CN105586297B

CN105586297B - 解淀粉芽孢杆菌植物亚种wk1菌株及其应用

Info

Publication number: CN105586297B
Application number: CN201610071330.9A
Authority: CN
Inventors: 徐秋芳; 程敏
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2016-02-01
Filing date: 2016-02-01
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2036-02-01
Also published as: CN105586297A

Abstract

一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum WK1菌株，从土壤中分离纯化获得，在CGMCC保藏，保藏编号为：CGMCC No.11640，保藏起始日期为2015年11月9日。该菌株的菌体、活性发酵液、灭菌发酵液、及发酵液提取的脂肽类物质均可用于山核桃干腐病病原菌Botryosphaeria dothidea的生物防治。脂肽类中fengycins占绝对优势、且成分多样而丰富，通过LC‑MS对fengycins类脂肽分析得知，分别为C15 fengycin A、C16 fengycin A、C17 fengycin A、C18 fengycin A及其异构体等成分。该菌株脂肽类物质还具有广谱拮抗活性，能抑制多种病原真菌菌丝生长。该菌种是开发环境友好型生物农药的潜在资源，具有重要的应用前景。

Description

解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物纯化及其在植物疾病防治中的应用，具体是解淀粉芽孢杆菌植物亚种Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum WK1菌株及该菌株在防治山核桃干腐病中的应用。

背景技术

芽孢杆菌生物特征丰富多样，分布极其广泛，是土壤微生物系统中的优势生物种群。芽孢杆菌突出的特征是能产生对热、干旱、紫外线和一些化学物品有很强的抗逆性的芽孢, 因此在不同环境中存活、定殖与繁殖的能力很强。很多优良的芽孢杆菌已经应用到防治植物病害上，并且获得商品化许可。芽抱杆菌防治植物病害的作用机制以竞争、拮抗和诱导植物抗性为主，其中拮抗作用主要是产生抗菌物质抑制有害病原物的生长或发展或直接杀灭病原物。非核糖体合成的脂肽类抗生素是抗菌物质中的一类，且对真菌具有强烈的拮抗作用。脂肽类物质在很多芽孢杆菌中发现，有伊枯草菌素（Iturin），生物表面活性素（Surfactin）、丰原素（fengycin）三大家族（参见Ongena M著Bacillus lipopeptides:versatile weapons for plant disease biocontrol），其相应的抗真菌活性的报道中，iturins 和 fengycins 抗真菌效果相对显著。Fengycins具有强烈的抗真菌效果，特别是抗丝状真菌（参见Deleu M著Effect of fengycin, a lipopeptide produced byBacillus subtilis, on model membranes）。此外，与iturins和surfactins相比，fengycins具有明显的降低溶血活性的效果(参见Kumar A著Antimicrobial lipopeptidesof Bacillus: natural weapons for biocontrol of plant pathogens)。

山核桃 Carya cathayensis为胡桃科 Juglandaceae 山核桃属Carya 落叶乔木，是投入产出效益很高的经济树种之一。山核桃干腐病是近年来山核桃林中发生的一种新病害, 该病在浙江省的临安、淳安、桐庐的山核桃栽培区普遍发生，个别地区株发病率达80 %～100%。病原菌有性态为子囊菌亚门 Ascomycotion 座囊菌目Dothidelales 葡萄座腔菌科 Botryosphaeriaceae 葡萄座腔菌Botryosphaera.sp.。有关山核桃干腐病的化学防治的研究报道的有春季刮除病斑结合喷洒药剂。药剂主要有402抗菌剂、乙蒜素乳油、硫酸铜晶体等。随着人们环保意识的不断增强以及高新技术在农业中的应用，利用有益生物来控制植物病害越来越得到广泛重视。施用化学药剂产生农药残留、提高病原菌的抗药性、污染环境等对生态环境和人体健康造成危害的一系列问题已经受到广泛关注。因此，寻找环境友好型的植物病害防治技术已经成为研究的热点之一。生物防治就是其中一项备受关注的技术与方法。

本发明中所涉及的解淀粉芽孢杆菌植物亚种Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum

WK1（简称WK1），不仅菌株本身具有防效作用，其菌体发酵液和灭菌发酵液都有较高的防效。从WK1菌株发酵液中提取的脂肽类化合物，表现为fengycin类脂肽占绝对优势，且成分多样。由此说明WK1菌对真菌病原菌有很强的抑制效果，可作为一种生物防治菌开发利用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum WK1菌株及其在抑制山核桃干腐病病原菌生长方面的应用。

解决上述技术问题，采用以下技术方案：

本解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种（Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum WK1），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.11640，保藏日期为 2015年 11 月 9 日；该菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板生长时，菌落直径为2.0～3.0mm、圆形、凸起、边缘波状、表面褶皱粘稠、乳白色、不透明的菌落；革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列，有芽孢，芽孢端生，椭圆形，芽孢囊膨大；营养肉汤液体静置培养，表面产生菌膜，液体浑浊；在质量比为10%NaCl 水溶液、pH=1～13条件中生长。

本解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株的应用，是应用该菌株及其发酵液或灭菌发酵液上清液来抑制山核桃干腐病病原真菌的生长。

本解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株抑制山核桃干腐病病原真菌的生长的主要成分为脂肽类物质中的丰原素fengycins，成分有C15 fengycin A、C16 fengycin A、C17fengycin A、C18 fengycin A及其异构体，异构体为侧链的normal-、iso- 和 anteiso三种异构化形式。

本解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株及其发酵液和灭菌发酵液上清液的制备方法按如下步骤进行：

（1）活化菌种：

将保存在斜面培养基中的解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株，在NA固体培养基上划线生长48小时；

（2）WK1菌株发酵液的制备：

选取 NA固体培养基上的单菌落，接种于100ml NA液体培养基中，在 37℃、180r/min 条件下培养 14 小时，得到种子液；再将种子液按接种量为3%（v/v）分别接种于500mlNA液体培养基中，在 37℃、180r/min 条件下培养48小时，得到WK1菌株发酵液；

（3）WK1灭菌发酵液上清液的制备：

将步骤（2）所述菌体的WK1菌株发酵液于高温高压灭菌锅里121℃灭菌30min后，将灭菌发酵液3000r/min 离心15min后，得WK1灭菌发酵液上清液。

本解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株的应用，其特征是所述的脂肽类物质具有抑制杉木枯萎病、棉花黄病、哈密瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、立枯丝核菌、蔬菜根腐病、茄子辣椒根腐病病原菌菌丝生长的作用。

本发明的有益效果是：

WK1菌株是针对山核桃干腐病而筛选出来的有较强生防效果的生防菌，且在生防应用上芽孢杆菌具有很强的生位态，能在环境中很好的存活，因此具有很强的生长优势。不仅WK1菌株本身具有防效作用，其菌体发酵液和灭菌发酵液的上清液都有较高的防效。最大的特点是，WK1菌株主要代谢物的脂肽类化合物成分表现为fengycin类脂肽占绝对优势，且成分多样，而fengycin被证明是3种脂肽类化合物中抗真菌效果最好(参见Deleu M著Effect of fengycin, a lipopeptide produced by Bacillus subtilis, on modelmembranes)。由此说明WK1菌具有很强的抗真菌病原菌的效果。因此，该菌株在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。

附图说明

图 1 为菌株 WK1 菌落形态图

图 2 为菌株WK1革兰氏染色镜检图

图 3 为菌株WK1 芽孢染色镜检图

图 4 为菌株WK1 对山核桃干腐病的抑制5天的效果显示图

图 5 为菌株WK1 对山核桃干腐病的抑制15天的效果显示图

图 6为菌株WK1的系统发育树图

图7为流动相条件1（乙腈：0.05%三氯乙酸水溶液=40:60）的WK1菌株脂肽粗提物高效液相色谱图

图8为流动相条件1（乙腈：0.05%三氯乙酸水溶液=40:60）的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）脂肽高效液相色谱图

图9为流动相条件2（乙腈：0.05%三氯乙酸水溶液=49:51）的WK1菌株脂肽粗提物高效液相色谱图

图10为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间12.78min的fengycins质谱图

图11为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间15.18min的fengycins质谱图

图12为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间16.98min的fengycins质谱图

图13为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间18.64min的fengycins质谱图

图14为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间19.59min的fengycins质谱图

图15为流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间21.39min的fengycins质谱图

WK1菌株的菌种保藏：WK1菌种的活体纯培养已于 2015 年 11 月9日保藏于 ‘中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心’ ，保藏号：CGMCC No.11640 。

具体实施方式

本发明下面结合实施例并参照附图作详述：

本解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种（Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum）WK1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.11640，保藏日期为2015年11月9日；该菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板生长时，菌落直径为2.0～3.0mm、圆形、凸起、边缘波状、表面褶皱粘稠、乳白色、不透明的菌落；革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列，有芽孢，芽孢端生，椭圆形，芽孢囊膨大；营养肉汤液体静置培养，表面产生菌膜，液体浑浊；在质量比为10%NaCl 水溶液、pH=1～13条件中生长。

（1）活化菌种：

（2）WK1菌株发酵液的制备：

选取 NA固体培养基上的单菌落，接种于100ml NA液体培养基中，在 37℃、摇瓶转速为180r/min 条件下培养 14 小时，得到种子液；再将种子液按接种量为3%（v/v）分别接种于500ml NA液体培养基中，在 37℃、180r/min 条件下培养48小时，得到WK1菌株发酵液；

本解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株抑制山核桃干腐病病原真菌生长的脂肽类物质的应用，其特征是所述的脂肽类物质具有抑制杉木枯萎病、棉花黄病、哈密瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、立枯丝核菌、蔬菜根腐病、茄子辣椒根腐病病原菌菌丝生长的作用。

（3）WK1灭菌发酵液上清液的制备：

下面本发明将与申请主题相关的一些具体试验方法介绍如下：

WK1菌株的筛选：从天目山雷竹林土壤中分离筛选出的一株菌株，该菌株对其周围生长的其他菌株有拮抗作用，故经划线培养，得到纯化的菌株。再在PDA培养基上与山核桃干腐病致病菌葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea 进行对峙培养。平板对峙试验结果见图4，图5，WK1菌株与病原菌同时打饼接种，中间为病原菌，两边为WK1。图4为培养5天两种菌的生长状况，图5为培养15天的两种菌生长状况。由图5可以看出两边的WK1与中间的病原菌形成抑制隔离带，说明WK1对山核桃干腐病致病菌葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea有抑制作用。

WK1菌株的形态鉴定：将菌株WK1在 NA 固体培养基平板上于 37℃下培养 2d，观察其菌落形态（形状、颜色光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘形状等）。菌株WK1在NA固体培养基上菌落直径2.0～ 3.0mm，圆形、凸起、边缘波状、表面褶皱粘稠、乳白色、不透明的菌落（见图1 ）；革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列（见图2）；有芽孢，芽孢端生，椭圆形，芽孢囊膨大（见图3）；

WK1菌株的生理生化反应：将WK1菌株接种到API 50CHB鉴定条中，37℃下24h培养，结果见表1。

表1 WK1菌株的生理生化反应（表1）

注：+ 表示阳性；- 表示阴性

WK1菌株分子生物学鉴定：提取菌株的基因组DNA，以通用引物(上游引物27 F

5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′，下游引物1492 R 5'- CTGAGCCAGGATCAAACTCT -3'，引物由上海生工合成 ) PCR扩增拮抗菌株的16S rDNA 。PCR 扩增后经电泳检测，测序。经测序分析确定16S rDNA片断长度为1514kb。运用在线BLAST 全序列比对软件（ http://www.eztaxon.org）网站SimTable 选项比对，点击“view all seq”获得同一分类单元相近菌株的16S rRNA 基因序列。将该菌株的 16S rDNA 序列与 GenBank 数据库收录的对比菌株的 16S rDNA 基因序列进行同源性比对。结果与B.amyloliquefaciens subsp. Plantarum FZB42 等解淀粉芽孢杆菌的同源性高达 99%。采用

neighbour-joining方法和Kimura 2-Parameter Distance 模型构建系统发育树（图6），WK1菌株与B.amyloliquefaciens subsp. Plantarum FZB42聚成一支，因此将菌株WK1确定为解淀粉芽孢杆菌植物亚种B.amyloliquefaciens subsp. Plantarum ，自定代号为WK1。

WK1菌株对山核桃干腐病的抑制作用：在平板对峙试验培养过程中病原菌菌丝与WK1菌形成隔离带，说明WK1对山核桃干腐病病原菌的生长有很强的抑制作用（见图4和图5）。

WK1菌株发酵液对山核桃干腐病的抑制作用：将WK1菌液与山核桃干腐病病原菌混合培养在PDA液体培养基中，180 r /min，培养温度 37℃，培养 2 天。之后将混合培养液涂布在PDA固体培养基上，观察病原菌不生长，说明WK1菌液与山核桃干腐病病原菌混合培养时，前者对后者有很强的抑制作用，导致山核桃干腐病病原菌死亡。

WK1菌株灭菌发酵液的上清液对山核桃干腐病的控病效果：将灭菌发酵液的上清液按照1:9、2:8、5:5的比例加入PDA培养基后混匀，制成含药平板，再将病原菌菌饼接入平板中央，28℃培养。以PDA纯培养基作为对照，处理1是上清液:纯培养基=1:9，处理2为上清液:纯

培养基=2:8，处理3为上清液:纯培养基=5:5。每个处理重复 3 次。待对照组病原菌菌丝长满培养皿时，十字交叉法测量各处理组菌落直径，计算平均值和相对抑制率。

抑制率的计算方法：

表2 WK1菌株灭菌发酵液上清液对山核桃干腐病病原菌的抑制效果表

（表2）

处理	抑制率%
		处理1	61%
处理2	75%
		处理3	93%

由表 2 可以看出，WK1菌株菌株灭菌发酵液的上清液对山核桃干腐病病原菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，且随着上清液含量的增加，抑制效果越强。

WK1菌株发酵液中脂肽类物质的提取：提取方法为酸沉淀法。先用2%NaOH溶液将细菌发酵液调节pH至8.0，4000r/min离心30min；去除菌体，取上清液，用6mol/L盐酸调节上清液pH至2.0，静置于4℃冰箱中过夜；过夜后的发酵上清液于4000r/min离心30min，弃上清液取沉淀，将沉淀用pH 2.0的盐酸洗涤3次后，用甲醇少量多次萃取，萃取液在RE-2000A旋转蒸发仪中于35℃减压蒸干溶剂，得到脂肽粗提物。

WK1菌株发酵液的脂肽类化合物成分分析：将菌株发酵液经过酸沉淀法提取出的脂肽粗提物用甲醇溶解，用高效液相色谱-质谱联用( LC-MS)分析测定脂肽粗提物所含化合物类型。高效液相色谱分析柱为 Phenomenex Luna C18，4.6×250 mm ,流动相为乙腈：0.05%三氯乙酸水溶液=40:60（体积比）, 流速 1mL /min ,检测波长：UV 220 nm。

图7为流动相条件1（乙腈：0.05%三氯乙酸水溶液=40:60）的WK1菌株脂肽粗提物高效液相色谱图。图8为流动相条件1（乙腈：0.05%三氯乙酸水溶液=40:60）的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）脂肽高效液相色谱图。地衣芽孢杆菌的脂肽可根据高效液相色谱图的保留时间判断为三类：0-12 min是iturin类脂肽；15-25 min是fengycin类脂肽；30-35 min是surfactin类脂肽。图7与图8对比可以表明WK1菌株的代谢物显然分布在fengycin区域。

WK1菌株的代谢物成分非常复杂，绝大部分化合物没有被充分分离，因此其相应的LC-MS图谱十分难以解析。因此，又进一步优化了HPLC色谱条件，将流动相改为乙腈：0.05%三氯乙酸=49:51（体积比）,其他条件不变。同时对样品峰分别进行质谱分析,确定分子量。由图9可以看出，WK1脂肽粗提物产率较高，且脂肽种类丰富，主要成分应为fengycins。而且该粗提物在fengycin区域呈现差异丰富多样性峰处峰位置出现了比常见Bacillus菌株更多的代谢物。

几乎所有的Bacillus脂肽的分子量均大于900。然而该样品主要色谱峰的质谱图给出的准分子离子峰均为700左右。这说明该类代谢物不同于iturin、fengycin、surfactin3类脂肽，或者形成了双离子峰。研究发现fengycin经常可以在ESI-MS质谱图上产生双质子化的准分子离子峰。因此，所检测到的代谢物仍然极有可能是fengycins。

图10是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间12.78min的峰进行质谱分析。假设 m/z 725.26是双质子化离子[M+2H]²⁺，则其分子量应为1448.5。这与fengycin类化合物C15 fengycin A 一致，因此 12.78 min处的色谱峰应为C15 fengycin A。

图11是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间15.18min的峰进行质谱分析。假设 m/z 732.40是双离子峰[M+2H]²⁺, 则其分子量应为1462.8。这与常见fengycin类化合物C16 fengycin A 一致，因此 15.18 min处的色谱峰应为C16 fengycin A。

图12是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间16.98min的峰进行质谱分析。由双离子峰m/z 739.46 [M+2H]²⁺可以推测出该化合物的分子量应为1476.9. 与C16fengycin A相比多14 Da，即一个亚甲基单位 (-CH₂-),说明该化合物的侧链长度应该多一个亚甲基单位。即该化合物推测为C17 fengycin A.

图13是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间18.64min的峰进行质谱分析。18.64min处的色谱峰与16.98min处的色谱峰拥有相同的双电荷峰和分子量(1476.9),这说明该化合物应为前一个化合物的同分异构体。在fengyicin类脂肽中常见的异构化现象发生在β-羟基脂肪酸侧链的末端，三种异构化形式分别为normal-型(n-型)，iso-型以及anteiso-型。因此，这两个化合物应为n-C17 fengycin A, iso-C17 fengycin A 和anteiso-C17 fengycin A中的两种。

图14是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间19.59min的峰进行质谱分析。由双离子峰m/z 746.43 [M+2H]²⁺可以推测出该化合物的分子量应为1490.8. 比上一个化合物又增加14 Da，说明其侧链再延长一个亚甲基单位。因此该化合物应为C18 fengycinA.

图15是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间21.39min的峰分别质谱分析。21.39min处给出与19.59min处色谱峰相同的准分子离子峰，说明它们同样是一对同分异构体，异构化同样应发生在β-羟基脂肪酸的末端。

WK1菌株发酵液的脂肽类化合物对多种病原真菌菌丝的抑制：

采用滤纸片法，样品采用甲醇溶解，将20μl样品加到灭好菌的滤纸片上挥去甲醇，待测病原真菌挖块接种于固体培养基平板中央，周围放置不同浓度的加样品的滤纸片，于28℃培养，测量抑菌圈，每个浓度三个重复。以滤纸片中心为点，到菌丝边界画圆，用游标卡尺测量三个重复，取得平均值，即为抑菌圈直径。

表3WK1菌株发酵液的脂肽类化合物对多种病原真菌菌丝的抑菌圈表

(表3)

由表3可以看出，脂肽化合物抑制杉木枯萎病、棉花黄病、哈密瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、立枯丝核菌、蔬菜根腐病、茄子辣椒根腐病这7种病原真菌的菌丝的生长。抑制效果在实验范围内随浓度的增加而增强。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株，其特征是该菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种（Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum ）WK1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.11640，保藏日期为 2015年11 月 9 日；该菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板生长时，菌落直径为2.0～3.0mm、圆形、凸起、边缘波状、表面褶皱粘稠、乳白色、不透明的菌落；革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列，有芽孢，芽孢端生，椭圆形，芽孢囊膨大；营养肉汤液体静置培养，表面产生菌膜，液体浑浊；在质量比为10%NaCl 水溶液、pH=1～13条件中生长；WK1菌株抑制山核桃干腐病病原真菌的生长，WK1菌株抑制山核桃干腐病病原真菌生长的主要代谢产物为脂肽类物质中的丰原素fengycins，成分有C15 fengycin A、C16 fengycin A、C17 fengycin A和C18 fengycin A。

2.一种权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株的应用，其特征是应用该菌株及其发酵液或灭菌发酵液上清液，抑制山核桃干腐病病原真菌的生长。

3.如权利要求2所述的对解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株的应用，其特征是所述丰原素fengycins包括侧链为normal-、iso- 和 anteiso异构化的C17 fengycin A中的任意两种。

4.一种权利要求2 所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株的发酵液和灭菌发酵液上清液的制备方法，按如下步骤进行：

（ 1 ）活化菌种：

将保存在斜面培养基中的解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株，在NA固体培养基上划线生长48小时;

（ 2 ） WK1菌株发酵液的制备：

选取 NA固体培养基上的单菌落，接种于100ml NA液体培养基中，在 37℃、180r/min条件下培养 14 小时，得到种子液；再将种子液按接种量为3%（v/v）分别接种于500ml NA液体培养基中，在37℃、180r/min 条件下培养48小时，得到WK1菌株发酵液;

（ 3 ） WK1灭菌发酵液上清液的制备：

5.一种权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株的应用，其特征是应用该菌株及其发酵液或灭菌发酵液上清液的所述的脂肽类物质抑制杉木枯萎病、棉花黄病、哈密瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、立枯丝核菌、蔬菜根腐病、茄子辣椒根腐病病原菌菌丝的生长。