CN102286413A - 一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法，包括菌糠的预处理和培养基成分补充。本发明的制备方法，通过强酸将菌糠中的纤维素和杏鲍菇菌丝体降解为苏云金杆菌可以利用的糠提取液所含的糖分与少量蛋白质、磷以及微量元素为主要营养物质，同时补充部分氮源与无机盐离子，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，苏云金杆菌得以生长与繁殖，形成芽孢与杀虫晶体蛋白等杀虫活性物质，发酵液经浓缩干燥制成绿色、环保且无二次污染的微生物杀虫剂产品。本发明既解决了菌糠处理，防止菌糠对污染环境，又实现了资源化综合利用，同时还大大降低微生物杀虫剂的生产成本，起到变废为宝的功效。

Description

一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物培养基的制备方法，具体涉及一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法，属于生物农药技术领域。 

背景技术

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简称 Bt）是一种革兰氏阳性细菌，在形成芽胞的同时能产生对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、同翅目、线虫等多种害虫具有特异杀虫活性的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）。这些杀虫晶体蛋白具有对人畜无害、环境友好等优点。因此，苏云金杆菌被广泛地应用于农业、林业和公共卫生等领域的害虫防治，成为世界上应用最广、产量最大的微生物杀虫剂。目前苏云金杆菌杀虫剂主流生产工艺是液体深层发酵，主要以各种工农业产品或农副产品为原料，其价格约占总生产成本35~59%，是生物杀虫剂难于普及的主要限制因素。研究表明苏云金杆菌在含氮0.075~0.225%，含糖0.1~1.5%和碳氮比0.44~20.0%的范围内都能良好地生长。因此，如何采用低成本、当地可得的工农业废弃物为原料发酵生产苏云金杆菌杀虫剂是国内外的研究热点，例如，味精废水、废啤酒酵母浸出液、鸡舍垫料浸出液、乳清等都被尝试用作苏云金杆菌生产的发酵原料，然而这些原料通常需要繁琐、昂贵的预处理（如：脱脂、蛋白洗脱与浓缩等），发酵过程稳定性差，且往往不能及时供给。

我国是世界最大的食用菌生产国，年产量占世界总产量的60%以上，2009年全国食用菌产量已达2020.6万吨，且产量仍在逐年攀升。食用菌栽培废料（又称菌糠、菌渣）作为一种廉价的农业副产品，含有丰富的蛋白质和其它营养成分，随意丢弃或燃烧是对资源的浪费。同时菌糠中含有大量的菌丝体、食用菌生长代谢产物以及其他未利用的营养物质，各种有害生物如霉菌、蚊类、螨类等极易在其中繁衍增殖，造成环境污染，危害食用菌生产，也影响人类生活健康。国内外对食用菌废料的循环利用途径大致有重复栽培食用菌、作为家畜家禽的饲料、作为肥料、生产沼气等，但未见利用其制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的报道。因此，合理的开发利用食用菌栽培废料用以制备苏云金杆菌生物农药，不仅可以广辟资源，化废为宝，降低生产成本，而且减少对环境的污染，具有显著的生态效应和经济效应。 

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法，通过简单的处理和发酵工艺将菌糠制备成附加值较高的生物农药，既可解决菌糠的环境污染问题，又实现了其资源化利用与最终处置，还降低了生物农药的生产成本，变废为宝。所述菌糠指袋栽食用菌，收获后的培养料剩余物。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法，其特征在于操作步骤如下：

1）菌糠的预处理：将脱袋后的杏鲍菇菌糠于50~90℃条件下干燥至含水重量百分率不高于15%，进而粉碎成直径不大于5 cm的碎块；取粉碎后的菌糠10~30 kg，加入100~200 L重量体积比为1%~5%的强酸，60~100℃下浸泡0.5~2.5 h，同时用搅拌机以不低于2 rpm的速度搅拌；向所形成的渣液中加入碱调节pH至6.5~7.5，转移至分离槽，去渣后，浊液进入压滤机进行板框压滤或离心机离心，收集滤液，制成菌糠浸提液；

所述强酸是H₂SO₄或HCl；所述碱是CaO、或NaOH、或Ca(OH)₂；所述板框压滤，指过滤压力不大于0.45 MPa，过滤温度不高于80℃；所述离心机离心，指离心转速不低于900 rpm，离心时间不少于5 min；

2）培养基成分补充：在经预处理的菌糠提取液中加入4~8 kg黄豆饼粉、0.125~0.325 kg尿素、0.1~0.3 kg KH₂PO₄、0.125~0.325 kg CaCO₃、0.1~0.25 kg MgSO₄或MgCl₂、0.01~0.025 kg MnSO₄或MnCl₂、0.1~0.25 L TritonX-100，用水定容至500 L；搅拌均匀后在种子罐或发酵罐中经每平方英寸为15磅压力，121℃灭菌20~30 min，制成苏云金杆菌液态发酵培养基。

所述KH₂PO₄、CaCO₃、MgSO₄、MgCl₂、MnSO₄、MnCl₂、TritonX-100、尿素为化学纯，均可在市场上购得。

苏云金杆菌杀虫剂的制备：对上述灭菌后的液态发酵培养基接入苏云金杆菌菌种，按常规液体发酵培养苏云金杆菌的方法发酵培养苏云金杆菌；然后干燥、粉碎得到苏云金杆菌生物农药原粉。生物农药原粉加入添加剂后能够调配成可湿性粉剂、水分散片、泡腾片等不同剂型的生物农药。

本发明的技术原理是：通过强酸将菌糠中的纤维素和杏鲍菇菌丝体降解为苏云金杆菌可利用的糖分与少量蛋白质、磷以及微量元素，同时补充部分氮源与无机盐离子，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，苏云金杆菌得以生长与繁殖，形成芽孢与杀虫晶体蛋白等杀虫活性物质，发酵液经浓缩干燥制成绿色、环保且无二次污染的微生物杀虫剂产品。

本发明具有以下优点：

1）解决了菌糠的处理问题，既防治了有用物质的流逝与对环境的污染，又实现了资源化综合利用，起到变废为宝的功效。

2）现有苏云金杆菌微生物杀虫剂主要以葡萄糖、玉米淀粉、麦麸、蛋白胨、黄豆粉、酵母粉等工农业产品或农副产品为发酵原料，原料价格过高是其难以普及的主要限制因素。本发明中苏云金杆菌主要依靠菌糠自身的可利用成分（多糖、蛋白质与矿质盐等）生长与增殖，添加的成分较少，因此可大大降低微生物杀虫剂的生产成本。

3）与现有技术——菌糠提取葡萄糖或发酵制酒精相比，本发明不需要昂贵复杂的提取精制工艺，并且所得浸提液中氨基酸的提取率较高，因此具有较好的经济可行性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。   

实施例一：一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法

一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：

1、菌糠原料粉制备：

按表1条件提取杏鲍菇菌糠的营养成分，将调节好pH的浸提液转移至分离槽，去渣后，浊液进入压滤机进行板框压滤，获得的滤液即为菌糠浸提液；所述板框压滤，指过滤压力为0.3 MPa，过滤温度为50℃；

表1 杏鲍菇菌糠原料粉加工方法 

2、培养基成分补充：按表2的方法向菌糠浸提液中补充营养成分并用水定容至500 L，搅拌均匀并经15磅/平方英寸压力，121℃灭菌21 min，得到液态发酵培养基。

表2 液态培养基配制方法

 

在表1和2的13种制备方法中，苏云金杆菌液态发酵培养基的最佳制备方法为：

1、菌糠的预处理：将脱袋后的杏鲍菇菌糠于90℃干燥至含水重量百分率为10%，进而粉碎成直径为3cm的碎块；取粉碎后的菌糠20kg，加入200 L重量体积比为1%的H₂SO₄，于100℃浸泡2 h，并以2 rpm的速度搅拌；用Ca(OH)₂调节所形成渣液的pH至7，然后转移至分离槽；去渣后，浊液进入压滤机进行板框压滤，过滤压力为0.3 MPa，过滤温度为50℃，获得菌糠浸提液；

2、培养基成分补充：在经预处理的菌糠提取液中加入黄豆饼粉6 kg、NH₄NO₃  0.225 kg、CaCO₃  0.25 kg、KH₂PO₄  0.2 kg、MgSO₄  0.1 kg、MnSO₄  0.01 kg、TritonX-100 0.1 L，初始pH 7.0，加水定容至500 L，搅拌均匀并经每平方英寸为15磅压力，121℃灭菌21 min后，制成苏云金杆菌液态发酵培养基。

苏云金杆菌液态发酵培养基的使用方法：1、种子罐发酵：将培养基接种苏云金杆菌菌株的摇瓶菌液，进行发酵培养；发酵条件为：接种量1%~3%（V/V），罐温28~32℃，罐压0.02~0.06MPa，通气量1:1.0~1.5V/V/min，搅拌速度220~260 rpm，发酵时间8~12 h。2、发酵罐发酵：按8%~15%的接种量（V/V）将种子液移到发酵罐，发酵条件为：罐温28~32℃，罐压0.02~0.06MPa，通气量1:1.0~1.5（V/V/min），搅拌速度220~260 rpm，发酵时间20~42 h。放罐标准：伴孢晶体脱落20%、发酵液pH为8.5~9.0。3、发酵液后处理：在发酵液中加入20~50g/L的分散剂与1~4g/L乳化剂，搅拌均匀，送入喷雾干燥塔，进风温度150~220℃，出口温度 60~70℃，至含水率不高于4%，即为苏云金杆菌生物农药原粉。生物农药原粉加入添加剂后能够调配成可湿性粉剂、水分散片、泡腾片等不同剂型的生物农药。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法，其特征在于操作步骤如下：

1）菌糠的预处理：将脱袋后的杏鲍菇菌糠于50~90℃条件下干燥至含水重量百分率不高于15%，进而粉碎成直径不大于5 cm的碎块；取粉碎后的菌糠10~30 kg，加入100~200 L重量体积比为1%~5%的强酸，60~100℃下浸泡0.5~2.5 h，同时用搅拌机以不低于2 rpm的速度搅拌；向所形成的渣液中加入碱调节pH至6.5~7.5，转移至分离槽，去渣后，浊液进入压滤机进行板框压滤或离心机离心，收集滤液，制成菌糠浸提液；

所述强酸是H₂SO₄或HCl；所述碱是CaO、或NaOH、或Ca(OH)₂；所述板框压滤，指过滤压力不大于0.45 MPa，过滤温度不高于80℃；所述离心机离心，指离心转速不低于900 rpm，离心时间不少于5 min；

2）培养基成分补充：在经预处理的菌糠提取液中加入4~8 kg黄豆饼粉、0.125~0.325 kg尿素、0.1~0.3 kg KH₂PO₄、0.125~0.325 kg CaCO₃、0.1~0.25 kg MgSO₄或MgCl₂、0.01~0.025 kg MnSO₄或MnCl₂、0.1~0.25 L TritonX-100，用水定容至500 L；搅拌均匀后在种子罐或发酵罐中经每平方英寸为15磅压力，121℃灭菌20~30 min，制成苏云金杆菌液态发酵培养基。

2.根据权利要求1所述的一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法，其特征在于操作步骤如下：

1）菌糠的预处理：将脱袋后的杏鲍菇菌糠于90℃干燥至含水重量百分率为10%，进而粉碎成直径为3cm的碎块；取粉碎后的菌糠20kg，加入200 L重量体积比为1%的H₂SO₄，于100℃浸泡2 h，并以2 rpm的速度搅拌；用Ca(OH)₂调节所形成渣液的pH至7，然后转移至分离槽；去渣后，浊液进入压滤机进行板框压滤，过滤压力为0.3 MPa，过滤温度为50℃，获得菌糠浸提液；

2）培养基成分补充：在经预处理的菌糠提取液中加入黄豆饼粉6 kg、NH₄NO₃  0.225 kg、CaCO₃  0.25 kg、KH₂PO₄  0.2 kg、MgSO₄  0.1 kg、MnSO₄  0.01 kg、TritonX-100 0.1 L，初始pH 7.0，加水定容至500 L，搅拌均匀并经每平方英寸为15磅压力，121℃灭菌21 min后，制成苏云金杆菌液态发酵培养基。