CN103589657A - 用于抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的枯草芽孢杆菌及其抗菌肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株用于抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)C-D6菌株及应用，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，编号为：CGMCCNo.5345。本发明还提供了该菌株产生抑制附着胞形成活性物的适宜培养方法和抗菌蛋白分离纯化方法。应用所述方法，C-D6菌株的培养液能强烈抑制辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）501附着胞的形成，从其分离获得的抗菌蛋白在较低的浓度下就能完全抑制该菌株附着胞的形成。C-D6菌株及其所产生的抗菌蛋白的特异抑制作用，能有效阻断病菌侵入，可用于辣椒炭疽菌引起的作物炭疽病的生物防治。

Description

用于抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的枯草芽孢杆菌及其抗菌肽

技术领域

本发明属于植物病害生物防治领域，具体涉及一株抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的枯草芽孢杆菌及应用。

背景技术

生物防治作为植物病害综合治理的重要内容，因与生态环境保护间的“相容性”及与农业可持续发展间的“统一性”，倍受世界各国的重视。生物防治在促进农林业生产发展和保护生态环境方面正发挥着日益重要的作用。

辣椒炭疽菌寄主范围广，可危害多种蔬菜、花卉、药用植物和大田作物的果实、茎、叶和幼果，引起烂果、枯枝、叶斑和死苗等症状，对农林生产造成严重危害。炭疽病的防治以选用抗病品种和化学防治为主。近年来，由于规模化栽培、抗病品种退化和化学防治易产生产品污染等原因，使该类病害处于较难防治的困境。因此，探索新的、有效的防治途径具有重要意义。

生物防治作为病害综合治理的一个重要发展方向，来源广泛的微生物，包括荧光假单胞菌、芽孢杆菌和酵母菌等已分别被应用于炭疽病的生物防治研究。芽孢杆菌因其具有易培养、所制备的菌剂抗逆性强、易保存等特点，已在病害生防上得到广泛应用。芽孢杆菌在作物炭疽病生防上的应用研究也有一些报道，但这些研究多局限于拮抗菌的分离、筛选、鉴定及其初步的生防作用研究。

附着胞的分化、形成和成熟是辣椒炭疽菌成功侵入寄主的前提。附着胞的形成是由来自植物表面的物理和（或）化学信号的识别而触发的，信号传导途径对于这类病害的发生可能非常重要。如果能阻断信号识别和传导过程,将可阻止附着胞的形成和病害的发展。Kim等的研究证实了这一点，他们发现在大肠杆菌内表达的辣椒酯酶能抑制胶胞炭疽菌和稻瘟病菌附着胞的形成，从而可控制病害的发生。其作用机理是该酶通过调制依赖环腺苷酸信号途径（cAMP-dependent signaling pathway）来调节附着胞形成（Kim Y S等. Inhibition of fungal appressorium formation by pepper (Capsicum annuum) esterase. MPMI, 2001,14(1):80-85）。从真菌的次生代谢产物中也发现了多种抑制炭疽菌等植物病原真菌侵染过程中孢子萌发和附着胞形成的生物活性物质，这些次生代谢产物可有效地阻断病害的侵入过程，对发展新型杀菌剂具有重要意义（Thines E等. Fungal secondary metabolites an inhibitors of infection-related morphogenesis in phytopathogenic fungi. Mycol. Res., 2004, 108(1):14-25.）。这些研究表明：以病菌侵入过程中的附着胞形成为作用靶标，筛选生物产生的活性物质阻断附着胞形成，从而阻止病害发生，对炭疽病的生物防治具有重要意义。在生态上，由于其作用靶标专一，对保护环境和微生物多样性也具有十分积极的意义。

而从枯草芽孢杆菌中筛选抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的活性菌株，并应用于炭疽病生物防治的研究国内外未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：提供一株能抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的枯草芽孢杆菌，其可用于该菌引起的作物病害的生物防治。

本发明要解决的另一技术问题在于：提供一种枯草芽孢杆菌培养液，其可高效地抑制辣椒炭疽菌附着胞的形成。

本发明还要解决的技术问题在于：提供一种枯草芽孢杆菌的抗菌蛋白，其可高效地抑制辣椒炭疽菌附着胞的形成。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：提供一种用于抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )C-D6，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所，邮编：100101，其保藏日期为：2011年10月14日；保藏编号为：CGMCC No.5345。

本发明提供枯草芽孢杆菌C-D6在抑制辣椒炭疽菌附着胞形成方面的应用。

本发明还提供一种细菌培养液，包含所述的枯草芽孢杆菌，其由以下步骤进行培养而成：

1）斜面活化培养的C-D6菌株；

2）摇瓶培养：将斜面活化培养的C-D6菌株接种到YPD液体培养基中进一步培养而得。

其中，所述培养步骤1中，是从枯草芽孢杆菌C-D6的保藏菌种斜面划线接种到NA平板，37℃培养20-24 h，挑起单菌落接种到NA试管斜面，37℃培养20-24 h后，备用。

其中，所述培养步骤2中，是将C-D6菌株接种到装有50mL YPD液体培养基的三角瓶（250 mL）中，37℃，180 r/min振荡培养12 h后，按1%的接种量接种到相同培养瓶中，相同条件下震荡培养48 h，从而获得该细菌培养液。

其中，所述YPD培养基组成成分为：酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0~7.2。

本发明的进一步提供一种抗菌蛋白，是由所述的枯草芽孢杆菌按以下分离纯化方法获得，该分离纯化方法包括如下步骤：

1）枯草芽孢杆菌细菌培养液的准备； 

2）硫酸铵沉淀分离：细菌培养液经20%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀后，离心沉淀蛋白，所得蛋白质沉淀用磷酸缓冲液悬浮，并用相同缓冲液透析48h后，离心弃沉淀，即得抗菌蛋白粗提液； 

3）抗菌蛋白纯化：采用AKTA蛋白纯化系统对蛋白粗提液进行进一步分离纯化。

其中，所述枯草芽孢杆菌细菌培养液的准备进一步是由以下步骤获得：

1）斜面活化培养的C-D6菌株；

2）摇瓶培养：将斜面活化培养的C-D6菌株接种到YPD液体培养基中进一步培养而得；所述YPD培养基组成成分为：酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0~7.2。

优选地，分离纯化方法的步骤2具体为：所述经20%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀后，离心收集沉淀蛋白，所得蛋白质沉淀用原体积1/15的磷酸缓冲液悬浮，并用相同缓冲液透析48h后，离心弃沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；所述纯化方法的步骤3具体为：以Sephadex G-75凝胶柱为分离柱，上样量为5 mL，流动相为50mmol/L pH 6.0的磷酸缓冲溶液，洗脱速度为0.5 mL/min，洗脱1.2倍柱体积；Sephadex G-75柱层析分离获得的活性产物通过阴离子交换层析Q-Fastflow进一步纯化，获得纯化活性蛋白；所述Q-Fastflow的分离条件为：流动相A：0.01mM 磷酸缓冲液（PB），pH 7.4；流动相B：1M NaCl洗脱液（含流动相A）；洗脱方式：线性梯度洗脱；洗脱时间：110min；洗脱速度：1mL/min；上样量：2mL/min。

本发明具有以下有益效果：所述菌株枯草芽孢杆菌C-D6所产生的抗菌蛋白能抑制辣椒炭疽菌附着胞的形成，从而阻止病害的发生，可用于两种重要病原真菌引起的作物病害的生物防治。

本发明所述菌株枯草芽孢杆菌C-D6已于2011年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.5345。

附图说明

本发明枯草芽孢杆菌C-D6，其分类命名为芽孢杆菌属(Bacillus)，拉丁文学名为Bacillus subtilis，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101，其保藏日期为：2011年10月14日；保藏编号为：CGMCC No.5345。

图1是本发明实施例菌株C-D6基于16SrDNA序列的系统发育树。

图2是本发明实施例菌株C-D6特异性基因序列PCR扩增照片；其中泳道1、3为YyaO-F/Tetb-R扩增结果；泳道2、4为YyaR-F/Tetb-R扩增结果。

图3是本发明实施例菌株C-D6培养液对辣椒炭疽菌附着胞形成的抑制作用图；其中A：CK，YPD培养基；B：C-D6 的YPD培养液。

图4是本发明实施例20%活性蛋白粗提液Sephadex G-75柱层析分离效果图。

图5是本发明实施例活性蛋白Q-Fastflow 柱层析图谱。

图6是本发明实施例活性蛋白过Q-FF后的HPLC图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

本发明涉及一株用于抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )C-D6菌株及应用，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，编号为：CGMCC No.5345。本发明还提供了该菌株产生抑制附着胞形成活性物的适宜培养方法和抗菌蛋白分离纯化方法。应用所述方法，C-D6菌株的培养液能强烈抑制辣椒炭疽菌附着胞的形成，从其分离获得的抗菌蛋白在较低的浓度下就能完全抑制上述两种重要病原真菌附着胞的形成。附着胞形成是一些植物病原真菌侵入寄主的关键环节。C-D6菌株及其所产生的抗菌蛋白的特异抑制作用，能有效阻断病菌侵入，可用于辣椒炭疽病等重要病害的生物防治。

在具体实施例中，本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )C-D6，是从土壤样品中，经过初筛、复筛和性能测定等分离筛选步骤获得的。用于分离筛选的土壤样品采集自湖南、海南、广东、江西和安徽等省，共100余份。筛选的具体步骤为：从不同生态环境的土壤中采集样品，用平板稀释法分离获得大量细菌菌株，将不同分离菌株的培养液分别与病原菌的孢子在载玻片上进行对峙培养，最后通过镜检，检查不同菌株抑制附着胞形成的情况，筛选获得目标菌株。

本发明所述菌株的培养条件为：

（1）培养基：采用牛肉膏蛋白胨培养基（NA）；具体配方为：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.2~7.3。

（2）培养温度：37℃。

本发明还提供一种枯草芽孢杆菌C-D6细菌培养液，能高效产生抗菌物质，是通过以下方法获得，该方法包括如下步骤： 

（1）菌种活化培养：从枯草芽孢杆菌C-D6的保藏菌种斜面划线接种到NA平板，37℃培养20-24 h，挑起单菌落接种到NA试管斜面，37℃培养20-24 h后，备用；

（2）摇瓶培养：将斜面活化培养的C-D6菌株接种到装有50mL YPD液体培养基的三角瓶（250 mL）中，37℃，180 r/min振荡培养12 h后,按1%的接种量接种到相同培养瓶中，相同条件下震荡培养48 h，从而获得该细菌培养液。

其中，所述YPD培养基组成成分为：酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0~7.2。

本发明进一步提供一种枯草芽孢杆菌抑制附着胞形成的抗菌蛋白，其由以下分离纯化方法获得，该方法包括如下步骤：

（1）细菌培养液准备：见上述枯草芽孢杆菌C-D6细菌培养液的培养方法；

（2）硫酸铵沉淀分离：最佳地，细菌培养液经20%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀后，离心（10000 r/min，30 min）收集沉淀蛋白，所得蛋白质沉淀用原体积1/15的磷酸缓冲液（50 mmol/L pH 6.0）悬浮，并用相同缓冲液透析（外液为2 L）48h后，离心弃沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；

（3）抗菌蛋白纯化：采用Sephadex G-75层析和阴离子交换层析Q-Fastflow纯化抗菌蛋白。

其中，所述Sephadex G-75层析的分离条件为：柱长40 cm，柱高与直径之比为25:1，上样量为5mL，流动相为50mmol/L pH6.0的磷酸缓冲溶液，洗脱速度为0.5mL/min，洗脱1.2倍柱体积。

所述阴离子交换层析Q-Fastflow的分离条件为：流动相A：0.01mM 磷酸缓冲液（PB），pH 7.4；流动相B：1M NaCl洗脱液（含流动相A）；洗脱方式：线性梯度洗脱；洗脱时间：110min；洗脱速度：1mL/min；上样量：2mL/min，0.5mL/min。

实施例1 菌株的筛选

以牛肉膏蛋白胨培养基为分离培养基，用常规稀释平板分离法分离细菌菌株。菌株的筛选用载片培养法。具体方法为：从37℃培养12-20h的分离平板上，用牙签逐一挑起单菌落，分别接种到含280μL YPD培养液的96孔细胞培养板中，37℃培养18h，获得用于菌株筛选的细菌培养液。辣椒炭疽菌菌株501在PDA平板上25℃培养7-10天，使其产生大量乳黄色粘孢团。挑起粘孢团溶入无菌蒸馏水中制备孢子悬浮液，并用血球计数板计数将孢子浓度调整到1×10⁶/ mL，孢子液中加入青霉素（100U/ mL）和链霉素（100μg/ mL）抑制细菌生长。取细菌培养液和炭疽菌孢子悬浮液各20μL，混合滴加于载片上，25℃培养保湿培养12h，显微镜观察不同细菌培养液对炭疽菌孢子萌发、附着胞形成和菌丝生长的影响。

对筛选获得的菌株进行摇瓶培养（250 mL三角瓶装入60 mL YPD，180r/min培养20-24h），经0.22μm滤膜过滤除菌后得到无菌培养液。用上述载片培养法（孢子液不加抗生素）测定细菌发酵液对炭疽菌孢子萌发、附着胞形成和菌丝生长的影响。

用上述方法，经过初筛、复筛和性能测定等分离筛选步骤，从采集自湖南、海南、广东、江西和安徽五省11个地区的100余份土壤样品中，获得本发明所述菌株----芽孢杆菌C-D6。

实施例2 菌株的鉴定

经实验观察，菌株C-D6具有以下微生物学特征：在牛肉膏蛋白胨培养基上37℃培养18h，形成乳白、表面粗糙有皱褶、边缘整齐的圆形突起菌落；菌体杆状，大小为0.89μm×2.74μm。经革兰氏染色后观察：芽孢中生，椭圆，孢囊不膨大。革兰氏染色阳性。

应用常规PCR方法，采用

通用引物8F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’，从C-D6的基因组DNA扩增获得一条1691bp的16S rDNA序列，具体序列见SEQ ID NO: 1。

通过Blast进行搜索比对，该序列与Genbank中的两个枯草芽孢杆菌参考菌株Bacillus subtilis L4和WD23 的序列（登陆号分别为：GQ421472、EU780682)同源性大于99%。从Genbank中选择了8个芽孢杆菌菌株的16SrRNA基因序列，应用软件进行多重比较后构建的系统发育树见图1。结果表明：菌株C-D6与枯草芽胞杆菌的亲缘关系最近。 

采用两对芽孢杆菌特异基因引物YyaO-F/TetB-R和YyaR-F/TetB-R，通过常规PCR方法进行枯草芽孢杆菌的特异基因鉴定。引物序列如下：

YyaO-F：  5′-GGAACCAGTCCACAGGGTTGTGG-3′，

TetB – R:   5′-CCATATAGAGCTGTTCCAATGGAGAAG -3′；

YyaR-F:    5′-CGATTGAGTGGGCRAAGGAGAATCATTTWTGYGGT-3′；

TetB – R:   5′-CCATATAGAGCTGTTCCAATGGAGAAG -3′；

PCR 反应条件为：94℃变性1min；94℃变性1min、52℃引物复性1min、72℃延伸1min, 30个循环， 最后72℃延伸7min。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的结果。

结果表明：当以枯草芽孢杆菌特异引物YyaO-F/TetB-R为扩增引物时，菌株C-D6能够扩增，扩增得到的片段约600多bp，以解淀粉芽孢杆菌特异引物YyaR-F/TetB-R为扩增引物，菌株C-D6不能够扩增，见图2。

基于上述形态和分子特征，菌株C-D6被鉴定为枯草芽孢杆菌。

实施例3 菌株的抑制效果测定

细菌培养液抑制附着胞形成的活性用载玻片培养法进行测定。方法为：取过滤除菌后的细菌培养液和炭疽菌孢子悬浮液（1×10⁶/mL）各20μL，混合滴加于载玻片上，25℃培养保湿培养12h，显微镜观察细菌培养液对孢子形成附着胞的影响。

采用上述方法测定了芽孢杆菌C-D6培养液对辣椒炭疽菌附着胞形成的影响。C-D6菌株的培养液对辣椒炭疽菌附着胞形成的抑制效果见图3。附图3显示：该菌的培养液不影响辣椒炭疽菌的孢子萌发，但能明显影响芽管生长，使菌丝前端不能分化形成附着胞。实验结果还表明：C-D6菌株的培养液对辣椒炭疽菌附着胞形成的抑制率为100%。

实施例4高效产生抑制附着胞形成的抗菌蛋白的实验条件

应用载玻片培养法对细菌培养液的抑菌活性进行测定，比较了不同培养基、培养时间和摇瓶装量等培养条件，对菌株C-D6产生抑制附着胞形成的活性物质的影响。结果表明：该菌产生抑制附着胞形成的活性物质的最适培养条件为：以YPD为培养基，摇瓶装量为50 mL/250 mL，在37℃下，180 r/min振荡培养48h。

实施例5 抗菌蛋白的分离纯化

C-D6发酵液蛋白粗提液的制备：采用(NH₄)₂SO₄分级盐析法，方法为：细菌发酵液过滤除菌后，加入固体(NH₄)₂SO₄至20%饱和度，4℃沉淀过夜。4℃下，10000 r/min离心30 min 后，所得蛋白质沉淀用原体积1/15的50 mmol/L磷酸缓冲液(_PH6.0)悬浮，获得20 %饱和度蛋白盐析液。上清液再冰浴，缓慢加入固体(NH₄)₂SO₄至30%饱和度，用同样方法制备得到20%～30%的盐析蛋白，依次制备得到30%～40%、40%～70%的盐析蛋白。将不同饱和度获得的盐析蛋白质液加入到透析袋中，放入外液为2 L的50 mmol/L磷酸缓冲液(_PH6.0)中透析，室温透析48 h后，离心弃沉淀，即得不同饱和度的蛋白粗提液。

用载片培养法测试了(NH₄)₂SO₄分级盐析获得的不同蛋白粗提液对稻瘟病菌和辣椒炭疽菌附着胞形成的影响。结果显示：0%～20%、30%～40%和40%～70%饱和度的(NH₄)₂SO₄盐析蛋白组分对辣椒炭疽菌的芽管生长和附着胞形成均有抑制作用，30%～40%饱和度的盐析蛋白组分无活性。进一步的观察发现：0%～20%饱和度粗提液的作用效果最好，能显著影响芽管生长，使菌丝前端不能分化形成附着胞。且粗提液稀释8倍后，仍有同样的效果。因此，选择该饱和度的蛋白粗提液为进一步分离纯化活性蛋白的材料。

Sephadex G-75分子筛纯化活性蛋白：采用AKTA层析系统，以Sephadex G-75层析柱为分离柱对20%饱和度的活性蛋白粗提液进行初步纯化。层析分离条件为：柱长40 cm，柱高与直径之比为25:1，上样量为5mL，流动相为50mmol/L  pH6.0的磷酸缓冲溶液，洗脱速度为0.5ml/min，洗脱1.2倍柱体积。洗脱结果如图4所示。

结果显示：20%饱和度的粗体液从加样后洗脱开始至所有组分全部流出，共出现2个峰，收集后标记为组分I和组分II。载片培养检测收集液的生物活性，结果显示：组分I对辣椒炭疽菌的附着胞形成的抑制作用与过柱前的效果一致，组分II无效果。组分I经过HPLC检测发现仍含有多种蛋白，需进一步纯化。

阴离子交换层析Q-Fastflow纯化活性蛋白：采用AKTA层析系统，以Q-Fastflow层析柱为分离柱对活性组分I进行进一步纯化。层析分离条件为：流动相A：0.01mM 磷酸缓冲液（PB），pH 7.4；流动相B：1M NaCl洗脱液（含流动相A）；洗脱方式：线性梯度洗脱；洗脱时间：110min；洗脱速度：1mL/min；上样量：2mL/min。洗脱结果见附图5。

结果表明：从上样至洗脱共出现三个峰，其中峰I为死体积峰，即鬼峰，峰II和峰III为1M NaCl洗脱峰。收集后分别标记为组分I、组分II和组分III。生物活性检测显示：只有组分II有活性，组分I和组分III均无活性。

HPLC检测活性蛋白的纯度：应用Agilent1200 HPLC检测经Q-Fastflow阴离子交换柱层析后，收集的活性组分II的纯度。实验参数为：流动相A：含0.09% TFA的超纯水；流动相B：含0.09% TFA的70%乙腈；流速：1mL/min；进样量：20μL；柱子：C3柱（4.6mm*180mm）。

经HPLC系统过C3柱的检测结果见图6。由图可知，活性蛋白经过Q-Fastflow阴离子交换柱层析纯化后，显示单一峰，表明分离效果较好，组分较单一。

通过上述工作，初步建立了从C-D6菌株分离抑制辣椒炭疽菌附着胞形成的活性蛋白的实验方法。

<110>  深圳职业技术学院

<120>  用于抑制病原真菌附着胞形成的枯草芽孢杆菌及其抗菌肽

<130>  2012

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1691

<212>  DNA

<213>  枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400>  1

gccttcgggc cagtgattcg agctcggtac cgtaatacga ctcactatag ggcgacatat     60

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Claims (9)

1. 一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )C-D6，其保藏编号为：CGMCC No.5345。

2. 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌C-D6，在抑制辣椒炭疽菌附着胞形成方面的应用。

3. 一种细菌培养液，包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其由以下步骤进行培养而成：

1）斜面活化培养的C-D6菌株；

2）摇瓶培养：将斜面活化培养的C-D6菌株接种到YPD液体培养基中进一步培养而得。

4. 如权利要求3所述细菌培养液，其特征在于：所述培养步骤1中，是从枯草芽孢杆菌C-D6的保藏菌种斜面划线接种到NA平板，37℃培养20-24 h，挑起单菌落接种到NA试管斜面，37℃培养20-24 h后，备用。

5. 如权利要求3所述细菌培养液，其特征在于：所述培养步骤2中，是将C-D6菌株接种到装有YPD液体培养基的培养瓶中，37℃，180 r/min振荡培养12 h后，按1%的接种量接种到相同培养瓶中，相同条件下震荡培养48 h，从而获得该细菌培养液。

6. 如权利要求3所述细菌培养液，其特征在于：所述YPD培养基组成成分为：酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0~7.2。

7. 一种抗菌蛋白，是由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌由以下分离纯化方法获得，该分离纯化方法包括如下步骤：

1）枯草芽孢杆菌细菌培养液的准备； 

2）硫酸铵沉淀分离：细菌培养液经20%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀后，离心沉淀蛋白，所得蛋白质沉淀用磷酸缓冲液悬浮，并用相同缓冲液透析48h后，离心弃沉淀，即得抗菌蛋白粗提液； 

3）抗菌蛋白纯化：采用AKTA蛋白纯化系统对蛋白粗提液进行进一步分离纯化。

8. 如权利要求7所述的抗菌蛋白，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌细菌培养液的准备进一步是由以下步骤获得：

1）斜面活化培养的C-D6菌株；

2）摇瓶培养：将斜面活化培养的C-D6菌株接种到YPD液体培养基中进一步培养而得；所述YPD培养基组成成分为：酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0~7.2。

9. 如权利要求7所述的抗菌蛋白，其特征在于：分离纯化方法的步骤2具体为：所述经20%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀后，离心收集沉淀蛋白，所得蛋白质沉淀用原体积1/15的磷酸缓冲液悬浮，并用相同缓冲液透析48h后，离心弃沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；所述纯化方法的步骤3具体为：以Sephadex G-75凝胶柱为分离柱，上样量为5 mL，流动相为50mmol/L pH 6.0的磷酸缓冲溶液，洗脱速度为0.5 mL/min，洗脱1.2倍柱体积；Sephadex G-75柱层析分离获得的活性产物通过阴离子交换层析Q-Fastflow进一步纯化，获得纯化活性蛋白；所述Q-Fastflow的分离条件为：流动相A：0.01mM 磷酸缓冲液（PB），pH 7.4；流动相B：1M NaCl洗脱液（含流动相A）；洗脱方式：线性梯度洗脱；洗脱时间：110min；洗脱速度：1mL/min；上样量：2mL/min。

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