一种微生物发酵制备生物多肽有机肥的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种利用微生物发酵生产生物多肽有机肥料的方法与生物多肽有机肥的应用,属于有机肥生产技术领域。
背景技术
多肽是指与蛋白质具有同样结构和成分的小分子活性物质,一般由2-100个氨基酸组成。外源多肽不仅可以为作物提供有机营养物质,而且可以调节作物的生理功能,活化作物细胞活性,提高作物的抗逆性能,降低作物发病机率。近年来,多肽在农作物栽培中节约肥料、提高肥料利用率等方面的研究越来越多,含有多肽的肥料越来越受到重视,例如,CN103204735A(CN201310116458)公开了一种活性多肽水溶肥及其制备方法,其特征是:按重量百分数计,10~20%的水解活性多肽以及80%-90%的无机肥与微量元素混合而成,其中活性多肽,采用水解动植物蛋白,经中和过滤后,用滤液喷雾干燥取得。CN101139221A(CN200710016349)涉及一种固体多肽肥的制备方法,它以蓖麻饼(粕)、菜籽饼(粕)、豆饼(粕)等含植物蛋白质物料中的任何一种为原料,经粉碎过筛、酸法控制水解、出料调pH值、烘干粉碎、造粒包装等工艺制备而成。CN101747093A(CN200910248459)是一种以维生素C生产工艺形成的废弃发酵醪液和古龙酸母液生产菌体蛋白和多肽有机肥的方法,在100份维生素C废弃醪液蛋白中添加5-20份古龙酸母液,调pH值至2.0-5.0,然后经温和水解0.5-12小时。醪液蛋白中的部分蛋白质被水解,变成多肽和氨基酸,溶于水中,经调解pH值和适当浓缩,再补加适量微量元素即成为多肽有机肥。上述中国专利文件是利用酸解的方式将有机物中蛋白质水解成小分子多肽,生产多肽肥料。酸法水解需要在压力釜内、高温加压条件下进行,成本高,安全性差;另一方面,生产过程中需要使用大量的酸和碱,不利于环保;再者,酸解蛋白质所得到的多肽形态单一,生物活性有限。
CN102079674A提供了一种微生物有机肥,由秸秆、面粉(玉米粉或豆粉)、石灰、磷酸二氢钾、水和液体混合菌种NEM组成,液体混合菌种NEM的加入量是秸秆、面粉、石灰、磷酸二氢钾和水总重量的5-10%;所述的液体混合菌种NEM,由枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、植物乳杆菌、光合菌和成团泛菌经发酵培养后制成。该文件由于多种微生物在同一环境中生长繁殖,相互之间产生竞争或抑制作用,尽管个别菌种在有机物发酵过程中能产生多肽成分,但其数量达不到应有的效果。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供一种微生物发酵制备生物多肽有机肥料的方法。
本发明还提供制得的生物多肽有机肥料的应用。
发明概述:
本发明以原料丰富的工、农业废弃物为主要原料,再配以蛋白质含量丰富的麦麸、豆饼等,先经过初级处理以溶出所含蛋白质;再先后利用两种微生物将原料中的不同蛋白质分解,形成多种形态的生物多肽成分,制备成以多肽为高效成分的生物多肽有机肥。经过试验,取得了良好的增产效果。
术语说明:
PDA斜面培养基,是对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称,配方:马铃薯200份,葡萄糖20份,琼脂15~20份,自来水1000份。
糠醛渣,是以玉米芯、玉米秆、稻壳、棉籽壳等为原料生产糠醛(呋喃甲醛)过程中的废渣,作为一种生物质类废弃物含有大量的纤维素、半纤维素、木质素等。
发明详述:
本发明的技术方案如下:
一种微生物发酵制备生物多肽有机肥料的方法,步骤如下:
(1)制备解淀粉芽孢杆菌菌液
a、用PDA斜面培养基将解淀粉芽孢杆菌菌种活化;
b、按质量份,取新鲜土豆100份,葡萄糖20份,蛋白胨2份,牛肉膏2份,磷酸二氢钾2份,硫酸镁2份,氯化钠1份,水1000份,按常规方法制备成液体培养基A;将步骤a活化后的解淀粉芽孢杆菌接入制成的液体培养基A中,于28~32℃、200转/分钟的摇瓶中培养24~28小时;得解淀粉芽孢杆菌菌液;菌液菌活2×109个/克~5×109个/克;备用;
(2)制备枯草芽孢杆菌菌液
a、用PDA斜面培养基将枯草芽孢杆菌菌种活化;
b、按质量份,取大豆粉50份,葡萄糖20份,玉米淀粉10份,蛋白胨2份,酵母粉2份,磷酸二氢钾2份,硫酸镁1份,水1000份,按常规方法制备成液体培养基B;将步骤a活化后的枯草芽孢杆菌接入制成的液体培养基B中,于28~30℃、200转/分钟的摇瓶中培养20~24小时;得枯草芽孢杆菌菌液;菌液菌活1×109个/克~5×109个/克;备用;
(3)按质量份,取糠醛渣40~50份,食用菌培养料废渣40~50份,麦麸3~6份,豆饼4~7份,混合均匀,调整水分含量至65%~70%,于20~30℃条件下放置22~30小时;常规灭菌,得混合料,备用;
(4)按质量份,取步骤(3)制备的混合料,按3~6wt%的接种量接入步骤(1)制备的解淀粉芽孢杆菌菌液,混匀,于28~33℃条件下放置24~35小时,然后提高温度至40~50℃,继续放置65~85小时,期间每隔20~28小时翻拌一次,结束后将温度降至30~32℃,得解淀粉芽孢杆菌发酵物;
(5)取步骤(4)制备的解淀粉芽孢杆菌发酵物,按8~12wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌菌液,混匀,以石灰调节pH至8.0~8.5(此处是利用枯草芽孢杆菌所分泌的酶类分解蛋白质产生多肽,这些酶类需要碱性条件),于45~55℃条件下放置60~72小时,期间每隔20~24小时翻拌一次,发酵结束后烘干或凉干;得本发明微生物发酵生物多肽有机肥。有机肥含生物多肽7.3%~8.5%,质量百分比。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),优选中国农业微生物菌种保藏管理中心(AgriculturialCultureCollectionofChina英文缩写ACCC)的ACCC10149或ACCC19735。解淀粉芽孢杆菌菌液的制备也可按现有技术,本发明提供步骤(1)的方法是优选的。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),优选中国农业微生物菌种保藏管理中心(AgriculturialCultureCollectionofChina英文缩写ACCC)的ACCC19266或ACCC19269。枯草芽孢杆菌菌液的制备也可按现有技术,本发明提供步骤(2)的方法是优选的。
所述的食用菌培养料废渣粉碎至粒径小于0.5厘米,麦麸、豆饼粉碎过40目筛。
所述的食用菌培养料废渣是栽培杏鲍菇、平菇、白灵菇等菇类废弃的菌棒。主要利用其中的棉籽壳、玉米芯、麦麸、锯末、菌丝体等成分。
根据本发明优选的,步骤(3)中:糠醛渣45份,食用菌培养料废渣45份,麦麸4份,豆饼6份,于25℃条件下放置28小时。
根据本发明优选的,步骤(4)中:混合料的解淀粉芽孢杆菌菌液接种量为4wt%,于32℃条件下放置30小时,然后提高温度至45℃,继续放置72小时,期间每隔24小时翻拌一次。
根据本发明优选的,步骤(5)中:解淀粉芽孢杆菌发酵物的枯草芽孢杆菌菌液接种量为10wt%,pH值8.3,于50℃条件下放置66小时,期间每隔22小时翻拌一次。
上述制备方法中未详细限定的均按现有技术。
本发明方法制备的微生物发酵生物多肽有机肥的应用,特别适用于蔬菜、果树、草本水果等作物。
本发明方法制备的微生物发酵生物多肽有机肥的施用方法,采用撒施或穴施方式:
a.撒施方式:将本发明肥料在作物种植前均匀撒施于土壤表面翻耕入土;
b.穴施方式:施于栽植穴或播种穴内,与土混合后在其上移栽幼苗或播种。
本发明微生物发酵生物多肽有机肥肥料用量如下:
撒施时:蔬菜作物每亩500~800公斤,果树每亩300~600公斤,草本水果每亩700~1000公斤;
穴施时:蔬菜作物每亩200~400公斤,草本水果每亩300~500公斤。
本发明的优良效果如下:
1、肥效好
本发明先后利用两种微生物分别对有机物中蛋白质分解,减少了微生物之间的相互影响,提高了多肽的转化效率,作物增产效果好。大田试验结果显示,与对比例相比本发明肥料在大棚黄瓜种植实验增产高达8.9%,草莓增产高达9.4%。
2、肥料中多肽形态丰富
本发明先后利用两种微生物对富含蛋白质的有机原料发酵处理,其中,所用的解淀粉芽孢杆菌主要分解原料中的酪蛋白,所用枯草芽孢杆菌则分解丝蛋白,不同的蛋白质其结构、氨基酸组成等不同,分解后形成的肽键也不同,因此,两种微生物结合使不同的蛋白质分解成多种形式的多肽,有利于促进作物更好的生长。
3、充分利用废弃资源
糠醛渣和食用菌培养料废渣都含有较多的粗蛋白,以工、农业废弃物糠醛渣和食用菌培养料废渣作为本发明有机肥生产的主要原料,原料来源广,先经过初级处理以溶出所含蛋白质再先后利用两种微生物对原料发酵处理;既充分利用了其中所含的蛋白质,又便于大规模生产,变废为宝,符合循环经济、可持续发展的农业产业要求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明,但不限于此。实施例中的原料用量份数均为质量份,所有的百分比均为质量百分比,特别说明的除外。
解淀粉芽孢杆菌选用ACCC10149、ACCC19735,中国农业微生物菌种保藏管理中心购得,其中实施例1-2用ACCC10149,实施例3-4用ACCC19735。
枯草芽孢杆菌选用ACCC19266、ACCC19269,中国农业微生物菌种保藏管理中心购得,其中实施例1-2用ACCC19266,实施例3-4用ACCC19269。
食用菌培养料废渣粉碎至粒径小于0.5厘米,其中实施例1-2用栽培杏鲍菇的培养料废渣,实施例3-4用栽培平菇的培养料废渣,麦麸、豆饼粉碎过40目筛。
实施例1:一种微生物发酵制备生物多肽有机肥的方法,步骤如下:
(1)制备解淀粉芽孢杆菌菌液
a、用PDA斜面培养基将解淀粉芽孢杆菌菌种ACCC10149活化。
b、取新鲜土豆100克,切片,加水煮沸20分钟,虑掉残渣,加入葡萄糖20克,蛋白胨2克,牛肉膏2克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁2克,氯化钠1克,补足水分至1000克,按常规方法灭菌,制成液体培养基;将步骤a活化后的解淀粉芽孢杆菌接入制成的液体培养基中,于30℃、200转/分钟的摇瓶中培养26小时;得解淀粉芽孢杆菌菌液,其菌活3.78×109个/克。
(2)制备枯草芽孢杆菌菌液
a、用PDA斜面培养基将枯草芽孢杆菌菌种ACCC19266活化;
b、取大豆粉50克,加水煮沸20分钟,加入葡萄糖20克,玉米淀粉10克,蛋白胨2克,酵母粉2克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁1克,补足水分至1000克,按常规方法灭菌,制成液体培养基;将步骤a活化后的枯草芽孢杆菌接入制成的液体培养基中,于29℃、200转/分钟的摇瓶中培养22小时;得枯草芽孢杆菌菌液,其菌活2.12×109个/克。
(3)取糠醛渣45公斤,栽培杏鲍菇培养料废渣45公斤,麦麸4公斤,粉碎的豆饼6公斤,混合均匀,调整水分含量至65%~70%,于25℃条件下放置28小时;常规灭菌,得混合料。
(4)取步骤(3)制备的混合料100公斤,按4wt%的接种量接入步骤(1)制备的解淀粉芽孢杆菌菌液,混匀,于32℃条件下放置30小时,然后提高温度至45℃,继续放置72小时,期间每隔24小时翻拌一次,结束后将温度降至30~32℃,得解淀粉芽孢杆菌发酵物。
(5)取步骤(4)制备的解淀粉芽孢杆菌发酵物100公斤,按10wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌菌液,混匀,以石灰调节pH至8.3,于50℃条件下放置66小时,期间每隔22小时翻拌一次,发酵结束后烘干或凉干;得本发明微生物发酵生物多肽有机肥。本实施例有机肥多肽总含量约8.5wt%。
实施例2:一种微生物发酵生物多肽有机肥的制备,步骤如下:
(1)解淀粉芽孢杆菌菌液的制备同实施例1,菌种ACCC10149。
(2)枯草芽孢杆菌菌液的制备同实施例1,菌种ACCC19266。
(3)取糠醛渣50公斤,栽培杏鲍菇培养料废渣40公斤,麦麸6公斤,粉碎的豆饼4公斤,混合均匀,调整水分含量至65%~70%,于22℃条件下放置24小时;常规灭菌,得混合料。
(4)取步骤(3)制备的混合料100公斤,按6wt%的接种量接入步骤(1)制备的解淀粉芽孢杆菌菌液,混匀,于28℃条件下放置33小时,然后提高温度至50℃,继续放置68小时,期间每隔23小时翻拌一次,结束后将温度降至30~32℃,得解淀粉芽孢杆菌发酵物。
(5)取步骤(4)制备的解淀粉芽孢杆菌发酵物100公斤,按8wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌菌液,混匀,以石灰调节pH至8.0,于45℃条件下放置71小时,期间每隔24小时翻拌一次,发酵结束后烘干或凉干;得本发明微生物发酵生物多肽有机肥。本实施例有机肥多肽总含量约7.3wt%。
实施例3:一种微生物发酵生物多肽有机肥的制备,步骤如下:
(1)解淀粉芽孢杆菌菌液的制备同实施例1,菌种ACCC19735,菌液菌活2.62×109个/克。
(2)枯草芽孢杆菌菌液的制备同实施例1,菌种ACCC19269,菌液菌活4.17×109个/克。
(3)取糠醛渣40公斤,栽培平菇培养料废渣50公斤,麦麸5公斤,粉碎的豆饼5公斤,混合均匀,调整水分含量至65%~70%,于28℃条件下放置22小时;常规灭菌,得混合料。
(4)取步骤(3)制备的混合料100公斤,按5wt%的接种量接入步骤(1)制备的解淀粉芽孢杆菌菌液,混匀,于30℃条件下放置28小时,然后提高温度至48℃,继续放置75小时,期间每隔25小时翻拌一次,结束后将温度降至30~32℃,得解淀粉芽孢杆菌发酵物;
(5)取步骤(4)制备的解淀粉芽孢杆菌发酵物100公斤,按12wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌菌液,混匀,以石灰调节pH至8.5,于55℃条件下放置60小时,期间每隔20小时翻拌一次,发酵结束后烘干或凉干;得本发明微生物发酵生物多肽有机肥。本实施例有机肥多肽总含量约8.4wt%。
实施例4:一种微生物发酵生物多肽有机肥的制备,步骤如下:
(1)解淀粉芽孢杆菌菌液的制备同实施例1,菌种ACCC19735,菌液菌活2.62×109个/克。
(2)枯草芽孢杆菌菌液的制备同实施例1,菌种ACCC19269,菌液菌活4.17×109个/克。
(3)取糠醛渣48公斤,栽培平菇培养料废渣42公斤,麦麸3公斤,粉碎的豆饼7公斤,混合均匀,调整水分含量至65%~70%,于30℃条件下放置30小时;常规灭菌,得混合料。
(4)取步骤(3)制备的混合料100公斤,按3wt%的接种量接入步骤(1)制备的解淀粉芽孢杆菌菌液,混匀,于33℃条件下放置25小时,然后提高温度至42℃,继续放置80小时,期间每隔27小时翻拌一次,结束后将温度降至30~32℃,得解淀粉芽孢杆菌发酵物。
(5)取步骤(4)制备的解淀粉芽孢杆菌发酵物100公斤,按9wt%的接种量接入步骤(2)制备的枯草芽孢杆菌菌液,混匀,以石灰调节pH至8.2,于52℃条件下放置68小时,期间每隔23小时翻拌一次,发酵结束后烘干或凉干;得本发明微生物发酵生物多肽有机肥。本实施例有机肥多肽总含量约7.8wt%。
对比例1:如实施例1所述,所不同的是,省去步骤(5)。
在步骤(3)混合料上仅接种步骤(1)的解淀粉芽孢杆菌菌液,堆置发酵,发酵条件同实施例1。发酵结束后烘干,所得有机肥多肽总含量约3.63wt%。节省步骤(5)。
对比例2:如实施例1所述,所不同的是,省去步骤(4)。
在步骤(3)混合料上直接接种步骤(2)的枯草芽孢杆菌菌液,按实施例1步骤(5)的条件堆置发酵,发酵结束后烘干,所得有机肥多肽总含量约3.16wt%。
对比例3:如实施例1所述,所不同的是,合并步骤(4)、(5)。
在步骤(3)混合料上同时接种步骤(1)的解淀粉芽孢杆菌菌液、步骤(2)的枯草芽孢杆菌菌液,于48℃条件下放置69小时堆置发酵,发酵结束后烘干,所得有机肥多肽总含量约5.15wt%。
实施例1~4和对比例的应用效果如下:
试验时间:2014年9月至2015年6月。
1、寿光大棚黄瓜试验:设实施例1~4和对比例1~3共7个处理。每个小区面积18平方米,实施例1~4的产品用量每亩300公斤,对比例肥料用量与实施例相同。施用方法是在黄瓜移栽前施入栽培穴内,与土混合后栽植黄瓜幼苗,其它肥料施用按农民习惯统一进行,所有的管理措施一致。应用效果见表1。
表1.与对比例相比实施例1~4的黄瓜应用增产效果%
本发明肥料 |
相比于对比例1增产率% |
相比于对比例2增产率% |
相比于对比例3增产率% |
实施例1 |
8.9 |
7.3 |
5.8 |
实施例2 |
7.6 |
7.0 |
4.9 |
实施例3 |
8.3 |
6.5 |
5.1 |
实施例4 |
6.4 |
6.8 |
5.0 |
2、肥城草莓试验:设实施例1~4和对比例1~3共7个处理。每个小区面积20平方米,实施例1~4的产品用量每亩400公斤,对比例肥料用量与实施例相同。施用方法是在草莓移栽前施入栽培穴内,与土混合后栽植幼苗,其它肥料施用按农民习惯统一进行,所有的管理措施一致。应用效果见表2。
表2.与对比例相比实施例1~4的草莓应用增产效果%
本发明肥料 |
相比于对比例1增产率% |
相比于对比例2增产率% |
相比于对比例3增产率% |
实施例1 |
9.4 |
8.4 |
4.3 |
实施例2 |
8.3 |
5.9 |
5.0 |
实施例3 |
7.6 |
6.7 |
4.9 |
实施例4 |
8.1 |
5.6 |
3.8 |