CN102757993A - 一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，属于微生物工程和生物防治领域，借助紫外线UVC进行诱变，分离纯化苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis菌株，经活化、种子培养后接入发酵培养基，进行饥饿培养，发酵液经过高速冷冻离心，用生理盐水洗涤、稳定，再经无菌水反复洗涤、离心，分离出纯度达到99％以上的伴孢晶体。与现有技术相比，本发明操作更简便、周期短、成本也相对较低，此方法提取的伴孢晶体纯度达到99％以上，本发明分离纯化的伴孢晶体单一性强，形态均一，便于对伴孢晶体毒力蛋白杀虫机理的研究。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程及生物防治领域，尤其是涉及一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，其菌体为短杆状、有鞭毛。当菌体营养生长到一定阶段时，菌体的一端会形成芽孢，另一端形成近菱状的蛋白质晶体称之为伴孢晶体。菌体破裂后可释放出芽孢和伴孢晶体，伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性。
苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。人工制备时，菌种干粉需要经过活化、种子培养、发酵培养等步骤产生大量的伴孢晶体。伴孢晶体的分离纯化方法种类比较多，纯化得到的晶体纯度不一，本发明采用高速冷冻离心法分离纯化。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作更简便、周期短，伴孢晶体单一性强、形态均一的制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)活化培养：将苏云金芽孢杆菌接种在斜面培养基上，控制温度为28～32℃斜面培养24～48小时，作为活化种子；
(2)种子培养：将活化种子接种在液体种子培养基上，控制温度为28～32℃，在120～200rpm转速下，培养24～36h，作为种子液；
(3)发酵培养：将种子液按照1～5v/v％的接种量接入发酵培养基，控制温度为28～32℃，在120～200rpm转速下，培养3～5天，得到饥饿培养后的菌株发酵液；
(4)伴孢晶体分离纯化：饥饿培养后的菌株发酵液分装于离心管中，4℃，转速为4000～6000rpm下冷冻离心15～30min，将得到的沉淀用0.1～0.5wt％的生理盐水洗涤，然后在4℃，4000～6000rpm下冷冻离心15～30min，再用无菌水洗涤，反复3～5次后即得到苏云金芽孢杆菌伴孢晶体。
所述的伴孢晶体主要为菱形。
所述的苏云金芽孢杆菌采用以下步骤制备：
(1)菌种活化：将普通的苏云金芽孢杆菌接种到斜面培养基上，控制温度为28～32℃斜面培养12～48h，作为活化菌种；
(2)诱变处理：利用无菌水将活化菌种稀释10-6～10-12倍，转接入平板培养基上，控制紫外线装置与活化菌种的距离为30～50cm，对该菌种的正面照射3～5min，反复3～8次，最后筛选出所需要的苏云金芽孢杆菌即可。
所需要的苏云金芽孢杆菌的菌株形态特征：营养菌体呈杆状，钝圆，菌体有鞭毛，芽孢呈椭圆形，端生。
所述的斜面培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15～20g/L，pH为7.2。
所述的液体种子培养基包括以下组分及含量：胰蛋白胨5.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖1.0g/L、磷酸氢二钠0.8g/L，pH为7.2。
所述的发酵培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨5g/L、酵母浸膏2.5g/L、氯化钠5g/L，pH为7.2。
所述的平板培养基包括以下组分及含量：胰蛋白胨10g/L、酵母膏5.0g/L，氯化钠10g/L、琼脂15g/L，pH为7.2。
所述的生理盐水为市售的Triton-X100生理盐水。
与现有技术相比，本发明在生物防治等领域提供了一个新的产有效杀虫蛋白的菌株，操作更简便、周期短、成本也相对较低，此方法提取的伴孢晶体纯度达到99％以上，本发明分离纯化的伴孢晶体单一性强，形态均一，便于对伴孢晶体毒力蛋白杀虫机理的研究。
附图说明
图1为苏云金芽孢杆菌BtTJLZ1109的SEM图；
图2为2μm级尺度下的Bt TJLZ1109伴孢晶体及菌体SEM图；
图3为1μm级尺度下的Bt TJLZ1109伴孢晶体SEM图；
图4为0.2μm级尺度下的Bt TJLZ1109伴孢晶体SEM图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
在紫外杀菌后的超净台中，用接种环挑取本实验室保藏的母株，接种到斜面培养基上，30℃下活化培养48小时。
用移液管向活化后的菌株上注入1mL无菌水，振荡后移液枪吸取一定菌液，注入试管中，无菌水稀释10-10倍。均匀滴加到事先已灭菌处理好的平板培养基上，无菌涂布棒均匀涂布。涂布后将培养基置于距紫外灯40cm处正面照射，反复照射3次，每次5min。
紫外光处理后，用接种环依次挑取单菌落，分别“之”字形接种到斜面培养基上，30℃下培养48h。挑取单菌落扫描电镜镜检观察。结果见图1所示，苏云金芽孢杆菌的菌株形态特征：营养菌体呈杆状，钝圆，菌体有鞭毛，芽孢呈椭圆形，端生。
实施例2
用接种环挑取Bt TJLZ1109菌株，接种在斜面培养基上，30℃下活化培养24h。接种环挑取活化种子接种入液体种子培养基，30℃，130rpm转速下摇床培养24h。用移液枪将种子培养液以1％的比例接入到发酵培养基中，30℃，130rpm摇床培养3天。
将发酵培养液分装到50mL离心管中，4500rpm，4℃冷冻离心20min。弃去上清液，0.1％Triton-X100的生理盐水洗涤沉淀物，4500rpm，4℃再次冷冻离心20min。弃去上清液，用无菌水洗涤沉淀，再次于4500rpm，4℃冷冻离心20min。无菌水洗涤沉淀，冷冻离心反复3次。最终沉淀用无菌水制成菌悬液，伴孢晶体主要为菱形，扫描电镜不同倍数下镜检观察。结果见2、3、4图所示。
实施例3
一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)活化培养：将苏云金芽孢杆菌接种在斜面培养基上，控制温度为28℃斜面培养48小时，作为活化种子，使用的斜面培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，pH为7.2；
(2)种子培养：将活化种子接种在液体种子培养基上，控制温度为28℃，在120rpm转速下，培养36h，作为种子液，使用的液体种子培养基包括以下组分及含量：胰蛋白胨5.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖1.0g/L、磷酸氢二钠0.8g/L，pH为7.2；
(3)发酵培养：将种子液按照1v/v％的接种量接入发酵培养基，控制温度为28℃，在120rpm转速下，培养5天，得到饥饿培养后的菌株发酵液，使用的发酵培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨5g/L、酵母浸膏2.5g/L、氯化钠5g/L，pH为7.2；
(4)伴孢晶体分离纯化：饥饿培养后的菌株发酵液分装于离心管中，4℃，转速为4000rpm下冷冻离心30min，将得到的沉淀用0.1wt％的Triton-X100生理盐水洗涤，然后在4℃，4000rpm下冷冻离心30min，再用无菌水洗涤，反复3次后即得到苏云金芽孢杆菌伴孢晶体，伴孢晶体主要为菱形。
苏云金芽孢杆菌采用以下步骤制备：
(1)菌种活化：将普通的苏云金芽孢杆菌接种到斜面培养基上，控制温度为28℃斜面培养48h，作为活化菌种，使用的斜面培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，pH为7.2；
(2)诱变处理：利用无菌水将活化菌种稀释10-6倍，转接入平板培养基上，控制紫外线装置与活化菌种的距离为30cm，对该菌种的正面照射5min，反复3次，最后筛选出所需要的苏云金芽孢杆菌即可，苏云金芽孢杆菌的菌株形态特征：营养菌体呈杆状，钝圆，菌体有鞭毛，芽孢呈椭圆形，端生，使用的平板培养基包括以下组分及含量：胰蛋白胨10g/L、酵母膏5.0g/L，氯化钠10g/L、琼脂15g/L，pH为7.2。
实施例4
一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)活化培养：将苏云金芽孢杆菌接种在斜面培养基上，控制温度为32℃斜面培养24小时，作为活化种子，使用的斜面培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，pH为7.2；
(2)种子培养：将活化种子接种在液体种子培养基上，控制温度为32℃，在200rpm转速下，培养24h，作为种子液，使用的液体种子培养基包括以下组分及含量：胰蛋白胨5.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖1.0g/L、磷酸氢二钠0.8g/L，pH为7.2；
(3)发酵培养：将种子液按照5v/v％的接种量接入发酵培养基，控制温度为32℃，在200rpm转速下，培养3天，得到饥饿培养后的菌株发酵液，使用的发酵培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨5g/L、酵母浸膏2.5g/L、氯化钠5g/L，pH为7.2；
(4)伴孢晶体分离纯化：饥饿培养后的菌株发酵液分装于离心管中，4℃，转速为6000rpm下冷冻离心15min，将得到的沉淀用0.5wt％的Triton-X100生理盐水洗涤，然后在4℃，6000rpm下冷冻离心15min，再用无菌水洗涤，反复5次后即得到苏云金芽孢杆菌伴孢晶体，伴孢晶体主要为菱形。
苏云金芽孢杆菌采用以下步骤制备：
(1)菌种活化：将普通的苏云金芽孢杆菌接种到斜面培养基上，控制温度为32℃斜面培养12h，作为活化菌种，使用的斜面培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，pH为7.2；
(2)诱变处理：利用无菌水将活化菌种稀释10-12倍，转接入平板培养基上，控制紫外线装置与活化菌种的距离为50cm，对该菌种的正面照射3min，反复8次，最后筛选出所需要的苏云金芽孢杆菌即可，苏云金芽孢杆菌的菌株形态特征：营养菌体呈杆状，钝圆，菌体有鞭毛，芽孢呈椭圆形，端生。
Claims (7)
1.一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)活化培养：将精制的苏云金芽孢杆菌接种在斜面培养基上，在28～32℃的温度下斜面培养24～48小时，作为活化种子；
(2)种子培养：将活化种子接种在液体种子培养基上，控制温度为28～32℃，在120～200rpm转速下，培养24～36h，作为种子液；
(3)发酵培养：将种子液按照1～5v/v％的接种量接入发酵培养基，控制温度为28～32℃，在120～200rpm转速下，培养3～5天，得到饥饿培养后的菌株发酵液；
(4)伴孢晶体分离纯化：饥饿培养后的菌株发酵液分装于离心管中，4℃，转速为4000～6000rpm下冷冻离心15～30min，将得到的沉淀用0.1～0.5wt％的生理盐水洗涤，然后在4℃，4000～6000rpm下冷冻离心15～30min，再用无菌水洗涤，反复3～5次后即得到苏云金芽孢杆菌伴孢晶体。
2.根据权利要求1所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，其特征在于，所述的精制的苏云金芽孢杆菌采用以下步骤制备：
(1)菌种活化：将普通的苏云金芽孢杆菌接种到斜面培养基上，在28～32℃的温度下斜面培养12～48h，作为活化菌种；
(2)诱变处理：利用无菌水将活化菌种稀释10-6～10-12倍，转接入平板培养基上，控制紫外线装置与活化菌种的距离为30～50cm，对该菌种的正面照射3～5min，反复3～8次，最后筛选出所需的精制的苏云金芽孢杆菌即可。
3.根据权利要求1或2所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，其特征在于，所述的斜面培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15～20g/L，pH为7.2。
4.根据权利要求1所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，其特征在于，所述的液体种子培养基包括以下组分及含量：胰蛋白胨5.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖1.0g/L、磷酸氢二钠0.8g/L，pH为7.2。
5.根据权利要求1所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括以下组分及含量：牛肉膏蛋白胨5g/L、酵母浸膏2.5g/L、氯化钠5g/L，pH为7.2。
6.根据权利要求2所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，其特征在于，所述的平板培养基包括以下组分及含量：胰蛋白胨10g/L、酵母膏5.0g/L，氯化钠10g/L、琼脂15g/L，pH为7.2。
7.根据权利要求1所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，其特征在于，所述的生理盐水为市售的Triton-X100生理盐水。
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| CN109593680A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-09 | 武汉科诺生物科技股份有限公司 | 一种苏云金杆菌液体发酵培养基及其菌粉和油悬剂 |
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2011
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| CN109593680A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-09 | 武汉科诺生物科技股份有限公司 | 一种苏云金杆菌液体发酵培养基及其菌粉和油悬剂 |
| CN109593680B (zh) * | 2018-12-26 | 2022-02-22 | 武汉科诺生物科技股份有限公司 | 一种苏云金杆菌液体发酵培养基及其菌粉和油悬剂 |
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