CN104046583A

CN104046583A - 一种苏云金芽胞杆菌液态培养基及其制备方法

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Publication number: CN104046583A
Application number: CN201410276046.6A
Authority: CN
Inventors: 郑琦; 周军; 姚祖杰; 林白容; 章秋萍; 马蓉; 袁瀚; 沈小娟; 关雄; 黄小红
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University; Luzhou Pinchuang Technology Co Ltd
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University; Luzhou Pinchuang Technology Co Ltd
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2014-09-17

Abstract

本发明属于微生物培养基技术领域，具体涉及一种苏云金芽胞杆菌液态培养基及其制备方法。本发明苏云金芽胞杆菌液态培养基是以白酒酒糟浸提液、黄豆饼粉、酵母、碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸锰和硫酸锌为原料，将其混匀灭菌即可。使用本发明的培养基培养苏云金芽胞杆菌制备得到的苏云金芽孢杆菌生物农药原粉具有很强的杀虫活性。本发明的培养基可大大降低苏云金芽胞杆菌杀虫剂的成本，还解决了白酒酒糟污染环境的问题，实现了酿酒业废弃资源的充分利用。

Description

一种苏云金芽胞杆菌液态培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物培养基技术领域，具体涉及一种苏云金芽胞杆菌液态培养基及其制备方法。

背景技术

虫害是限制农作物稳高产的一个重要的因素，每年被害虫侵吞的粮食占总产量的1/4左右。长久以来人们投入大量的精力去研制化学农药，却没能解决问题，同时还面临着一些无法解决的问题，如人畜中毒，环境污染等。因此随着人们环保意识的不断增强，生物农药引起越来越多的关注。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是内生芽胞的革兰氏阳性菌，在芽胞形成初期会形成杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，简称ICP)，其对目标害虫高效专一，对非目标生物安全，对鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目和同翅目等多种害虫有特异杀虫活性。苏云金芽孢杆菌制剂克服了传统化学农药危害人畜、污染环境和易产生抗性等缺点，具有安全、选择性强和原料简单等优点，是目前世界上产量最大的微生物杀虫剂。近几十年来，人们对苏云金芽胞杆菌的发酵生产做了大量的研究，已形成了较为成熟的生产工艺，且苏云金芽胞杆菌对生存环境要求不高，在含氮0.075％～0.225％，含糖0.1％～1.5％和碳氮比0.44～20.0％的范围内都能良好地生长。目前，一般采用成本低、当地可得的工农业废弃物作为发酵生产苏云金芽胞杆菌的原料，例如，淀粉工厂废液、食用菌菌糠、蚕丝蚕蛹废料、沼渣、味精废水等都被尝试作为Bt发酵生产的原料。

白酒以大米、玉米、糯米、高粱、大麦、小麦、豌豆等为主要原料，以高粱糠、玉米蕊、稻壳等为填充料，采用固态或半固态法酿造、蒸馏而成，蒸馏之后的残渣就是白酒酒糟。据统计，我国白酒酿造业每年耗粮2000万吨，产生1700万吨的白酒酒糟。白酒酒糟中含有7％～11％的淀粉，丰富的蛋白质和氨基酸，还含有丰富的磷、钾等无机元素及戊糖、总糖和脂肪等成分，此外，还可能存在由微生物菌体产生的核糖核酸、嘌呤等微量有益成分，但是白酒酒糟中含有残留的酒精、醛和杂醇油等，呈酸性，极易腐败变质，如果不加以处理，会严重污染环境。目前，白酒酒糟已经运用到很多方面，如，利用白酒酒糟制取甘油、培养食用菌、提取复合物氨基酸及微量元素、生产饲料蛋白等。

发明内容

本发明的目的是提供一种苏云金芽胞杆菌液态培养基及其制备方法。本发明既解决了白酒酒糟污染环境的问题，又实现了酿酒业废弃资源的充分利用，还降低了生物农药的生产成本，变废为宝。

本发明所解决的第一个技术问题是提供一种苏云金芽胞杆菌液态培养基。该培养基由以下重量配比的组分混合稀释而成：白酒酒糟提取液75～125份、黄豆饼粉0.5～6份、酵母0.075～0.275份、碳酸钙0.1～0.4份、磷酸二氢钾0.075～0.275份、硫酸锰0.0075～0.0275份、硫酸锌0.0075～0.0275份。

优选的，上述培养基由以下重量配比的组分混合稀释而成：白酒酒糟提取液95～105份、黄豆饼粉1～4份、酵母0.1～0.25份、碳酸钙0.2～0.3份、磷酸二氢钾0.1～0.25份、硫酸锰0.01～0.025份、硫酸锌0.01～0.025份。

最优选的，上述培养基由以下重量配比的组分混合稀释而成：白酒酒糟提取液100份、黄豆饼粉2份、酵母0.2份、碳酸钙0.25份、磷酸二氢钾0.2份、硫酸锰0.02份、硫酸锌0.02份。

具体的，上述培养基中，白酒酒糟提取液的制备方法为：将白酒酒糟干燥至含水量在15％以下，粉碎后加入酸溶液、碱溶液或水在50～121℃下浸泡1～3h，离心，收集上清液，再调节pH至6.5～7.5，稀释1～3倍，即为白酒酒糟提取液。

进一步的，上述培养基中，白酒酒糟提取液的制备方法中边浸泡边搅拌。

优选的，上述培养基中，白酒酒糟提取液的制备方法中每1L酸溶液中加入1～4kg干燥后的白酒酒糟。

具体的，上述培养基中，白酒酒糟提取液的制备方法中所述的酸溶液为体积浓度0.5～2.0％硫酸。

具体的，上述培养基中，白酒酒糟提取液的制备方法中所述的碱溶液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钙水溶液中的任意一种。

进一步的，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5～2.0g/100mL。

进一步的，所述氢氧化钙水溶液的浓度为0.2～4.0g/100mL。

进一步优选的，上述培养基中，白酒酒糟提取液的制备方法中每1L氢氧化钠水溶液中加入干燥后的白酒酒糟1～4kg。

进一步优选的，上述培养基中，白酒酒糟提取液的制备方法中每1L氢氧化钙水溶液中加入干燥后的白酒酒糟0.5～10kg。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述苏云金芽胞杆菌液态培养基的制备方法。该方法包括以下步骤：在白酒酒糟提取液中加入黄豆饼粉、酵母、碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸锰和硫酸锌，混匀后加水稀释3～6倍，灭菌后即为苏云金芽胞杆菌液态培养基。

具体的，上述制备方法中所述的离心转速不低于10000rpm，时间不低于3min。

优选的，上述制备方法中所述的灭菌条件为压力102.9kPa、温度121℃下灭菌20min。

本发明所要解决的第三个问题是提供一种苏云金芽胞杆菌液态培养基在培养苏云金芽胞杆菌菌种的用途。

苏云金芽孢杆菌生物农药原粉是由上述的苏云金芽胞杆菌液态培养基培养苏云金芽胞杆菌菌种，按常规培养微生物的方法发酵、干燥、粉碎所得到的。

在苏云金芽孢杆菌生物农药原粉中加入添加剂后调配成的可湿性粉剂、水分散片或泡腾片等不同剂型的生物农药。

本发明方法充分利用了白酒酒糟，既防止了其对环境的污染与有用物质的流失，又实现了资源的综合利用，起到了变废为宝的功效。本发明方法与现有技术如生产生态型肥料或制取甘油等相比，提取工艺简单，并且所得提取液中多糖的提取率较高，具有经济可行性。现有的苏云金芽胞杆菌微生物杀虫剂主要以玉米淀粉、麦麸、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨等工农业副产品为发酵原料，价格较高。本发明主要利用白酒酒糟自身的有用成分如多糖、微量元素、蛋白质等生长与繁殖，其他的添加成分较普通发酵原料少，可大大降低苏云金芽胞杆菌杀虫剂的成本。

具体实施方式

一种苏云金芽胞杆菌液态培养基由以下重量配比的组分混合稀释而成：白酒酒糟提取液75～125份、黄豆饼粉0.5～6份、酵母0.075～0.275份、碳酸钙0.1～0.4份、磷酸二氢钾0.075～0.275份、硫酸锰0.0075～0.0275份、硫酸锌0.0075～0.0275份。

进一步的，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5～2.0g/100mL。

进一步的，所述氢氧化钙水溶液的浓度为0.2～4.0g/100mL。

上述苏云金芽胞杆菌液态培养基的制备方法包括以下步骤：在白酒酒糟提取液中加入黄豆饼粉、酵母、碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸锰和硫酸锌，混匀后加水稀释3～6倍，灭菌后即为苏云金芽胞杆菌液态培养基。

优选的，上述制备方法中所述的灭菌条件为压力102.9kPa、温度121℃灭菌20min。

上述苏云金芽胞杆菌液态培养基在培养苏云金芽胞杆菌菌种的用途。

一种苏云金芽孢杆菌生物农药原粉，由上述的苏云金芽胞杆菌液态培养基培养苏云金芽胞杆菌菌种，按常规培养微生物的方法发酵、干燥、粉碎所得到的。

本发明原料中所述黄豆饼粉为食品级，碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸锰和硫酸锌均为工业纯，均可在市场购买。

本发明通过酸溶液、碱溶液或水将白酒酒糟中的纤维素降解为可被苏云金芽胞杆菌利用的糖与少量蛋白质、微量元素以及磷等，同时补充适当的无机盐离子和氮源，在维持适宜的温度、通气量和pH值的条件下，使得苏云金芽胞杆菌生长与繁殖，形成芽胞和杀虫晶体蛋白等杀虫活性物质，发酵液经过浓缩干燥可以制成绿色环保的微生物杀虫粉剂。

白酒酒糟提取液的主要作用是提供苏云金芽孢杆菌生长所需的碳源；黄豆饼粉和酵母粉的主要作用是提供苏云金芽胞杆菌生长过程中所需的主要氮源；KH₂PO₄主要作用是作为核蛋白、磷脂、核酸、辅酶及ATP等高分子的成分，并作为缓冲系统调剂培养基pH值；CaCO₃的作用是作为某些酶的辅因子，维持酶的稳定性并且是芽孢形成所需的重要因子；MnSO₄的作用是作为过氧化物歧化酶、磷酸烯醇式脱羧酶和柠檬酸合成酶的重要成分，促进菌体的快

速分裂和增殖；ZnSO4的作用是满足菌体的生长需求。

试验例1 制备白酒酒糟提取液

表1 中体积单位为L，时间单位为h，酒糟单位为kg，搅拌速度单位为r/min。

表1 白酒酒糟提取液的制备

本发明选择了21种处理方式对白酒酒糟进行浸提，结果见上表1，经过分析发现，经H₂SO₄处理后白酒酒糟提取液中还原糖浓度最高，进一步的，将上述21种处理方式所得的白酒酒糟提取液对苏云金芽胞杆菌进行发酵培养，结果表明，0.5％H₂SO₄处理得到的白酒酒糟提取液培养苏云金芽孢杆菌后其活菌数和芽孢数最多，故0.5％H₂SO₄处理为最优的处理方式。

下表2中处理1～21所使用的白酒酒糟提取液分别为表1中处理1～21的方法制备的相对应的白酒酒糟提取液，再按表2的配方向白酒酒糟提取液中补充营养成分并用水定容至500L，搅拌均匀并在102.9kPa、121℃下灭菌20min，得到液态培养基；表2中各原料单位均为kg。

表2 液态培养基配制配方

由上述表2中数据得出，在0.5％H₂SO₄处理得到的白酒酒糟提取液中添加黄豆饼粉2kg、ZnSO₄0.02kg、CaCO₃0.25kg、MnSO₄0.02kg、KH₂PO₄0.2kg、酵母0.2kg，其活菌数和芽孢数最多，故其为最佳配方。

实施例1

采用处理13得到的100kg白酒酒糟提取液，并添加黄豆饼粉2kg、ZnSO₄0.02kg、CaCO₃0.25kg、MnSO₄0.02kg、KH₂PO₄0.2kg、酵母0.2kg，混匀，加水定容至500L，搅拌灭菌。按种子液与苏云金芽胞杆菌液态培养基的体积比为10％将种子液移到发酵罐，发酵条件为：温度30℃，压力0.03MPa，搅拌速度230r/min，当伴孢晶体脱落20％时停止发酵。其活菌数为121×10⁸/ml，芽孢数为296×10⁷/ml。

实施例2

采用处理15得到的100kg白酒酒糟提取液，并添加黄豆饼粉1kg、ZnSO₄0.01kg、CaCO₃0.2kg、MnSO₄0.01kg、KH₂PO₄0.1kg、酵母0.1kg，混匀，加水定容至500L，搅拌灭菌。按种子液与苏云金芽胞杆菌液态培养基的体积比为10％将种子液移到发酵罐，发酵条件为：温度30℃，压力0.03MPa，搅拌速度230r/min，当伴孢晶体脱落20％时停止发酵。其活菌数为118×10⁸/ml，芽孢数为168×10⁷/ml。

实施例3

采用处理19得到的100kg白酒酒糟提取液，并添加黄豆饼粉4kg、ZnSO₄0.025kg、CaCO₃0.3kg、MnSO₄0.025kg、KH₂PO₄0.25kg、酵母0.25kg，混匀，加水定容至500L，搅拌灭菌。按种子液与苏云金芽胞杆菌液态培养基的体积比为10％将种子液移到发酵罐，发酵条件为：温度30℃，压力0.03MPa，搅拌速度230r/min，当伴孢晶体脱落20％时停止发酵。其活菌数为6×10⁸/ml，芽孢数为36×10⁷/ml。

实施例4

采用处理13得到的100kg白酒酒糟提取液，并添加黄豆饼粉0.5kg、ZnSO₄0.0075kg、CaCO₃0.1kg、MnSO₄0.0075kg、KH₂PO₄0.075kg、酵母0.075kg，混匀，加水定容至500L，搅拌灭菌。按种子液与苏云金芽胞杆菌液态培养基的体积比为10％将种子液移到发酵罐，发酵条件为：温度30℃，压力0.03MPa，搅拌速度230r/min，当伴孢晶体脱落20％时停止发酵。其活菌数为33×10⁸/ml，芽孢数为47×10⁷/ml。

综上所述，通过本发明方法不仅可以充分利用酿酒后的白酒酒糟，同时通过添加硫酸锌、硫酸锰、碳酸钙、磷酸二氢钾、酵母和黄豆饼粉制备出的苏云金芽胞液体培养基能够使苏云金芽胞杆菌很好地生长，能够产生出更高的活菌数、芽胞数，从而能够很好地应用于生物杀虫领域，为农作物的除虫方式提供了一种更好地选择。

Claims

1.一种苏云金芽胞杆菌液态培养基，其特征在于：由以下重量配比的组分混合稀释而成：白酒酒糟提取液75～125份、黄豆饼粉0.5～6份、酵母0.075～0.275份、碳酸钙0.1～0.4份、磷酸二氢钾0.075～0.275份、硫酸锰0.0075～0.0275份、硫酸锌0.0075～0.0275份。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：由以下重量配比的组分混合稀释而成：白酒酒糟提取液95～105份、黄豆饼粉1～4份、酵母0.1～0.25份、碳酸钙0.2～0.3份、磷酸二氢钾0.1～0.25份、硫酸锰0.01～0.025份、硫酸锌0.01～0.025份。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：由以下重量配比的组分混合稀释而成：白酒酒糟提取液100份、黄豆饼粉2份、酵母0.2份、碳酸钙0.25份、磷酸二氢钾0.2份、硫酸锰0.02份、硫酸锌0.02份。

4.根据权利要求1～3任一项所述的培养基，其特征在于：白酒酒糟提取液的制备方法为：将白酒酒糟干燥至含水量在15％以下，粉碎后加入酸溶液、碱溶液或水在50～121℃下浸泡1～3h，离心，收集上清液，再调节pH至6.5～7.5，稀释1～3倍，即为白酒酒糟提取液。

5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：所述的酸溶液为体积浓度0.5～2.0％硫酸；每1L酸溶液中加入1～4kg干燥后的白酒酒糟。

6.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：所述的碱溶液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钙水溶液中的任意一种。

7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于：所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5～2.0g/100mL；每1L氢氧化钠水溶液中加入干燥后的白酒酒糟1～4kg。

8.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于：所述氢氧化钙水溶液的浓度为0.2～4.0g/100mL；每1L氢氧化钙水溶液中加入干燥后的白酒酒糟0.5～10kg。

9.权利要求1～8任一项所述培养基的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：在白酒酒糟提取液中加入黄豆饼粉、酵母、碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸锰和硫酸锌，混匀后加水稀释3～6倍，灭菌后即为苏云金芽胞杆菌液态培养基。

10.权利要求1～8任一项所述的苏云金芽胞杆菌液态培养基在培养苏云金芽胞杆菌菌种的用途。