CN103224904A - 红假单胞菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及相应的制备方法和在防治辣椒疫病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株红假单胞菌菌株，其名称为红假单胞菌PSB-06，其保藏编号为CCTCC No：M2012518。本发明还公开了一种由前述菌株经活化、种子培养、生产培养后得到的生防菌剂，该生防菌剂的制备包括活化、种子培养和生产培养多个步骤。本发明还公开了一种由前述生防菌剂经发酵、离心后制得的红假单胞菌菌株的生防发酵液。本发明的红假单胞菌菌株、生防菌剂和生防发酵液均可在拮抗辣椒疫霉菌或防控辣椒疫病中进行应用。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，尤其涉及一种红假单胞菌菌株及其菌液，还涉及相应的制备工艺和在农业病虫害防治中的应用。
背景技术
辣椒，又叫番椒、海椒、辣子、辣角、秦椒等，是一种茄科辣椒属植物。辣椒属为一年或多年生草本植物，辣椒是人们饮食生活中一种不可缺少的蔬菜和调味品。目前，辣椒已发展成我国仅次于大白菜的第二大蔬菜作物，其产值和效益则居蔬菜作物之首。
辣椒生产受多种病虫害的影响，辣椒疫病是其中主要的土传病害之一。该病害分布范围广，在我国各辣椒种植区均有发生；传播途径多，可通过雨水、灌溉水、气流以及土壤等传播；危害损失重，在高温、高湿条件下，短期内即可引起大面积死苗、烂叶和烂果，不仅严重影响辣椒的产量和品质，严重时甚至可导致绝收。关于辣椒疫病的防治目前主要是采用化学药剂，如以溴甲烷为代表的卤代烃类化学熏蒸剂以及甲霜灵等杀菌剂，但因化学药剂残留及造成的环境污染问题已日渐突出，其应用也越来越受到限制。因此，有关化学药剂的替代技术已经成为当今土传病虫害防治的研究热点之一。
生物防治作为一种化学药剂的替代技术，目前已成为国内外研究的热点，其优点是对人畜安全无毒，不污染环境，无残留，不易使病原菌产生耐药性，且生产工艺较简单，不少生防微生物还具有促进作物生长的作用等特点。目前从土壤、植物体内已有分离筛选到大量对辣椒疫病具有控制作用的生防菌资源的研究，但已有的生防菌在防治效果、成本控制及操作便利性还有待进一步改善。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对目前辣椒生产中土传病害（辣椒疫病）发生严重、化学防治难度大、成本高、农药残留、抗药性日益突出等问题，提供一种工艺简单、绿色环保、使用方便的红假单胞菌菌株及其制备的相应生防菌剂和生防发酵液，并同时提供相应菌剂、发酵液的制备方法和应用，该应用可防治辣椒疫病。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一株红假单胞菌菌株，其属于光合细菌（Photosynthetic Bacterium）菌株，所述红假单胞菌（Rhodopseudomonas sp.）菌株的名称为红假单胞菌PSB-06（Rhodopseudomonas sp.PSB-06），其在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）的保藏编号为CCTCC No：M2012518，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年12月7日。
上述本发明的菌株属革兰氏阴性菌，经鉴定为红假单胞菌，其主要生物学特征为：双层固体平板培养基上，培养5d～7d，形成红色的圆形菌落，边缘整齐光滑，菌落直径0.25mm～0.55mm；液体培养基中培养6d呈深红色；G-，能在厌氧或微好氧条件下生长；生理生化特性：V-P反应、甲基红反应均阴性；H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃～35℃，pH7.0～7.2；菌体16S rDNA序列长度为1430bp，在GenBank中的登录号为EU004438。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的红假单胞菌菌株在拮抗辣椒疫霉菌或防控辣椒疫病中的应用。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种红假单胞菌菌株的生防菌剂，所述生防菌剂主要是由上述红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养后得到。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）活化：将上述本发明的红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法（采用光合细菌固体培养基）进行培养，培养至红色单菌落出现；
（2）种子培养：将步骤（1）培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30℃～35℃、光照条件为3000Lx～4000Lx、自然pH条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期；
（3）生产培养：将步骤（2）种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基（其成分可与上述光合细菌液体培养基相同）进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的0.5%～5%（优选为1%～2%），在温度为30℃～35℃、光照条件为3000Lx～4000Lx条件下，培养至对数生长期，最后得到的培养液即为所述红假单胞菌菌株的生防菌剂。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述生防菌剂在防控辣椒疫病中的应用。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述红假单胞菌菌株的生防发酵液，该生防发酵液主要是由上述生防菌剂经发酵、离心后制得的上清液。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述生防发酵液的制备方法，包括以下步骤：将上述本发明的生防菌剂经发酵培养5d～7d（优选6d左右），发酵培养在温度为30℃～35℃、光照条件为3000Lx～4000Lx条件下进行，发酵培养基可采用上述的光合细菌生产培养基，培养完成后在6000rpm～8000rpm（优选6000rpm）下离心4min～10min（优选5min左右），收集离心后的上清液，经过滤器过滤后得到生防发酵液。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述生防发酵液在拮抗辣椒疫霉菌中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明的红假单胞菌PSB-06的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷低成本的操作方法制备得到防治辣椒疫病的生防菌剂及生防发酵液；
2、本发明红假单胞菌PSB-06制备得到的生防菌剂及生防发酵液不仅对辣椒疫病有良好防效，而且具有对人畜无害、对农作物无药害、使用简单方便等特点；
3、本发明红假单胞菌PSB-06制备得到的生防菌剂及生防发酵液绿色环保，不会破坏生态环境，而且不容易使病虫菌产生耐药性。
一株红假单胞菌菌株，其名称为红假单胞菌PSB-06（Rhodopseudomonas sp.PSB-06），其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：M2012518，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年12月7日。
附图说明
图1为本发明实施例3中红假单胞菌PSB-06生防发酵液在培养皿内抑制辣椒疫霉菌丝生长的结果照片（其中a为CK；b为2∶1配方组；c为1∶1配方组；d为CK+P组；e为1∶2配方组）。
图2为本发明实施例4中红假单胞菌PSB-06对辣椒疫病的田间防治效果，其中阴性对照为清水，编号4、编号5、编号6分别表示7500ml/ha2、3750ml/ha2、1875ml/ha2的生防菌剂喷施组，阳性对照为225g/ha2的50%烯酰吗啉，柱上不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1：红假单胞菌PSB-06生防菌剂及其制备方法。
一株红假单胞菌菌株，其名称为红假单胞菌PSB-06，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：M2012518，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年12月7日。
上述的红假单胞菌菌株可以在拮抗辣椒疫霉菌或防控辣椒疫病中进行应用。
本实施例中首先用红假单胞菌PSB-06（即红假单胞菌CCTCC M2012518）制作生防菌剂，该生防菌剂是由红假单胞菌PSB-06经活化、种子培养、生产培养后得到。本实施例的生防菌剂的具体制备方法包括以下步骤：
（1）活化：将红假单胞菌PSB-06的超低温保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；采用的培养基为光合细菌固体培养基，其配方包括：（NH4）2SO40.1%、MgSO40.02%、NaHCO30.5%、K2HPO40.05%、NaCl0.02%、酵母膏0.15%和琼脂1.5%（均指的质量分数，下同），pH7.0～7.2；
（2）种子培养：将步骤（1）培养出的红色单菌落接入至容积为120mL左右的血清瓶中，在温度为30℃～35℃、光照条件为3000Lx～4000Lx条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期；光合细菌液体培养基的配方包括：（NH4）2SO40.1%、MgSO40.02%、NaHCO30.5%、K2HPO40.05%、NaCl0.02%、酵母膏0.15%，pH7.0～7.2；
（3）生产培养：将步骤（2）培养得到的菌液按光合细菌生产培养基总体积的0.5%～2%的接种量接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基（其成分与上述光合细菌液体培养基的成分相同）培养，在温度为30℃～35℃、光照条件为3000Lx～4000Lx、自然pH条件下，培养至对数生长期；
（4）岀瓶分装：将步骤（3）培养得到的培养液出瓶分装得到红假单胞菌PSB-06的生防菌剂。
本实施例的上述步骤（1）～（4）的全流程培养时间约为22天，培养结束后，菌体数量达到2.0×109cfu/mL以上。
实施例2：红假单胞菌PSB-06生防发酵液及其制备方法。
一种本发明红假单胞菌菌株的生防发酵液，该生防发酵液主要是由实施例1中获得的生防菌剂经发酵、离心后制得的上清液。
本实施例的生防发酵液的制备方法，具体包括以下步骤：取实施例1中制得的生防菌剂，经发酵培养6d，发酵培养在温度为30℃～35℃、光照条件为3000Lx～4000Lx条件下进行，发酵培养基成分与上述的光合细菌液体培养基成分相同，然后在6000rpm条件下离心5min～8min，收集离心后的上清液，将离心后的上清液用细菌过滤器过滤，得到无红假单胞菌菌体的无菌上清液即为生防发酵液，4℃保存备用。
实施例3：红假单胞菌PSB-06生防发酵液对辣椒疫霉菌抑制效果。
将实施例2的生防发酵液与45℃～50℃熔融态的5×PDA培养基（土豆200g榨汁，葡萄糖2g，水200ml）分别按照1∶2、1∶1、2∶1混匀，制成混合平板；以不加入上述生防发酵液的PDA的培养基和加入光合细菌培养基的PDA培养基为对照，分别记为CK、CK+P。在平板中央接入预先培养5d的直径为6mm的辣椒疫霉菌菌饼，每平板接种一片，每处理重复3次，倒置于28℃恒温箱中恒温培养，逐日观察菌丝的生长情况并于5d记录菌落直径的大小，按照下列公式计算抑菌率：
抑菌率（%）=（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径×100%，菌落直径单位：厘米（cm）。
应用检测结果如图1所示，具体的检测数值如下表1所示。
表1：红假单胞菌PSB-06对辣椒疫霉菌的抑菌率（5d）
| 处理 | 菌落直径均值(cm) | 抑菌率(%) |
| CK | 6.8 | - |
| CK+P | 6.05 | 11.03 |
| psb6（1∶1） | 5.2 | 23.53 |
| psb6（2∶1） | 5.3 | 22.06 |
| psb6（1∶2） | 5.8 | 14.71 |
实施例4：红假单胞菌PSB-06生防菌剂田间防治辣椒疫病效果。
将实施例1的生防菌剂按照7500ml/ha2、3750ml/ha2、1875ml/ha2喷施，于发病初期均匀喷淋于辣椒（湘研15号）茎基部，以后每隔10d喷施一次，共喷3次。试验期间不喷施杀菌剂，其他田间管理按常规农事操作进行。以50%烯酰吗啉WP225g/ha2作阳性对照，等量清水作为阴性对照。试验设在湖南省长沙市长沙县榔梨镇花垣村湖南省植物保护研究所基地（2810′58.87″N，11306′56.59″E），试验田为常年种植辣椒且辣椒疫病发生严重的田块，土壤为浅红壤土，有机质含量为2.15%，pH值为6.5。
采用对角线5点取样调查法，于第3次喷药后15d，参考四川省辣椒疫病病害地方分级标准，调查记录发病株数及对应病级值，每小区调查30株。按下列公式计算病情指数和防治效果，并运用SPSS17.0One-Way ANOVA对数据进行方差分析，用LSD法比较不同处理间平均值的差异程度，差异显著水平P<0.05，用Origin9.0作图。
病情指数=∑（各级病株×病级值）/（总株数×最高病级值）。
防效（%）=（1-处理病情指数/对照病情指数）×100%。
红假单胞菌PSB-06的田间防治效果如图2所示，由图2可见，本发明的红假单胞菌PSB-06对辣椒疫病的具有很好的防治效果，当用量为7500ml/ha2和3750ml/ha2，防治效果分别为45.80%和42.41%，略低于50%烯酰吗啉的防效（54.83%），但并不显著。
Claims (8)
1.一株红假单胞菌菌株，其特征在于：所述红假单胞菌（Rhodopseudomonas sp.）菌株的名称为红假单胞菌PSB-06，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：M2012518。
2.一种如权利要求1所述的红假单胞菌菌株在拮抗辣椒疫霉菌或防控辣椒疫病中的应用。
3.一种红假单胞菌菌株的生防菌剂，其特征在于：所述生防菌剂主要是由权利要求1所述红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养后得到。
4.一种如权利要求3所述生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）活化：将权利要求1所述红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
（2）种子培养：将步骤（1）培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30℃～35℃、光照条件为3000Lx～4000Lx、自然pH条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期；
（3）生产培养：将步骤（2）种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的0.5%～5%，在温度为30℃～35℃、光照条件为3000Lx～4000Lx条件下，培养至对数生长期，最后得到的培养液即为所述红假单胞菌菌株的生防菌剂。
5.一种如权利要求3所述的生防菌剂在防控辣椒疫病中的应用。
6.一种红假单胞菌菌株的生防发酵液，其特征在于：所述生防发酵液主要是由权利要求3所述生防菌剂经发酵、离心后制得的上清液。
7.一种如权利要求6所述生防发酵液的制备方法，包括以下步骤：将权利要求2所述的或权利要求3制备得到的生防菌剂经发酵培养5d～7d，发酵培养在温度为30℃～35℃、光照条件为3000Lx～4000Lx条件下进行，培养完成后在6000rpm～8000rpm下离心4min～10min，收集离心后的上清液，得到生防发酵液。
8.一种如权利要求6所述生防发酵液在拮抗辣椒疫霉菌中的应用。
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