CN107058154A - 一种东方红菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及其制备方法和应用 - Google Patents
一种东方红菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种东方红菌菌株，所述东方红菌菌株为东方红菌I‑1‑1(Rhodobium orientis I‑1‑1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012368。本发明的东方红菌I‑1‑1的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到辣椒炭疽病防控的生防菌剂及生防发酵液；东方红菌I‑1‑1制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性；东方红菌I‑1‑1制得的生防菌剂及生防发酵液可以促进辣椒生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体是一种东方红菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及其制备方法和应用。
背景技术
辣椒炭疽病是危害甜椒、辣椒生产的主要病害之一，可引起辣椒落叶、烂果、幼苗死亡，严重时会造成20％-30％的减产，影响辣椒的产量和品质。辣椒炭疽病与辣椒病毒病、辣椒疫病称为辣椒的三大病害，发病严重、分布广，不论是露地种植还是保护地种植，染病的机率都很高，茎叶染病易造成落叶，果实染病则失去商品价值。
目前，辣椒炭疽病的防治主要集中于施用化学农药及抗病品种选育等农业措施，大量化学农药的长期使用导致农药残留、病虫害抗性增加、环境污染等问题，严重影响农业可持续发展。而抗性育种难度大、周期长，相应的农业措施复杂、经济投入大。生物防治是利用有益生物或其他生物来消灭或抑制有害生物，受到广泛采用和具有良好生态效益、环境效益与社会效益的一种病虫害防治方法，因其具有对环境、生态和人类健康安全的优点，符合农业的可持续发展，是当前和未来植物病害防治的发展趋势。
科研工作者在生物防治辣椒炭疽病上做了较为广泛的研究。已报道的用于辣椒炭疽病生物防治的拮抗微生物主要有真菌、细菌、粘菌、海洋微生物，其中生防细菌包括芽孢杆菌、假单孢菌、海洋细菌等。它们对辣椒炭疽病菌产生抑制作用的机理主要是通过竞争性生长繁殖而占居生存空间的方式来阻止植物病原真菌的生长与增殖，能在植物表面迅速形成一层高密保护膜，使炭疽病菌得不到生存空间，保护了辣椒免受病原菌为害；或分泌如细菌素类、蛋白类、脂肽类、多肽类、酚类等抑菌物质来抑制菌丝生长和病菌孢子发芽，从而达预防植物病害的发生；另外通过生防菌诱发植物自身的抗病潜能从而增强植物的抗病性。近年来，国内外学者在光合细菌的基础性研究、应用研究方面也取得很大的进展。诸多研究结果证明，光合细菌菌体富含多种生理活性物质及促生长因子，甚至菌体分泌的胞外组份对固氮根瘤细菌也有刺激作用，能显著提高其固氮活性；且因其含有脯氨酸、尿嘧啶、胞嘧啶等物质，能增加多种经济作物的产量等。而且光合细菌的一些活性物质能钝化病原体的致病力、促进放线菌等有益微生物增殖，以及抑制病原体的生长，从而有效地抑制某些植物病害的发生与蔓延。因而，利用光合细菌防治辣椒炭疽病具有丰富的生防资源和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种东方红菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种东方红菌菌株，所述东方红菌菌株为东方红菌I-1-1(Rhodobium orientisI-1-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012368。
一种东方红菌生防菌剂，所述东方红菌生防菌剂由上述的东方红菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备得到。
一种东方红菌菌株的生防发酵液，所述东方红菌菌株的生防发酵液由权利要求2所述的东方红菌生防菌剂离心收集上清制得东方红菌菌株的生防发酵液。
一种上述的东方红菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、活化：将东方红菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
B、种子培养：将步骤A培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；
C、生产培养：将步骤B种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得东方红菌生防菌剂。
作为本发明进一步的方案：所述步骤B中种子培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
作为本发明进一步的方案：所述步骤C中生产培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
作为本发明进一步的方案：所述离心的转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。
一种上述的东方红菌生防菌剂或上述制备方法制得的东方红菌生防菌剂的应用，所述东方红菌生防菌剂应用于辣椒促生。
一种上述的东方红菌生防菌剂或上述制备方法制得的东方红菌生防菌剂的应用，所述东方红菌生防菌剂应用于拮抗辣椒炭疽菌或防控辣椒炭疽病。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的东方红菌I-1-1的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到辣椒炭疽病防控的生防菌剂及生防发酵液；
(2)本发明的东方红菌I-1-1制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性；
(3)本发明的东方红菌I-1-1制得的生防菌剂及生防发酵液既可以防治辣椒炭疽病害又能促进辣椒生长。
附图说明
图1为东方红菌菌株的电子显微镜扫描图片。
图2为东方红菌生防菌对辣椒炭疽病双层平板生测结果图。
图3为东方红菌生防菌发酵液对辣椒炭疽病的离体防治效果对比图。
图4为东方红菌生防菌剂在室内盆栽条件下对辣椒的促生效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1-4，一种东方红菌菌株，所述东方红菌菌株为东方红菌I-1-1(Rhodobium orientis I-1-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2012368，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2014年10月29日。
一种东方红菌生防菌剂，所述东方红菌生防菌剂由上述的东方红菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备得到。
一种东方红菌菌株的生防发酵液，所述东方红菌菌株的生防发酵液由权利要求2所述的东方红菌生防菌剂离心收集上清制得东方红菌菌株的生防发酵液。
一种上述的东方红菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、活化：将东方红菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
B、种子培养：将步骤A培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；
C、生产培养：将步骤B种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得东方红菌生防菌剂。
所述步骤B中种子培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
所述步骤C中生产培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
所述离心的转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。
所述磷酸缓冲液摩尔浓度为0.01M，PH＝7.0。
一种上述的东方红菌生防菌剂或上述制备方法制得的东方红菌生防菌剂的应用，所述东方红菌生防菌剂应用于辣椒促生。
一种上述的东方红菌生防菌剂或上述制备方法制得的东方红菌生防菌剂的应用，所述东方红菌生防菌剂应用于拮抗辣椒炭疽菌或防控辣椒炭疽病。
实施例1：
一株东方红菌菌株，其名称为东方红菌I-1-1，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M 2012368，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月20日。
参见图1：东方红菌菌株I-1-1为革兰氏阴性菌，经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为东方红菌。主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养4d～8d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养7d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃～35℃，pH＝7。
实施例2：
一种东方红菌生防菌剂，采用实施例1的东方红菌菌株I-1-1为原料，通过经活化、种子培养、生产培养制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：
(1)活化：将东方红菌I-1-1菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：(NH4)2SO4 2g/L、CH2COONa2g/L、YE 1.5g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.5g/L、微量金属元素贮液1.0ml(准确称量EDTA2.5g、ZnSO4 6.13g、MgSO4 0.78g、CuSO4 0.25g、CoCl2 0.08g、FeSO4·7H2O 7.0g溶于1L蒸馏水中)、琼脂粉20g/L，pH＝7.0。
(2)种子培养：将步骤(1)培养出的红色单菌落接入至120mL血清瓶中，在温度为30℃～35℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液。光合细菌液体培养基的配方为(NH4)2SO4 2g/L、CH2COONa 2g/L、YE1.5g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.5g/L、微量金属元素贮液1.0ml(准确称量EDTA 2.5g、ZnSO4 6.13g、MgSO4 0.78g、CuSO4 0.25g、CoCl2 0.08g、FeSO4·7H2O 7.0g溶于1L蒸馏水中)，pH＝7.0。
(3)生产培养：将步骤(2)种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基(培养基成分与上述光合细菌液体培养基一致)进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5％，在温度为30℃～35℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下，培养至对数生长期即制得生防菌剂。
实施例3：
一种东方红菌生防发酵液，采用实施例1的东方红菌菌株I-1-1为原料，通过经活化、种子培养、生产培养、离心制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：
取实施例1中获得的生防菌剂，经发酵培养6d，发酵培养在温度为30-35℃、光照条件为3000Lx-4000Lx条件下进行，发酵培养基成分与上述的光合细菌液体培养基成分相同，然后在6000rpm条件下离心5min-8min，离心收集上清液，将上清液用细菌过滤器过滤，得到无东方红菌菌体的上清液即为生防发酵液，4℃保存备用。
实施例4：东方红菌I-1-1生防菌辣椒炭疽病菌丝的作用。
一种实施例2的生防菌在辣椒炭疽病病防治中的应用，具体的应用方法为：
将东方红菌I-1-1菌株采用双层平板法进行培养：下层为实施例2中的光合细菌固体培养基，上层为10mLPDA组成双层平板，在温度为30℃～35℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下培养，待东方红菌I-1-1菌株布满平板后，在平板中央接种预先培养5d的直径为6mm的辣椒炭疽病菌菌饼，每平板接种一片，每处理重复3次，倒置于28℃恒温箱中进行暗培养，逐日观察菌丝的生长情况并于5d记录菌饼直径大小，按照下列公式计算抑菌率：抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％(单位：cm)。
参见图2，图2中编号1、2分别含有东方红菌I-1-1菌株的双层平板和空白对照处理，从图中4中可以发现：对照处理的辣椒炭疽病菌发病率为63.33％。空白对照是下层为10mL光合细菌固体培养基和上层为10mLPDA的空白双层平板。
实施例5：东方红菌I-1-1生防菌辣椒炭疽病离体果实生测试验。
一种实施例3的生防发酵液在辣椒炭疽病病防治中的应用，具体的应用方法为：
采集成熟果，经表面消毒后，用HAMILTON微量注射器的针头在果面上刺2个接种点，将生防发酵液：孢子＝1：1：1比例配制的孢子悬浮液(浓度为1×106个/mL)，每点注入2μL于果肉中，28℃、12h光照/d、RH≥95％的条件下培养，第7d调查发病情况。病斑直径≥4mm的视为发病，统计发病率，即病斑数占总接种点的百分率。设4次重复，每重复至少5个果。
参见图3，图3中编号1、2分别表示浓度为生防发酵液、空白对照处理，从图中4中可以发现：对照处理的辣椒炭疽病菌发病率为95％，而发酵液处理后辣椒炭疽病发病率为25％。液体的光合培养基为空白对照。
实施例6：东方红菌I-1-1生防菌剂在辣椒促生中的应用。
一种实施例2的生防菌在辣椒促生中的应用，具体的应用方法为：
在温室中，将分别将5×106cfu/mL生防菌剂、光合细菌培养基和清水处理喷施于移栽3片真叶的辣椒苗，每处理10株共喷100mL至叶面滴水，重复3次。鉴定期间幼苗保持在26～28℃、10h光照/d条件下的温室中培养，14d后调查。每个处理选取3株代表性植株分别测定株高和湿重。
参见图4，其中CK为清水对照，编号1、编号2分别为5×106cfu/mL生防菌和光合细菌培养基。从下表中可以知道施用生防菌剂处理后的辣椒株高相对于清水对照增加33.77％、辣椒单棵鲜重相对于清水对照增加32.78％。
| 处理 | 平均株高(cm) | 增高率(％) | 平均单棵鲜重(g) | 增产率(％) |
| 1 | 10.73 | 33.77 | 20.65 | 32.78 |
| 2 | 8.82 | 14.61 | 17.58 | 10.51 |
| 3 | 7.7 | - | 15.55 | - |
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (9)
1.一种东方红菌菌株，其特征在于，所述东方红菌菌株为东方红菌I-1-1(Rhodobiumorientis I-1-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012368。
2.一种东方红菌生防菌剂，其特征在于，所述东方红菌生防菌剂由权利要求1所述的东方红菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备得到。
3.一种东方红菌菌株的生防发酵液，其特征在于，所述东方红菌菌株的生防发酵液由权利要求2所述的东方红菌生防菌剂离心收集上清制得东方红菌菌株的生防发酵液。
4.一种如权利要求3所述的东方红菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、活化：将东方红菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
B、种子培养：将步骤A培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；
C、生产培养：将步骤B种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得东方红菌生防菌剂。
5.根据权利要求4所述的东方红菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤B中种子培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
6.根据权利要求4所述的东方红菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤C中生产培养的温度为30℃～35℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
7.根据权利要求3所述的东方红菌菌株的生防发酵液，其特征在于，所述离心的转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。
8.一种权利要求2所述的东方红菌生防菌剂或权利要求4-6中任一所述制备方法制得的东方红菌生防菌剂的应用，其特征在于，所述东方红菌生防菌剂应用于辣椒促生。
9.一种权利要求2所述的东方红菌生防菌剂或权利要求4-6中任一所述制备方法制得的东方红菌生防菌剂的应用，其特征在于，所述东方红菌生防菌剂应用于拮抗辣椒炭疽菌或防控辣椒炭疽病。
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