CN109593680A - 一种苏云金杆菌液体发酵培养基及其菌粉和油悬剂 - Google Patents
一种苏云金杆菌液体发酵培养基及其菌粉和油悬剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种苏云金杆菌液体发酵培养基，该培养基全部由水溶性的碳源、氮源、无机盐、微量元素组成，本发明所提供的培养基不仅能使发酵后菌粉达到更小的粒径，同时还能达到更高的纯度，利用该菌粉制得的苏云金杆菌油悬剂适用于有机农业生产，具有稳定期长，活性高，安全性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种苏云金杆菌的液体发酵培养基，本发明还涉及利用所述液体发酵培养基制备的苏云金杆菌菌粉以及由该菌粉制成的油悬剂，属于微生物发酵和制剂领域。
技术背景
苏云金杆菌是世界上产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂，其优点在于对人畜无害、环境友好、杀虫高效且较广谱，可用于农业、园林、仓储及卫生杀虫剂使用。苏云金杆菌的剂型主要有水悬浮剂、可湿性粉剂、油悬浮剂等，相对于其它剂型，油悬浮剂具有货架期长、药效高、持效期久等特点，因此应用较为广泛。
由于苏云金杆菌原粉自身特性的原因，油悬浮剂在贮存期间容易发生分层、膏化等现象，严重地影响了使用效果。因此现有技术一般是通过加入助悬剂、增稠剂、表面活性剂等以提高油悬浮剂的稳定性，从而导致生产成本提高，同时使用范围也受到影响——现有技术生产的苏云金杆菌油悬剂不符合有机农业标准要求，目前市场上的产品所用原材料均不能达到有机农业标准规范要求。
现有的苏云金杆菌液体发酵培养基中大多含有豆粕粉、棉籽饼粉、麸皮、大米、玉米淀粉等成分，这些成分都是水不溶性、软性和可塑性物质，当这些成分残留在苏云金杆菌菌粉中，会导致粉末粘性和塑性增加，从而使研磨后的粉末粒径很难进一步降低，现有的油悬浮剂细度D98降到25～35μm之间就已达到极限，油悬剂中悬浮的粒子粒径粗就容易沉降分层，现有技术很难通过进一步降低粒径来实现悬浮稳定性的提高。另外，这些水不溶性成分存在与油悬浮剂中，使得菌粉之间发生粘结、团聚，进一步降低了稳定性。
我们通过对导致苏云金杆菌油悬浮剂不稳定的深层原因进行大量地试验研究和摸索，最终选择了一种完全不同于现有技术的另一途径，即从苏云金杆菌发酵培养基入手，通过降低原粉粒径，减少水不溶性杂质含量，达到提高稳定性并同时符合有机农业标准要求，最终实现本发明。
发明内容
针对苏云金杆菌悬浮稳定性差的难题，现有技术主要通过降低菌粉粒径或者加入助悬剂、增稠剂来制备油悬剂，但是采用普通发酵方法制备的苏云金杆菌菌粉其粒径已很难得到进一步降低，而加入的助剂又会对有机农业生产产生不利影响。
本发明的目的是针对上述难题，提供一种全部由水溶性成分组成的苏云金杆菌液体发酵培养基，采用该培养基，能使菌粉在研磨乳化后达到更小的粒径，从而在不需要加入助剂的前提下使油悬剂达到了更好的稳定性，同时符合有机农业标准生产的要求。
上述目的是通过采用以下技术方案实现的：
一种苏云金杆菌液体发酵培养基，它由以下重量配比的成分组成：
所述可溶性碳源选自葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉中的一种或多种；
所述可溶性氮源选自蛋白胨、酵母粉、氨基酸、蛋白水解物中的一种或多种；
所述可溶性无机盐选自氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁中的一种或多种；
所述可溶性微量元素为氯化锰。
优选地，所述苏云金杆菌液体发酵培养基由以下重量配比的成分组成：
进一步优选地，所述苏云金杆菌液体发酵培养基由以下重量配比的成分组成：
一种苏云金杆菌菌粉，是按以下方法制备的：
1)调节以上所述的液体发酵培养基的pH为7～7.5，然后接入苏云金杆菌，控制通风量为1～2v/v/min，温度为30～35℃，发酵20～40小时；
2)调节发酵液pH为4～5，离心浓缩得到含固量为5～20％的菌浆，用水冲洗菌浆以除去残留培养基，最后将菌浆浓缩后喷雾干燥，即得。
一种苏云金杆菌油悬剂，所述油悬剂由所述的苏云金杆菌菌粉、油相基质、乳化剂组成。
优选地，所述各成分的重量配比为：苏云金杆菌菌粉5～30％、油相基质50～80％、乳化剂10～30％。
优选地，所述油相基质由大豆油和石蜡油组成。
优选地，所述乳化剂为卵磷酯。
本发明的有益效果是：
1)本发明所提供的培养基全部由水溶性成分组成，而且这些成分不具备软性和可塑性，因此不会对发酵后菌粉的物理性质产生不利影响，菌粉经研磨、乳化后能达到更小的粒径，从而提高了油悬剂的稳定性。
2)本发明所提供的培养基还能使苏云金杆菌菌粉达到更高的纯度，制得的菌粉在显微镜下检测看到的都是纯净的芽孢和毒素蛋白晶体，杂质极少，而且芽孢之间没有固体培养基粘连，呈高度分散状态，毒素蛋白含量达到20％以上，而普通发酵只能达到10％左右。
3)本发明所提供的油悬剂除了油相和乳化剂不含其它任何助剂，在常温下储存两年不会发生分层、膏化等物理变化，也不会发生毒素蛋白降解等化学变化，因此理化性质和生物活性非常稳定。与现有的油悬剂相比，本发明还具有生产成本低，活性高，安全性好等优点。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1
第一步：菌粉的制备
1.液体发酵配养基按以下配方配制：葡萄糖4％、酵母粉2％、可溶性淀粉2％、蛋白胨0.5％、硫酸镁0.01％、氯化锰0.005％、磷酸二氢钾0.15％、氯化钠0.5％、水补充到100％。以上成分均为水溶性成分，发酵后容易通过离心、洗涤去除，同时由于不具备软性和可塑性，因此即使在菌粉中有残留，也不会对研磨的粒径产生影响。
2.培养基配制溶解后，调节pH为7.2，高压蒸汽120℃消毒灭菌30分钟，通入无菌空气，通风量1.5v/v/min，冷却到31℃，接入菌种保持温度和通风量不变开始发酵。30小时后发酵完成，放料后酸化pH值为4.5，离心浓缩得到含固量为10％的菌浆，用水冲洗菌浆以除去残留培养基，最后将菌浆浓缩后喷雾干燥得菌粉。
第二步：油悬剂的制备
往搅拌罐里投入大豆油500公斤、石蜡油230公斤、卵磷脂150公斤，开动搅拌约200～400转/分钟混合均匀，投入上述苏云金杆菌菌粉120公斤混合均匀，泵入砂磨机，在5000转/min条件下研磨30min。
实施例2
第一步：菌粉的制备
1.液体发酵配养基按以下配方配制：葡萄糖5％、酵母粉1％、可溶性淀粉1％、蛋白胨2％、硫酸镁0.05％、氯化锰0.001％、磷酸二氢钾0.3％、氯化钠0.3％、水补充到100％。
2.培养基配制溶解后，调节pH为7.0，高压蒸汽120℃消毒灭菌30分钟，通入无菌空气，通风量1v/v/min，冷却到33℃，接入菌种保持温度和通风量不变开始发酵。20小时后发酵完成，放料后酸化pH为4，离心浓缩得到含固量为15％的菌浆，用水冲洗菌浆以除去残留培养基，最后将菌浆浓缩后喷雾干燥得菌粉。
第二步：油悬剂的制备
往搅拌罐里投入大豆油400公斤、石蜡油290公斤、卵磷脂250公斤，开动搅拌约200～400转/分钟混合均匀，投入上述苏云金杆菌菌粉60公斤混合均匀，泵入砂磨机，在5000转/min条件下研磨30min。
实施例3
第一步：菌粉的制备
1.液体发酵配养基按以下配方配制：葡萄糖2％、酵母粉3％、可溶性淀粉3％、蛋白胨0.5％、硫酸镁0.005％、氯化锰0.01％、磷酸二氢钾0.4％、氯化钠0.8％、水补充到100％。
2.培养基配制溶解后，调节pH为7.5，高压蒸汽120℃消毒灭菌30分钟，通入无菌空气，通风量2v/v/min，冷却到30℃，接入菌种保持温度和通风量不变开始发酵。40小时后发酵完成，放料后酸化pH为5，离心浓缩得到含固量为8％的菌浆，用水冲洗菌浆以除去残留培养基，最后将菌浆浓缩后喷雾干燥得菌粉。
第二步：油悬剂的制备
往搅拌罐里投入大豆油300公斤、石蜡油350公斤、卵磷脂100公斤，开动搅拌约200～400转/分钟混合均匀，投入上述苏云金杆菌菌粉250公斤混合均匀，泵入砂磨机，在5000转/min条件下研磨30min。
对比例1
采用常规的液体发酵配养基，具体配方如下：
豆粕2.5％、棉籽粉2％、玉米淀粉2％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.1％、七水硫酸亚铁0.002％。
培养基配制溶解后，调节pH为7.2，高压蒸汽120℃消毒灭菌30分钟，通入无菌空气，通风量1.5v/v/min，冷却到31℃，接入菌种保持温度和通风量不变开始发酵。30小时后发酵完成，放料后酸化pH值为4.5，离心浓缩得到含固量为10％的菌浆，用水冲洗菌浆以除去残留培养基，最后将菌浆浓缩后喷雾干燥得菌粉。
第二步：油悬剂的制备
往搅拌罐里投入大豆油500公斤、石蜡油230公斤、卵磷脂150公斤，开动搅拌约200～400转/分钟混合均匀，投入上述苏云金杆菌菌粉120公斤混合均匀，泵入砂磨机，在5000转/min条件下研磨30min。
检测实施例1-3和对比例1中菌粉的毒素蛋白含量和毒力效价，另外还检测研磨后油悬剂的粒径，结果见下表1。
表1毒素蛋白含量、毒力效价和粒径的检测结果
| 毒素蛋白含量(％) | Ha毒力效价(IU/mg) | 粒径(D98) | |
| 实施例1 | 23.2 | 160,000 | 8.9μm |
| 实施例2 | 20.6 | 144,000 | 9.1μm |
| 实施例3 | 22.3 | 156,000 | 9.2μm |
| 对比例1 | 9.8 | 68,000 | 37.5μm |
Claims (8)
1.一种苏云金杆菌液体发酵培养基，其特征在于由以下重量配比的成分组成：
所述可溶性碳源选自葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉中的一种或多种；
所述可溶性氮源选自蛋白胨、酵母粉、氨基酸、蛋白水解物中的一种或多种；
所述可溶性无机盐选自氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁中的一种或多种；
所述可溶性微量元素为氯化锰。
2.如权利要求1所述的苏云金杆菌液体发酵培养基，其特征在于由以下重量配比的成分组成：
3.如权利要求2所述的苏云金杆菌液体发酵培养基，其特征在于由以下重量配比的成分组成：
4.一种苏云金杆菌菌粉，其特征在于是按以下方法制备的，该方法包括以下步骤：
1)调节权利要求1～3任何一项所述的液体发酵培养基的pH为7～7.5，然后接入苏云金杆菌，控制通风量为1～2v/v/min，温度为30～35℃，发酵20～40小时；
2)调节发酵液pH为4～5，离心浓缩得到含固量为5～20％的菌浆，用水冲洗菌浆以除去残留培养基，最后将菌浆浓缩后喷雾干燥，即得。
5.一种苏云金杆菌油悬剂，其特征在于：所述油悬剂由权利要求4所述的苏云金杆菌菌粉、油相基质、乳化剂组成。
6.如权利要求5所述的苏云金杆菌油悬剂，其特征在于：所述各成分的重量配比为：苏云金杆菌菌粉5～30％、油相基质50～80％、乳化剂10～30％。
7.如权利要求5所述的苏云金杆菌油悬剂，其特征在于：所述油相基质由大豆油和石蜡油组成。
8.如权利要求5所述的苏云金杆菌油悬剂，其特征在于：所述乳化剂为卵磷酯。
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