苏云金芽孢杆菌都被定位于生物农药（对人、畜、植物无毒），而关于其生长过程中所产代谢产物具有的新功能的研究报道却较少，在开发新型深海菌株及酶制剂的研究中，具有重要意义。

附图说明

图1为不同发酵温度对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07产蛋白酶的影响。

图2为种子液不同培养时间对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07产蛋白酶的影响。

图3为不同装液量对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07产蛋白酶的影响。

图4为不同发酵时间对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07产蛋白酶的影响。

具体实施方式

富集及种子培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，硫酸铁0.1g，人工海水1L，pH7.6-7.8。

酪蛋白培养基：酪蛋白10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2g，琼脂15g，去离子水1L，pH7.3-7.5。

发酵培养基：大豆分离蛋白6g，葡糖糖6g，NaCl 10g，KH₂PO4 0.5g，MgSO₄﹒7H₂O 0.3g，CaCl₂ 1g，CaCO₃ 0.25g，甘油4g，去离子水1L，pH7.5。

编号CGMCC No.8423菌株的分离、筛选

细菌的富集：称2g海泥于50mL锥形瓶中，加入10mL无菌水及无菌玻璃珠，于37℃，180r/min的培养箱中振荡20min，静置一段时间，取1mL上清液于富集培养基中，37℃，180r/min培养12h。

初筛：用生理盐水按10倍稀释法将富集培养后的菌悬液稀释至10^-8。分别取0.1mL10^-6～10^-8稀释液，涂布于酪蛋白平板培养基上，于37℃下培养48h后，挑选产生明显水解圈的菌株进行下一步试验。

分离纯化：挑选上述酪蛋白平板中有明显水解圈的菌落，在新的酪蛋白平板上连续划线分离三次以上，得纯培养物。将纯化后的菌体转接于斜面培养基上，4℃保藏。

复筛：挑取在斜面上分离纯化后的菌株，将其转接于种子培养基中，37℃，180r/min条件下培养12h。以3%的接种量转接于发酵培养基中（25mL/250mL锥形瓶），37℃，180r/min培养48h。将发酵液在10000r/min，4℃条件下离心10min，过滤制得粗酶液。采用福林-酚法测定粗酶液的蛋白酶活力，选取蛋白酶活力较高的菌株进行下一步鉴定。

编号CGMCC No.8423菌株的鉴定

将活化的编号为CGMCC No.8423的菌株接种于L-B培养基中，37℃，180r/min培养12h，经L-B培养液传代培养2-3次后，取1.5mL对数生长末期的菌体培养物，4℃，10000r/min离心5min，收集菌体，去尽培养液。菌体经SDS及蛋白酶K裂解、酚-氯仿-异戊醇抽提、转移上清、0.6倍体积异丙醇析出DNA沉淀后短暂离心、70%乙醇洗涤、TE溶解模板DNA。电泳检测后采用通用引物进行PCR（正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。

扩增总反应体系为（20μL）:模板基因DNA 0.5μL；上下游引物(20μmol/l)各1.0μL；Taq DNA聚合酶0.2μL；10×buffer 2.0μL；4种脱氧核苷酸混合物dNTP(各2.5 mmol/L)1.6μL，25 mmol/L MgCl2 1.6μL，双蒸水(ddH2O)12.1μL。PCR扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1.5 min；72℃ 10 min；10℃，共30个循环。PCR产物纯化后完成测定的16S rDNA基因基因片段长度为1295bp，与Bacillus thuringiensis strain同源性达99%，具体序列见序列表。结合菌株形态学、生理生化特征，判定编号为CGMCC No.8423的菌株为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）CGMCC No.8423液体发酵产蛋白酶条件优化

发酵温度的优化：将发酵液分别置于25、30、37、40、45℃下，180r/min，装液量为25ｍL/250mL，发酵培养48h。测其发酵液上清液中蛋白酶活力，结果如图1，在37℃下发酵，发酵液上清液中蛋白酶活力最高。

种龄的优化：将菌株接种于种子培养基中，37℃，180r/min，分别培养4、8、12、16、24h后，接种于发酵培养基，37℃，180r/min发酵48h，测定其蛋白酶活力。结果见图２，当种龄在12h-16h时发酵液上清液中蛋白酶活力较高。

摇瓶装液量的优化：采用250ml锥形瓶进行摇瓶发酵，装液量分别为20、25、30、40、50、60、70、80、90、100ｍL，在37℃，180r/min条件下发酵48h。测定发酵液上清液中蛋白酶酶活，结果如图3，装液量为30mL时蛋白酶活力最高，随着装液量的增加，蛋白酶活力逐渐下降。

发酵时间优化：将接种后的装液量为30mL/250ml的发酵液放于37℃，180r/min，培养60h，每隔4h取样，测其发酵液上清液蛋白酶活力。结果如图4，蛋白酶活力在32h-36h时达到最大，随着时间延长，蛋白酶活力呈下降趋势。

编号CGMCC No. 8423菌株的遗传稳定性

表3

传代次数	1	2	3	4	5	6	7	8
									蛋白酶活力U/mL	1021±89	1120±98	1046±92	1157±86	1121±87	1013±79	1138±90	1012±96

 将保藏的编号CGMCC No.8423菌株连续传代培养，并测其蛋白酶活力，并将其作为评价遗传稳定性的指标。结果如表3，传代8次，蛋白酶活力保持在1000U/ml左右，表明菌株有较好的遗传稳定性。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南理工大学

 

<120>  苏云金芽孢杆菌及其应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1295

<212>  DNA

<213>  苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）

 

<400>  1

acacgtgggt aacctgccca taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg       60

 

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cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcc                                1295

 

 

Claims (2)

1.苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）SWJS07，该菌于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8423。

2.权利要求1所述苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）在液体发酵生产蛋白酶的应用。