TWI654297B

TWI654297B - 可提高白樺茸之三萜類化合物含量的培養基及其製備方法

Info

Publication number: TWI654297B
Application number: TW106114026A
Authority: TW
Inventors: 王伯綸
Original assignee: 天明製藥股份有限公司
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2019-03-21
Also published as: TW201839122A

Abstract

本發明係有關於一種可提高白樺茸之三萜類化合物含量的培養基，其至少包括：一乾料部分，其重量百分比濃度為50%~70%，該乾料部分包含至少一種穀類組合物；以及一營養液，其重量百分比濃度為30%~50%。該營養液係依下列組成比例與方法調配所預先混合：其重量百分比濃度為1%~9%並且包括至少一種含碳化合物的一第一成分；其重量百分比濃度為1%~5%並且包括至少一種含氮化合物的一第二成分；其重量百分比濃度為3%~9%的一柿樹萃取液；以及其重量百分比濃度為77%~95%的水。

Description

可提高白樺茸之三萜類化合物含量的培養基及其製備方法

本發明係提供一種白樺茸的培養基及其製備方法，尤指一種可提高白樺茸中的三萜類化合物產量之培養基及其製備方法。

白樺茸(Inonotus obliquus)是一種民間藥用真菌，主要分佈於俄羅斯及東歐地區，菌絲體內含有大量中的葡聚糖、異多醣體、果膠等物質，可作為細胞膜成分之一，特別是多醣類的BRM(Biological Response Modifiers)物質中葡聚糖的含量較高，可以提升免疫細胞的活力，具有抑制癌細胞擴散、防止癌症復發、避免胃腸吸收到致癌物質等效果，其營養和藥用價值逐漸引起人民的關注，成為醫藥工業和保健品工業的熱門開發領域。

白樺茸中除含有前述多醣類外、亦有研究顯示其富含三萜類化合物，具有改善血液循環、調整血壓以及降低血液膽固醇的作用。然而，目前野生的白樺茸價格昂貴，且來源日益枯竭，很難滿足市場的需求。使用人工栽培如固態發酵培養技術，由於現階段栽培困難，產量較低。現有白樺茸之固態培養基，多以木屑和麥麩搭配其他營養物質製備培養基，並無法有效提高白樺茸菌絲體產物的產量。此外，以人工方式培養之白樺茸，所含之有效成分三萜類化合物的成份比率均較天然生成之野生白樺茸來得低。因此，如何提高人工培養白樺茸中的三萜類化合物含量佔比，是為目前白樺茸培養相關研究的熱門課題。

本發明係鑑於前述習知技術之課題者，其目的在於提供一種新穎的白樺茸的固態培養基以及其製備方法，在藉由添加特殊營養液之固態發酵模擬白樺茸天然的生長環境，並維持產物營養成份的同時，亦能有效率的提升白樺茸所含之有效成分三萜類化合物的產量。

有鑑於前述之問題與缺失，發明人以多年之經驗累積，並發揮想像力與創造力，在不斷試作與修改之後，始有本發明之一種可提高白樺茸之三萜類化合物之培養基配方。

本發明之主要目的係提供一種可提高白樺茸之三萜類化合物含量的培養基，其至少包括：一乾料部分，其重量百分比濃度為50%~70%，該乾料部分包含至少一種穀類組合物；以及一營養液，其重量百分比濃度為30%~50%。該營養液係依下列組成比例與方法調配所預先混合：其重量百分比濃度為1%~9%並且包括至少一種含碳化合物的一第一成分；其重量百分比濃度為1%~5%並且包括至少一種含氮化合物的一第二成分；其重量百分比濃度為3%~9%的一柿樹萃取液；以及其重量百分比濃度為77%~95%的水。

根據本發明之一較佳實施態樣，其中該穀類組合物係選自至少二種由以下禾本科植物所組成之群組或其組合物：燕麥、大麥、薏仁、稻米、小米、玉米、高粱、黑麥及小麥。

根據本發明之一較佳實施態樣，其中該該柿樹萃取液是萃取自柿樹科(Ebenaceae)植物之葉、莖或果所製備者。

根據本發明之一較佳實施態樣，其中該柿樹萃取液係依以下方法所製備：將柿樹(Diospyros kaki)之葉經清洗、烘乾後，加入30%之酒精中煮沸1.5小時，柿樹葉與該30%酒精的重量比為1：20，過濾後向該濾液中加入乙酸乙酯，該濾液與該乙酸乙酯的重量比為1：0.6，混勻後靜置5~10小時，待溶液分層後取上層液即完成製備。

根據本發明之一較佳實施態樣，其中該營養液之酸鹼值介於約5至8。

根據本發明之一較佳實施態樣，其中該第一成分係選自一種由以下成份所組成之群組或其組合物：蔗糖、果糖、麥芽糖及葡萄糖。

根據本發明之一較佳實施態樣，其中該第二成分係選自一種由以下成份所組成之群組或其組合物：綠豆粉、黃豆粉、酵母菌萃取物、蛋白腖、各種胺基酸、尿素、醋酸胺、氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀及硝酸鈉。

根據本發明之一較佳實施態樣，其中該乾料部分之重量百分濃度為60%，該營養液之重量百分比濃度為40%，該穀類組合物係由燕麥與小麥以1：1的重量比例混合而組成者，該柿樹萃取液之重量百分濃度為6%

本發明另提供了一種可提高白樺茸之三萜類化合物含量之培養基的製備方法，其步驟包括：(A)製備乾料部分，其佔培養基總重量之重量百分比濃度為50%~70%，該乾料部分包含至少一種穀類組合物，該穀類組合物係選自至少二種由以下禾本科植物所組成之群組或其組合物：燕麥、大麥、薏仁、稻米、小米、玉米、高粱、黑麥及小麥；(B)製備一營養液，其佔培養基總重量之重量百分比濃度為30%~50%，其係依下列組成比例與方法調配所預先混合：其重量百分比濃度為1%~9%並且包括至少一種含碳化合物的一第一成分；其重量百分比濃度為1%~5%並且包括至少一種含氮化合物的一第二成分；其重量百分比濃度為3%~9%的一柿樹萃取液；以及其重量百分比濃度為77%~95%的水；以及(C)混合該乾料部分以及該營養液以形成一初始培養基，其中該乾料部分完全吸收該營養液。

本發明係揭露一種可提高白樺茸之三萜類化合物含量的之固態培養基配方及其製備方法，將培養基之成分及其含量作適當的調配，最後得出將穀類組合物以及特殊營養液進行混合，其中該特殊營養液含有硝酸銨(NH₄NO₃)做為氮源、含有葡萄糖作為碳源，證實該添加柿樹萃取液之營養液的固態培養基具有提高白樺茸之三萜類化合物含量的功效。請參考圖示與下列之說明，其中之目的係為說明本發明之最佳實施例，而非用以限制本發明之範圍。藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。

菌絲體的培養與取得

於本實施例中，菌絲體的培養係選用白樺茸(Inonotus obliquus)菌絲體進行發酵。一般而言，醱酵方法有兩類：固態與液體深層醱酵。前者係將菌絲體接種於含有碳源或氮源之固態培養基(例如堆肥和木屑)進行培養而得到之生菌絲體或乾燥菌絲體。後者，則是使用固定組成之液態培養基，在適當的環境下進行微生物的培養，以製造生質(Biomass)與其他的代謝產物(Metabolite)。本實施例係選擇前者方式培養白樺茸菌絲。

實施例1-可提高白樺茸之三萜類化合物含量的固態培養基之製備方法

步驟一：製備乾料部分，其佔培養基總重量之重量百分比濃度為50%~70%，該乾料部分包含至少一種穀類組合物，該穀類組合物係選自至少二種由以下禾本科植物所組成之群組或其組合物：燕麥、大麥、薏仁、稻米、小米、玉米、高粱、黑麥及小麥；步驟二：製備一營養液，其佔培養基總重量之重量百分比濃度為30%~50%，並且係依下列組成比例與方法調配所預先混合：其重量百分比濃度為1%~9%並且包括至少一種含碳化合物的一第一成分，其係選自但不限於葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、蔗糖(sucrose)、麥芽糖(maltose)或其組合；重量百分比濃度為1%~5%並且包括至少一種含氮化合物的一第二成分，係選自但不限於酵母菌萃取物(yeast extract)、蛋白腖(peptone)、尿素(urea)、醋酸胺(CH₃COONH₄)、氯化銨 (NH₄Cl)、硝酸銨(NH₄NO₃)、硝酸鉀(KNO₃)、硝酸鈉(NaNO₃)或其組合；重量百分比濃度為3%~9%的一柿樹萃取液；以及其重量百分比濃度為77%~95%的水；步驟三：混合該乾料部分以及該營養液以形成一初始培養基，其中該乾料部分完全吸收該營養液；以及步驟四：將該初始培養基經滅菌處理。

前述穀類組合物以及營養液間調配的濃度比例，係依據每100公克之該穀類組合物，添加42~100公克之該營養液。前述營養液完成製備後，調整其酸鹼值介於5至8。柿樹萃取物可萃取自柿樹科(Ebenaceae)植物之葉、莖或果。

前述柿樹萃取液係以具下列方式所製備：將柿樹(Diospyros kaki)之葉經清洗、烘乾後，加入30%之酒精中煮沸1.5小時，柿樹葉與該30%酒精的重量比為1：20，過濾後向該濾液中加入乙酸乙酯，該濾液與該乙酸乙酯的重量比為1：0.6，混勻後靜置5~10小時，待溶液分層後取上層液，得到該柿樹萃取液。

實施例2-可提高白樺茸之三萜類化合物含量的固態培養基

本實施例之白樺茸固態培養基的製備方法主要如實施例1所述，其中各組成之濃度依照以下所列進行製備，提供一種重量百分比濃度為50%~70%的穀類組合物，其係依照重量比例1：1混合的燕麥與小麥所組成；其重量百分比濃度為30%~50%的營養液，該營養液係依下列組成比例與方法調配所預先混合：提供碳源之第一成分係選自葡萄糖，其重量百分比濃度1~9%；提供氮源之第二成分係選自硝酸銨(NH₄NO₃)，其重量百分比濃度1~5%；其重量百分比濃度為3~9%的一柿樹萃取液；以及其重量百分比濃度為77~95%的水。營養液完成製備後，調整其酸鹼值為6.8。在本實施例中，柿樹萃取液係以具下列方式所製備：將柿樹(Diospyros kaki)之葉經清洗、烘乾後，加入30%之酒精中煮沸1.5小時，柿樹葉與該30%酒精的重量比為1：20，過濾後向該濾液中加入乙酸乙酯，該濾液與該乙酸乙酯的重量比為1：0.6，混勻後靜置8小時，待溶液分層後取上層液，得到該柿樹萃取液。

實施例3-較佳白樺茸固態培養基

本實施例之白樺茸固態培養基的製備方法主要如實施例1所述，其中各組成之濃度依照以下所列進行製備，提供一種重量百分比濃度為60%的穀類組合物，其係依照重量比例1：1混合的燕麥與小麥所組成；其重量百分比濃度為40%的營養液，該營養液係依下列組成比例與方法調配所預先混合：提供碳源之第一成分係選自葡萄糖，其重量百分比濃度2.3%；提供氮源之第二成分係選自硝酸銨(NH₄NO₃)，其重量百分比濃度2.7%；其重量百分比濃度為6%的一柿樹萃取液；以及其重量百分比濃度為89%的水。營養液完成製備後，調整其酸鹼值為6.8。在本實施例中，柿樹萃取液係以具下列方式所製備：將柿樹(Diospyros kaki)之葉經清洗、烘乾後，加入30%之酒精中煮沸1.5小時，柿樹葉與該30%酒精的重量比為1：20，過濾後向該濾液中加入乙酸乙酯，該濾液與該乙酸乙酯的重量比為1：0.6，混勻後靜置8小時，待溶液分層後取上層液，並經減壓濃縮、真空乾燥後得到最終萃取物。

實驗例-本發明以及傳統固態培養基對於白樺茸菌絲體之三萜類化合物產量的影響

本實驗例係將白樺茸菌株植入至含有本發明之固態培養基之培養瓶；在菌絲體萌發初期，較怕雜菌感染，所需之氧氣交換較少、產出的二氧化碳及熱也較少，此時將溫度控制在攝氏25至30度，濕度控制在70%左右，以利菌絲體萌發生長。待菌絲體生長至直徑3公分時，雜菌的危害相對較小、所需之氧氣交換較多、產出的二氧化碳及熱也較多，此時將溫度控制在攝氏22至27度，濕度控制在50%，以利菌絲體持續生長。待菌絲體長至直徑8公分，為適合採摘之大小，可對白樺茸菌絲體產物進行採收。

白樺茸從植入菌株至菌絲體生長至直徑3公分大小的天數，稱為第一階段，使用一般培養基約需耗時10至20日。而白樺茸菌絲體直徑3公分生長至直徑8公分大小最適採摘階段的天數，稱為第二階段，使用一般培養基約需耗時10至15日。本實驗例是將實施例2及實施例3中製得該本發明之固態培養基對白樺茸進行培養，並以未添加柿樹萃取物之傳統固態培養基配方培養白樺茸作為對照組，培養70日後進行白樺茸菌絲體產物的採收，並將採收而得之產物進行三萜類化合物之粗萃取步驟。粗萃取步驟係分別利用水、50%酒精、95%酒精作為萃取液，在50℃的溫度條件下萃取30分鐘後，計算各組三萜類化合物之產量與進行比較，實驗結果請參照以下表1及表2。

根據實驗結果可得知，無論以水或任何濃度的酒精進行萃取，本發明之培養基配方所萃取出之三萜類化合物含量均高於對照組，顯見本發明之培養基配方確實可有效促進白樺茸生產三萜類化合物含量。

綜上所述，本發明之可提高白樺茸之三萜類化合物含量的固態培養基及其製備方法，其優點在於能以易於取得之材料製作培養基配方從而成功培養出白樺茸菌絲體產物，並且製備步驟簡單，亦能達到降低培養人力與時間成本之功效。

甚者，本發明相較於習知技術主要在於透過特殊培養基配方的改良，添加含有柿樹萃取物之營養液，進而使該白樺茸菌絲體產物中之三萜類化合物的佔比提升。此外，本發明於培養過程中的溫、濕度等環境參數均可參照習知白樺茸之固態培養方式，不需特別調控，故具有不需擔心原料匱乏、操作簡單、易於推廣應用，及能夠節省培養過程中的人事與成本等優點。

Claims

一種提高白樺茸之三萜類化合物含量的培養基，其至少包括：一乾料部分，其重量百分比濃度為50%~70%，該乾料部分包含至少一種穀類組合物，該穀類組合物包含燕麥及小麥；以及一營養液，其重量百分比濃度為30%~50%，該營養液包含：(a)一第一成分，其重量百分比濃度為1%~9%的葡萄糖；(b)一第二成分，其重量百分比濃度為1%~5%的硝酸銨；(c)一柿樹萃取液，其重量百分比濃度為3%~9%，其中該柿樹萃取液係依以下方法所製備：將柿樹(Diospyros kaki)之葉經清洗、烘乾後，加入30%之酒精中煮沸1.5小時，柿樹葉與該30%酒精的重量比為1：20，過濾後向該濾液中加入乙酸乙酯，該濾液與該乙酸乙酯的重量比為1：0.6，混勻後靜置5~10小時，待溶液分層後取上層液即完成製備；以及(d)水，其重量百分比濃度為77%~95%。
如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中該營養液之酸鹼值介於約5至8。
如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中該乾料部分之重量百分比濃度為60%，該營養液之重量百分比濃度為40%，該穀類組合物係由燕麥與小麥以1：1的重量比例混合而組成者，該柿樹萃取液之重量百分比濃度為6%。
一種可提高白樺茸之三萜類化合物含量之培養基的製備方法，其步驟包括： (A)製備乾料部分，其佔培養基總重量之重量百分比濃度為50%~70%，該乾料部分包含至少一種穀類組合物，該穀類組合物包含燕麥及小麥；(B)製備一營養液，其佔培養基總重量之重量百分比濃度為30%~50%，其係依下列組成比例與方法調配所預先混合：包含重量百分比濃度為1%~9%葡萄糖的一第一成分；包含重量百分比濃度為1%~5%硝酸銨的一第二成分；其重量百分比濃度為3%~9%的一柿樹萃取液；以及其重量百分比濃度為77%~95%的水，其中該柿樹萃取液係依以下方法所製備：將柿樹(Diospyros kaki)之葉經清洗、烘乾後，加入30%之酒精中煮沸1.5小時，柿樹葉與該30%酒精的重量比為1：20，過濾後向該濾液中加入乙酸乙酯，該濾液與該乙酸乙酯的重量比為1：0.6，混勻後靜置5~10小時，待溶液分層後取上層液，並經減壓濃縮、真空乾燥後完成製備；以及(C)混合該乾料部分以及該營養液以形成一初始培養基，其中該乾料部分完全吸收該營養液。
如申請專利範圍第4項所述之製備方法，其中該營養液之酸鹼值介於約5至8。