CN103602622A - 红假单胞菌菌株及其在抑制黄瓜霜霉病菌、促进黄瓜生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兼性厌氧的红假单胞菌菌株，其为保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：M2012366的菌株。该红假单胞菌菌株可抑制黄瓜霜霉病菌且促进黄瓜生长，应用时可将光合细菌菌液直接喷施施用或将菌液制备成发酵液后再进行喷施应用，其中光合细菌菌液和光合细菌发酵液的制备方法包括以下步骤：先将红假单胞菌菌株活化；再将活化培养得到的单菌落接入至血清瓶进行种子培养；然后进行生产培养，获得光合细菌菌液；将光合细菌菌液进行离心，收集上清液，再经细菌过滤器过滤后得到光合细菌发酵液。本发明具有生产成本低、拮抗效果好、高效、无毒、环保等优点。

Description

红假单胞菌菌株及其在抑制黄瓜霜霉病菌、促进黄瓜生长中的应用

技术领域

本发明涉及一种光合细菌及其应用，尤其涉及一种红假单胞菌菌株及其在抑制黄瓜霜霉病菌以及促进黄瓜生长中的应用。

背景技术

黄瓜霜霉病是影响黄瓜种植的最重要的病害之一，在整个黄瓜生育期，如遇适宜发病条件，无论是露天还是保护地栽培，其浸染、传播流行速度极快，均能对黄瓜的产量造成严重损失。目前，防治黄瓜霜霉病最主要和最有效的措施是采用杀菌剂，然而，由于化学药剂选择压力，单一药剂或单一类型杀菌剂地不合理使用，极易造成病原菌的抗药性快速上升，进而导致杀菌剂用量上升，从而可能引起农产品中杀菌剂的超标，过量杀菌剂的投放，其一旦渗透进土壤或地下水层也将污染生态环境。

随着全社会环境保护意识的增强，农药残留带来的农产品安全以及环境污染问题愈来愈受到关注。然而，从目前农业生产现状以及农业技术水平来看，杀菌剂仍将继续使用且使用量还会继续上升。杀菌剂作为控制作物病害的有效手段，是目前及今后相对较长时期内最主要的技术措施之一。因此，寻找杀菌剂的替代技术和方法，是目前最具有实际应用前景的研究方向。

生物防治特别是微生物防治研究，是国内外研究作物病害防治的热点。微生物防治作物病害具有无毒、无污染的特点，而且微生物菌剂生产简便、田间操作与杀菌剂一样方便。光合细菌是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物，分布广泛，遍及江河、沼泽、湖泊和海洋等，具有固氮、制氢、固碳、脱硫等作用。光合细菌生命力强，容易培养，生长速度繁殖快，本身无毒，富含蛋白质、维他命、类胡萝卜素等。目前已经被广泛的研究，发现光合细菌在种植、养殖、新能源开发利用以及医药方面具有十分广阔的前景。目前在黄瓜霜霉病防治方面，已有一些较好的微生物资源被挖掘，然而，尚无光合细菌应用于黄瓜霜霉病的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低、拮抗效果好、高效、无毒、环保的红假单胞菌菌株，还提供该菌株在抑制黄瓜霜霉病菌、促进黄瓜生长中的应用，使其能以环保、高效、低成本、方便快捷的操作实现抑制黄瓜病害的危害，促进黄瓜等蔬菜的生长。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种兼性厌氧的红假单胞菌菌株，所述红假单胞菌（Rhodopseudomonas sp.）菌株为保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）、且保藏号为CCTCC NO：M2012366的菌株（以下简称红假单胞菌CCTCC M2012366）。红假单胞菌CCTCC M2012366的保藏单位为中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位的地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月20日，该红假单胞菌CCTCC M2012366被命名为红假单胞菌S-1（Rhodopseudomonas sp.S-1）。

经过我们的检测，本发明的红假单胞菌CCTCC M2012366具有以下主要特征：

G-，个体形态为杆状，V-P反应阳性，甲基红反应阳性，不能利用淀粉，H₂S反应阳性，明胶液化阳性，吲哚反应阳性，柠檬酸盐实验阴性，脲酶实验阴性，过氧化氢酶实验阳性，3%NaCl中能生长，最适生长温度为30℃～35℃，最适生长pH值为6.5～7.5，菌体的特征吸收峰为375nm、805nm和865nm，测定的16S rDNA序列长度为1389bp，在Genbank中的登录号为KC491187。

满足上述特征描述的红假单胞菌CCTCC M2012366在下述应用中的效果更好。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的红假单胞菌CCTCC M2012366在抑制黄瓜霜霉病菌中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的红假单胞菌CCTCC M2012366在促进黄瓜生长中的应用。

上述的应用中，优选的，将所述红假单胞菌CCTCC M2012366制备成光合细菌菌液直接喷施应用或将该红假单胞菌菌株制备成光合细菌发酵液后再进行喷施应用。所述光合细菌菌液及光合细菌发酵液的制备方法包括以下步骤：

（1）活化：将所述红假单胞菌CCTCC M2012366的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；

（2）种子培养：将步骤（1）中培养得到的单菌落接入至血清瓶，用红假单胞菌菌株种子培养基培养至对数生长期；

（3）生产培养：将步骤（2）培养得到的培养液接入至生产瓶（例如5L的生产瓶，该瓶可以为透明玻璃瓶）中，用红假单胞菌菌株生产培养基培养至对数生长期得到光合细菌菌液，所述培养液的接入量不少于红假单胞菌菌株生产培养基总体积的1%；

（4）光合细菌发酵液制备：将步骤（3）培养得到的光合细菌菌液进行离心，收集离心后的上清液，再经细菌过滤器过滤后得到光合细菌发酵液。

上述的应用中，所述双层平板培养法优选是采用双层PSB固体培养基进行培养，所述双层PSB固体培养基包含以下质量的成分：K₂HPO₄0.2g、KH₂PO₄0.8g、MgSO₄0.2g、CaSO₄·2H₂O0.1g、NaMoO₄·2H₂O0.0033g、FeSO₄·7H₂O0.005g、酵母提取粉1.5g和琼脂粉（agar）13g/18g（双层平板培养基上层培养基琼脂粉18g/L、下层培养基琼脂粉13g/L）、蒸馏水1L，pH7.0～7.2。

上述的应用中，所述红假单胞菌菌株种子培养基、红假单胞菌菌株生产培养基均优选用PSB液体培养基，所述PSB液体培养基包含以下质量的成分：K₂HPO₄0.2g、KH₂PO₄0.8g、MgSO₄0.2g、CaSO₄·2H₂O0.1g、NaMoO₄·2H₂O0.0033g、FeSO₄·7H₂O0.005g和酵母提取粉（yeast extract）1.5g、蒸馏水1L；所述PSB液体培养基的pH值为7.0～7.2。

上述的应用中，所述活化、种子培养和生产培养过程中，培养温度均控制在30℃～35℃，培养pH值为7.0～7.2，光照条件均控制为2000Lx～3000Lx。

上述的应用中，所述步骤（3）中，培养液的接入量优选为红假单胞菌菌株生产培养基总体积的1%～3%。

上述的应用中，所述步骤（4）中，离心时的转速优选控制在4000rpm～6000rpm，离心时间优选控制在5min～8min。

通过对上述制备方法进行优化，包括对培养基、培养条件及培养工艺参数的优化，能使本发明的红假单胞菌CCTCC M2012366生长更加迅速，从而缩短生产时间（全流程时间一般仅需24天左右）；工艺成本及产品价格更为低廉，便于农业生产应用中进行推广；应用方法更为简便，易于操作，培养结束后，菌体数量可以达到2.0×10⁹个/mL以上，培养完成后出瓶可以直接分装成液体菌剂。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供了一种生产成本低、高效、无毒、环保的红假单胞菌CCTCC M2012366，该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到光合细菌菌液和光合细菌发酵液，该菌株菌液和发酵液可促进黄瓜生长，发酵液可高效抑制黄瓜霜霉病菌，应用时不仅操作简单、方便、工艺成本低，而且具有明显的防治黄瓜霜霉病效果和促生长效果，为今后黄瓜等蔬菜的种植创造了更加优异的生长环境。

一种红假单胞菌菌株（Rhodopseudomonas sp S-1），其保藏单位为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址为中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2012366，保藏日期为2012年9月24日。

附图说明

图1为本发明应用实施例1中各处理组对黄瓜幼苗的累积生物量的影响。

图2为本发明应用实施例1中各处理组对黄瓜幼苗根活力的影响。

图3为本发明应用实施例1中各处理组对黄瓜幼苗生长素（IAA）含量的影响。

图4为本发明应用实施例1中各处理组对黄瓜幼苗过氧化物酶活性的影响。

图5为本发明应用实施例1中各处理组对黄瓜幼苗过氧化氢酶活性的影响。

图6为本发明应用实施例2中各组光合细菌发酵液菌剂对黄瓜霜霉病菌的抑制率曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例：

一种本发明的兼性厌氧的红假单胞菌菌株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012366的菌株。该红假单胞菌CCTCC M2012366被命名为红假单胞菌S-1（Rhodopseudomonas sp.S-1）。

经过我们的检测，本实施例的红假单胞菌CCTCC M2012366具有以下主要特征：

G-，个体形态为杆状，V-P反应阳性，甲基红反应阳性，不能利用淀粉，H₂S反应阳性，明胶液化阳性，吲哚反应阳性，柠檬酸盐实验阴性，脲酶实验阴性，过氧化氢酶实验阳性，3%NaCl中能生长，最适生长温度为30℃～35℃，最适生长pH值为6.5～7.5，菌体的特征吸收峰为375nm、805nm和865nm，测定的16S rDNA序列长度为1389bp，在Genbank中的登录号为KC491187。

上述本实施例的红假单胞菌M2012366主要通过以下方法筛选得到：将采自湖南省植物保护研究所水塘的水样5.0mL加入到120mL PSB液体培养基中，培养5d～7d后得到深红色混合菌液，用接种环挑取适量的菌液划线于PSB双层平板培养基中，30℃±2℃，约3000Lx，光照培养5d～7d后，获得大量深红色的单菌落；用灭菌牙签挑取外形规整、光滑且较大的单菌落至PSB液体培养基中富集培养5d～7d获得深红色菌液，划线、挑取单胞富集获得菌液、重复3次；梯度稀释法稀释平板培养法测定最终富集获得的菌液中菌株的生物量，后续试验中菌液浓度调整至约2×10⁹cfu/mL。

本实施例的红假单胞菌CCTCC M2012366可用于抑制黄瓜霜霉病菌，还可用于促进黄瓜生长。应用时，先将红假单胞菌CCTCC M2012366制备成光合细菌发酵液，再进行喷施应用，该光合细菌发酵液的制备方法包括以下步骤：

（1）活化：将本实施例的红假单胞菌CCTCC M2012366的超低温保存种按双层平板培养法进行培养，培养温度控制在30℃～35℃，培养pH值为7.0～7.2，光照条件控制为2000Lx～3000Lx，培养至红色单菌落出现；该双层平板培养法是采用双层PSB固体培养基进行培养，双层PSB固体培养基包含以下成分：K₂HPO₄0.2g、KH₂PO₄0.8g、MgSO₄0.2g、CaSO₄·2H₂O0.1g、NaMoO₄·2H₂O0.0033g、FeSO₄·7H₂O0.005g、酵母提取粉1.5g和琼脂13g/18g（双层平板培养基上层培养基琼脂粉18g/L、下层培养基琼脂粉13g/L）、蒸馏水1L，pH7.0～7.2；

（2）种子培养：将步骤（1）中培养得到的单菌落接入至血清瓶，用红假单胞菌菌株种子培养基培养至对数生长期；红假单胞菌菌株种子培养基选用PSB液体培养基，PSB液体培养基包含以下质量的成分：K₂HPO₄0.2g、KH₂PO₄0.8g、MgSO₄0.2g、CaSO₄·2H₂O0.1g、NaMoO₄·2H₂O0.0033g、FeSO₄·7H₂O0.005g和酵母提取粉1.5g、蒸馏水1L；所述PSB液体培养基的pH值为7.0～7.2；培养温度控制在30℃～35℃，培养pH值为7.0～7.2，光照条件控制为2000Lx～3000Lx；

（3）生产培养：将步骤（2）培养得到的培养液接入至生产瓶（例如5L的生产瓶，该瓶可以为透明玻璃瓶）中，用红假单胞菌菌株生产培养基培养至对数生长期，培养液的接入量为红假单胞菌菌株生产培养基总体积的1%；红假单胞菌菌株生产培养基选用PSB液体培养基，PSB液体培养基包含以下质量的成分：K₂HPO₄0.2g、KH₂PO₄0.8g、MgSO₄0.2g、CaSO₄·2H₂O0.1g、NaMoO₄·2H₂O0.0033g、FeSO₄·7H₂O0.005g和酵母提取粉1.5g、蒸馏1L；培养温度控制在30℃～35℃，培养pH值为7.0～7.2，光照条件控制为2000Lx～3000Lx；

（4）光合细菌发酵液制备：将步骤（3）培养得到的光合细菌菌液进行离心，离心时的转速控制在6000rpm，离心时间优选控制在5min，收集离心后的上清液，再经细菌过滤器过滤后得到光合细菌发酵液。

应用实施例1：光合细菌在促进黄瓜苗期生长发育中的应用。

选用直径为9cm的灭菌培养皿中加垫6张灭菌滤纸，加入无菌水，无菌水的量以浸透滤纸且能浸没1/2颗黄瓜种子为宜。将黄瓜种子平铺于湿润的纱布上4℃冷藏过夜，打破种子休眠后平铺于上述培养皿中；置于光照培养箱，25℃，16h光照，8h黑暗培养，直至种子萌发。种子发芽至幼苗并长至4cm左右时，移栽入水培盒中。水培盒中添入Hoagland水培营养液，营养液的配方为：Ca(NO₃)₂945mg/L，KNO₃607mg/L，NH₄NO₃115mg/L，NH₃H₂PO₃136mg/L，MgSO₄493mg/L，铁盐溶液2.5mL（七水硫酸亚铁2.78g，EDTA-2Na3.73g，蒸馏水500mL，pH5.5），微量元素5mL（KI0.83mg/L，H₃BO₃6.2mg/L，MnSO₄22.3mg/L，ZnSO₄8.6mg/L，NaMoO₃0.25mg/L，CuSO₄0.025mg/L，CuCl₂0.025mg/L），pH：6.0。

将实施例中制备的光合细菌发酵液加入水培营养液中作为处理c，光合细菌菌液加入水培营养液中作为d处理，另设不加光合细菌发酵液处理的空白水培营养液作为处理a，设PSB液体培养基加入到水培营养液中作为处理b对照，处理浓度为12.5mL/L（具体指的是12.5ml发酵液配1L的营养液，a，b两个处理是对应c、d处理中发酵液或菌液加入的量添加）。在0d、3d、6d、9d、12d、15d分别测定a、b、c、d四个处理组中黄瓜幼苗的生物量（参见图1）、根活（参见图2）、生长素（IAA）（参见图3）、过氧化物酶活力（参见图4）、过氧化氢酶活力（参见图5）等指标，各指标测定重复三次，测定结果分别如图1～图5所示。

由图1可见，本实施例中的光合细菌发酵液及光合细菌菌液在施用于黄瓜幼苗时，能够显著提高黄瓜幼苗的累积生物量。由图2可见，本实施例中的光合细菌发酵液及光合细菌菌液在施用于黄瓜幼苗时，能够显著提升黄瓜幼苗的根活力。由图3可见，本实施例中的光合细菌发酵液及光合细菌菌液在施用于黄瓜幼苗时，能够明显提高黄瓜幼苗中生长素（IAA）的含量。由图4可见，本实施例中的光合细菌发酵液及光合细菌菌液在施用于黄瓜幼苗时，能够提高黄瓜幼苗过氧化物酶活性。由图5可见，本实施例中的光合细菌发酵液及光合细菌菌液在施用于黄瓜幼苗时，能够提高黄瓜幼苗过氧化氢酶活性。

应用实施例2：光合细菌发酵液在抑制黄瓜霜霉病中的应用。

取实施例制备的光合细菌发酵液，等比稀释成以下梯度的菌剂：稀释5倍、稀释10倍、稀释20倍、稀释40倍、稀释80倍。采用联合国粮食与农业组织FAO（1982年）推荐的叶盘漂浮法，用移液器将稀释后的光合细菌发酵液菌剂移至直径6cm的培养皿中，每皿10mL，空白对照加去离子水；将黄瓜叶盘背面朝上漂浮在培养皿上，用移液器将黄瓜霜霉病的孢子囊悬浮液接种至叶盘中心，10μL/叶盘，重复试验3次。然后将各处理组置于20℃温度下按每天16小时光照和8小时黑暗条件下进行培养，培养10d～14d，调查各叶盘的发病情况。

以DPS软件（v12.01）计算稀释倍数对数值与相对防效概率值之间的线性回归方程及IC₅₀等，结果如表1和图6所示。

表1：不同稀释倍数光合细菌发酵液对理黄瓜霜霉病病的抑制率

上表1的结果表明，本实施例的光合细菌发酵液菌剂能有效抑制黄瓜霜霉病菌，稀释5倍，抑制率为78.33%；稀释20倍，抑制率仍达到54.07%。图6的结果表明，本发明的光合细菌发酵液菌剂抑制黄瓜霜霉病菌的IC₅₀为23.48倍，即光合细菌发酵液稀释23.48倍，对黄瓜霜霉病菌浸染黄瓜叶盘面积的抑制率为50%。

Claims (9)

1.一种兼性厌氧的红假单胞菌菌株，其特征在于：所述红假单胞菌（Rhodopseudomonassp.）菌株为保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：M2012366的菌株。

2.一种如权利要求1所述的红假单胞菌菌株在抑制黄瓜霜霉病菌中的应用。

3.一种如权利要求1所述的红假单胞菌菌株在促进黄瓜生长中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，将所述红假单胞菌菌株制成光合细菌菌液直接喷施应用或将该红假单胞菌菌株制备成光合细菌发酵液后再进行喷施应用，所述光合细菌菌液及光合细菌发酵液的制备方法包括以下步骤：

（1）活化：将所述红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；

（2）种子培养：将步骤（1）中培养得到的单菌落接入至血清瓶，用红假单胞菌菌株种子培养基培养至对数生长期；

（3）生产培养：将步骤（2）培养得到的培养液接入至生产瓶中，用红假单胞菌菌株生产培养基培养至对数生长期得到光合细菌菌液，所述培养液的接入量不少于红假单胞菌菌株生产培养基总体积的1%；

（4）光合细菌发酵液制备：将步骤（3）培养得到的光合细菌菌液进行离心，收集离心后的上清液，再经细菌过滤器过滤后得到光合细菌发酵液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述双层平板培养法是采用双层PSB固体培养基进行培养，所述双层PSB固体培养基包含以下质量的成分：K₂HPO₄0.2g、KH₂PO₄0.8g、MgSO₄0.2g、CaSO₄·2H₂O0.1g、NaMoO₄·2H₂O0.0033g、FeSO₄·7H₂O0.005g、酵母提取粉1.5g、琼脂粉13g/18g、蒸馏水1L，pH7.0～7.2。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述红假单胞菌菌株种子培养基、红假单胞菌菌株生产培养基均选用PSB液体培养基，所述PSB液体培养基包含以下质量的成分：K₂HPO₄0.2g、KH₂PO₄0.8g、MgSO₄0.2g、CaSO₄·2H₂O0.1g、NaMoO₄·2H₂O0.0033g、FeSO₄·7H₂O0.005g、酵母提取粉1.5g、蒸馏水1L；所述PSB液体培养基的pH值为7.0～7.2。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述活化、种子培养和生产培养过程中，培养温度均控制在30℃～35℃，光照条件均控制为2000Lx～3000Lx。

8.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述步骤（3）中，培养液的接入量为红假单胞菌菌株生产培养基总体积的1%～3%。

9.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述步骤（4）中，离心时的转速控制在4000rpm～6000rpm，离心时间控制在5min～8min。

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