CN103834585A

CN103834585A - 高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根际假单胞菌

Info

Publication number: CN103834585A
Application number: CN201310511796.2A
Authority: CN
Inventors: 周莲; 何亚文
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Zhou Lian
Priority date: 2013-10-24
Filing date: 2013-10-24
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2033-10-24
Also published as: CN103834585B

Abstract

本发明公开了一种高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根际假单胞菌；所述根际假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201CCTCC N0：M2013441。本发明菌株PA1201是在重庆市郊区水稻大田中采集根系土壤样品时，分离纯化得到的一株野生型环境微生物；该菌株能稳定且高效生产杀菌剂吩嗪-1-羧酸和新型杀菌化合物吩嗪-1-酰胺，有效抑制水稻病害：水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)的生长；可利用该菌株的发酵次生代谢产物制备能够有效控制植物真菌性和细菌性病害的微生物源农药。

Description

高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根际假单胞菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根际假单胞菌。

背景技术

世界人口在近半个世纪以来急剧增长，而全球耕地面积却逐年减少，因此全球粮食需求总量不断提高。当代农业生产中，农药的应用极大程度地保障了粮食产量。特别是近些年逐渐崛起的生物农药，在不以污染环境为代价的基础上，对农作物病虫害进行防治，为提高粮食产量和品质做出了巨大的贡献。生物农药是指利用生物活体(包括动物、植物、微生物)或其代谢产物杀灭或抑制农业有害生物(包括害虫、致病细菌和致病真菌)的农药制剂。由于源于自然，生物农药通常具有高效、广谱及与环境相容性好等特点，已成为当代农业发展的必然趋势。

植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指存在于植物根系周围的一类可促进植物生长或加强其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类；PGPR亦是自然界馈赠于人类社会的资源宝库，众多生物农药均源于PGPR及其代谢产物。历经长期大量的基础及应用研究，国内外已有越来越多源于PGPR的生物农药被发现并被应用于生物防治之中，例如：枯草芽孢杆菌QST713制剂可用于防治樱桃、瓜类蔬菜、葡萄番茄等作物由真菌和细菌引起的疮痂病、白粉病、褐斑病、早疫病、细菌性斑点病等多种病害；荧光假单胞菌PF—A22UL菌株可有效防治黄瓜白粉病；铜绿假单胞菌菌株63—28用于防治观赏植物由真菌侵染引起的植物根部枯萎病；井冈霉素是由水链霉菌井冈变种产生的一种多组分氨基糖苷类抗生素，被大量应用于水稻纹枯病的生物防治。

井冈霉素于上个世纪70年代开始使用，目前已成为我国使用量最大的农用抗生素；然而，在经历了近40年的使用期后，部分水稻纹枯病菌对井冈霉素已产生了一定的抗药性。申嗪霉素源于具有我国自主知识产权的荧光假单胞菌M18，是新一代的绿色生物农药，其主要成分是由M18菌株发酵生产的一种次生代谢产物吩嗪-1-羧酸可用于防治水稻纹枯病、西瓜枯萎病和甜椒疫病等真菌性根腐和茎腐病害。申嗪霉素的大田试验表明：申嗪霉素、井冈霉素和进口农药“满穗”都能有效防治水稻纹枯病，申嗪霉素的实际使用量为1克／亩田，为井冈霉素的五分之一左右，是“满穗”的三分之一。但是在一般条件下，申嗪霉素在野生型菌株M18中的发酵效价约为0.05～0.1克／升(葛宜和等，假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控；微生物学报，第44卷第6期，2004)，不利于生产。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的植物根际促生假单胞菌，根际铜绿假单胞菌PA1201；所述吩嗪-1-酰胺为新型抑菌化合物，利用本发明菌株的发酵次生代谢产物可制备能够有效控制植物真菌性病害和细菌性病害的微生物源农药。

本发明菌株是在重庆市郊区水稻大田中采集根系土壤样品时，分离纯化得到的一种野生型环境微生物。经16s rDNA序列分析和MIDI SHERLOCK微生物自动鉴定系统分析，该菌株被鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，并被命名为PA1201。本发明的菌株铜绿假单胞菌PA1201，Pseudomonas aeruginosa PA1201已于2013年9月23日在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072)保藏，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，保藏号为CCTCC NO：M2013441。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一株高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根际假单胞菌，所述根际假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201CCTCC M2013441。

第二方面，本发明涉及一种用前述的根际假单胞菌制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的方法，所述方法具体包括如下步骤：

A、菌株发酵；

B、调节发酵液pH值为3.0～4.0，加入氯仿对发酵液进行萃取，即得所述吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺。

优选地，所述菌株发酵具体为：接种所述菌株PA1201于LB平板上，在25～37℃下活化生长18～28小时，然后挑取所述PA1201单克隆接种于LB培养液，在25～30℃的摇床中震荡培养16～24小时，摇床转速为180～220转／分，得种子液；将所述种子液以1～5％的接种量接种于黄豆粉发酵培养液中进行放大发酵培养，在25～30℃的摇床中震荡发酵培养36～48小时，摇床转速为180～220转／分。

优选地，所述LB培养液具体为，每1L培养液的制备方法包括如下步骤：取去离子水1升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克，混合，pH调节为7.0～7.4，121℃高压灭菌15分钟后，即得。

优选地，所述黄豆粉发酵培养液具体为，每1L发酵培养液的制备方法包括如下步骤：取去离子水978毫升、黄豆粉65克、玉米浆16克、葡萄糖12克、无水乙醇22毫升，混合，pH调节为6.8～7.2，121℃高压灭菌15分钟后，即得。

优选地，所述调节发酵液pH值采用的是5～7M的盐酸。

优选地，所述氯仿与发酵液的体积比为3：1～4：1。

第三方面，本发明涉及一种前述的根际假单胞菌在制备防治水稻白叶枯病农药中的用途。

本发明具有如下有益效果：

1.本发明菌株PA1201能稳定且高效生产吩嗪-1-羧酸：

从甜瓜根际分离得到的生物拮抗菌株M18中吩嗪-1-羧酸的发酵效价较低，一般为0.05～0.1克／升发酵液(葛宜和等，假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控；微生物学报，第44卷第6期，2004)，与之相比，本发明菌株PA1201高产吩嗪-1-羧酸，每升发酵液中的含量可达0.8～1.0克。因此，与M18原始菌株相比，PA1201的发酵效价提高近10倍。

2.本发明菌株PA1201能产生新型杀菌化合物吩嗪-1-酰胺：

在国际上，生防细菌绿针假单胞菌PCL1391(Pseudomonas chlororaphis PCL1391)的次生代谢产物吩嗪-1-酰胺(PCN)，可有效抑制一系列植物病原真菌，包括尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、灰霉病菌、终极腐霉菌、黑白轮枝菌及胡萝卜链格孢菌，且PCN在中性和碱性条件下的抑菌活性是PCA的5—10倍(Chin—A—Woeng et a1.，Biocontrol byPhenazine-1-carboxamide—Producing Pseudomonas chJororaphis PCL1391of TomatoRoot Rot Caused by Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici.Molecularplant-microbe interactions，1998，11：1069—1077.)。然而，该菌株PCL1391的PCN产量较低，即使经多重发酵优化后，其发酵效价仅达到150毫克／升(Chin—A—Woeng eta1.，Introduction of thephzH gene of Pseudomonas chJororaphis PCL1391extendsthe range of biocontrol ability of phenazine-1-carboxylic acid—producingPseudomonas spp.strains.Molecular plant-microbeInteractions，2001.14：1006—1015.)。本发明菌株PA1201的吩嗪-1-酰胺的发酵效价可达350～450毫克／升发酵液，是原有技术的2～3倍左右。

3.本发明菌株PA1201能有效抑制水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)菌株PXO99A的生长：

水稻白叶枯病是世界性细菌性病害，在中国是仅次于稻瘟病的第二大病，对水稻生产危害极大(章琦，水稻白叶枯病抗性的遗传及改良。北京：科学出版社，2007，xiii—xvii.)。由于植物病原细菌繁殖速度快、侵染途径多、远距离传播与近距离扩散相辅相成，因而较难进行防治(彭炜，植物细菌性病害研究初探。摘自《植物病理学研究进展》(王琦，姜道宏主编)。北京：中国农业科学技术出版社，2007，72—76)。常用于防治白叶枯的农药有叶枯宁、叶枯净，叶枯灵等(蔡祝南等，水稻病虫害防治。北京：金盾出版社，2006，5—23)。其中，农药叶枯净的主要成分为5-氧吩嗪，其工业生产通常通过化学方法合成，例如：以苯为溶剂，氢氧化钠为催化剂，由苯胺和硝基苯合成制备。然而，以该方法合成5-氧吩嗪，会产生大量工业三废，污染环境，给生态环境造成众多隐患。本发明菌株PA1201能同时高效产生抑菌化合物吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺，它们的化学结构与叶枯净相似(见图5)，且在平板抑菌实验中PA1201可有效抑制水稻白叶枯病菌的生长。因此，本发明菌株PA1201及其代谢产物(吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺)可用于生物防治水稻白叶枯病菌，响应了我国生物农药防治细菌性病害的强烈需求，并可有效避免通过化学方法合成5-氧吩嗪(叶枯净)所带来的生态环境污染问题，有利于现代农业的健康发展。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为铜绿假单胞菌PA1201的单细胞形态示意图；

图2为PA1201有效抑制水稻纹枯病菌菌丝生长的示意图；

图3为PA1201有效抑制水稻白叶枯病菌生长的示意图；

图4为细菌侵染A549细胞5小时后，A549的细胞存活率的比较示意图；

图5为吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-酰胺和5-氧吩嗪的化学结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

本发明菌株是在重庆市郊区水稻大田中采集根系土壤样品时，分离纯化得到的一株野生型环境微生物。经16s rDNA序列分析和MIDI SHERLOCK微生物自动鉴定系统分析，该菌株被鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201。

一、本发明菌株培养及适宜的生长条件：

本菌株生长温度范围是20～42℃，最适宜温度为25～30℃，可在以下三种培养基中生长。

1.基础培养基为无机盐培养基。所述无机盐培养基具体为，每1L培养基的制备方法包括如下步骤：取去离子水1升、磷酸二氢钾4.5克、磷酸氢二钾10.5克、甘露醇2克、硫酸铵2克、七水合硫酸镁0.16克、七水合硫酸亚铁5毫克、二水合氯化钙11毫克、四水合氯化锰2毫克、琼脂15克，混合，pH调节为6.8～7.2，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。

2.常规培养基为溶菌肉汤(LB)培养基。所述LB培养基具体为，每1L培养基的制备方法包括如下步骤：取去离子水1升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克、琼脂15克，混合，pH调节为7.0～7.4，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。

3.发酵培养液为黄豆粉发酵培养液。所述黄豆粉发酵培养液具体为，每1L培养液的制备方法包括如下步骤：取去离子水978毫升、黄豆粉65克、玉米浆16克、葡萄糖12克、无水乙醇22毫升，混合，pH调节为6.8～7.2，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。

二、本发明菌株具有如下微生物学特征：

1.细胞形态特征：杆状，(1～3)μm×(0.5～1)μm，极性单生鞭毛(如图1所示)；

2.在溶菌肉汤(LB)平板上的单克隆形态(30℃，36h)：

菌落性状：圆形；

菌落表面隆起：平滑、有光泽、菌落粘稠，边缘整齐；

菌落大小： 2～3mm；

色调：浅黄。

3.抗生素最低抑菌浓度(Minimal Inhibition Concentration，MIC)

将本发明菌株PA1201接种于含有不同浓度抗生素(包括：卡那霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、四环素和壮观霉素)的LB培养液中进行发酵培养，培养温度为28～30℃，摇床转速为180转／分。在培养过程中，通过测量发酵液在600nm时的吸光值，实时监测发酵液的细胞密度。培养48小时后，绘制PA1201在各个条件下的生长曲线，确定测试抗生素可抑制该菌株生长的最低浓度(表1)。我们发现：本发明菌株PA1201能抗较高浓度的卡那霉素和壮观霉素，但对四环素和庆大霉素敏感。所述LB培养液具体为，每1L培养液的制备方法包括如下步骤：取去离子水1升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克，混合，pH调节为7.0～7.4，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。

表1抗生素对PA1201的最低抑菌浓度

4.磷脂脂肪酸鉴定：

通过四区划线法，将PA1201接种于胰蛋白胨大豆肉汤TSBA平板上，28℃培养24～36h后，用无菌接种环从平板的第三区获取PA1201菌体，约20mg，置于10mL带聚四氟乙烯塞的玻璃瓶中；随后，向含有菌株样品的玻璃瓶中加入1mL皂化试剂，盖紧盖后振荡混匀，置于沸水浴中30min，进行皂化反应；皂化反应后，反应液冷却至室温后，加入2mL甲基化试剂，盖紧盖后振荡混匀，置于80℃水浴中甲基化反应10min后，快速冷却置室温；加入1.25mL萃取试剂，室温下混合旋转萃取10min，保留上层萃取液；加入3mL碱洗试剂，震荡后静置，带混合液分层后，取上层有机相于GC样品瓶中，通过安捷伦7890N气相色谱仪进行磷脂脂肪酸鉴定。所述胰蛋白胨大豆肉汤TSBA培养基具体为，每1L培养基的制备方法包括如下步骤：取去离子水1升、胰蛋白胨17克、蛋白胨3克、葡萄糖2.5克、氯化钠5克、磷酸氢二钾2.5克、琼脂15克，混合，pH调节为7.0，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。所述皂化试剂具体为，每300mL皂化试剂的制备方法包括如下步骤：取HPLC级甲醇150mL、去离子水150mL、氢氧化钠45克，混合；所述甲基化试剂具体为，每600mL皂化试剂的制备方法包括如下步骤：取HPLC级甲醇275mL和6N盐酸325mL，混合；所述萃取溶剂具体为，每400mL萃取溶解的制备方法包括如下步骤：取甲基叔丁基醚200mL和正己烷200mL混合；所述碱洗液具体为，每900mL碱洗液的制备方法包括如下步骤：取去离子水900mL和氢氧化钠10.8克，混合。

通过MIDI SHERLOCK微生物自动鉴定系统分析本发明菌株PA1201细胞膜中磷脂脂肪酸(PLFA，Phospholipid Fatty Acid)的类型和含量，从生理生化方面证实本发明菌株PA120属铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其Similarity Index指数为0.787。

5.分子鉴定：

设计一对引物，引物的核苷酸序列如下，以PA1201菌株的基因组DNA为模版，利用高保真DNA聚合酶Q5(Biolabs)扩增该菌株的16s rDNA：

正向：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；(SEQ ID N0.1)

反向：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；(SEQ ID N0.2)

扩增产物通过琼脂糖电泳检测，回收长度为1.526kB的基因片段。再使用上述引物，对扩增基因片段进行测序。分析所得PA1201菌株的16s rDNA的核苷酸段序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI：http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi)数据库的核苷酸序列比对结果，确认本发明菌株PA1201的16s rDNA序列与铜绿假单胞菌多个菌株的16srDNA序列完全吻合，因此，确认本发明菌株PA1201为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

6.抑菌活性

1)本发明菌株PA1201可有效抑制水稻纹枯病菌菌丝生长：

将PA1201接种于马铃薯葡萄糖PDA平板中心，25～30℃培养1天后，再在该平板上将已培养了2天的水稻纹枯病菌菌丝琼脂块接种于位于中央PA1201菌斑与平板边缘的一半处，25～30℃培养1～2天后，观察抑菌效果：本发明菌株PA1201能有效抑制水稻纹枯病菌菌丝在其周围生长，其抑菌距离约为10～15mm(见图2)。相同条件下，大肠杆菌DH5α不具有抑制水稻纹枯病菌菌丝生长的效果。所述马铃薯葡萄糖PDA培养基具体为，每1L培养基的制备方法包括如下步骤：取去离子水1升、马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克，混合，pH调节为6.4～6.8，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。

2)本发明菌株PA1201可有效抑制植物细菌病害-水稻白叶枯病菌生长。

将水稻白叶枯病菌PXO99A接种于NA平板上，在25～30℃下活化生长48～60小时，然后挑取PXO99A单克隆接种于NA培养液中，在25～30℃的摇床中震荡培养24小时，摇床转速为180～220转／分。然后以1：100～1：200的比例将该发酵液接种于温度为42～45℃已融化NA琼脂(琼脂含量为0.6～1.0％)培养基中，迅速混匀后，制备平板。待含有水稻白叶枯病菌的NA琼脂平板凝固后，将本发明菌株PA1201接种于该平板中心，置于25～30℃培养2～3天后观察：水稻白叶枯病菌可在平板周边大部分区域生长，但不可生长于平板中心PA1201菌落周围，该抑菌圈直径约为25～30mm(见图3)。相同条件下，大肠杆菌DH5α不具有此类抑菌效果。所述NA培养基(液)具体为，每1L培养基的制备方法包括如下步骤：取去离子水1升、蛋白胨5克、牛肉浸膏3克、蔗糖5～10克，酵母提取物1～2克，琼脂6～10克(在NA培养液不含此组分)，混合，pH调节为6.5～7.2，115摄氏度高压灭菌20分钟后，即得。

7.细胞毒性：

通过使用罗氏公司的细胞毒性检测试剂盒(Cytotoxicity Detection Kit(LDH)；货号：11644793001)检测本发明菌株PA1201对人类肺部上皮细胞系A549的细胞毒性：当感染复数为50时，PA1201与细胞系A549共培养5小时后，A549细胞的存活率约为89％，与感染大肠杆菌DH5α后A549细胞的存活率相当(约为85％)；然而，相同条件下临床铜绿假单胞菌菌株PAO1和PA14侵染A549细胞后导致A549细胞的存活率显著降低，分别为63％和26％(见图4)。由此可见，与临床铜绿假单胞菌菌株PA14和PAO1相比，来源于水稻根际的菌株PA1201对A549细胞的细胞毒性较低。

三、本发明菌株可用于生产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺，生产方法包括如下步骤：

1.菌株发酵：

将本发明菌株PA1201接种于LB平板上，在25～37℃下活化生长18～28小时，然后挑取PA1201单克隆接种于LB培养液的三角瓶中放大，在25～30℃的摇床中震荡培养16～24小时，摇床转速为180～220转／分。

然后以该培养液为种子液，以1～5％的接种量接种于黄豆粉发酵培养液进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为36～48小时。其中，所述LB培养液具体为，每1L培养液的制备方法包括如下步骤：取去离子水1升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克，混合，pH调节为7.0～7.4，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得；所述黄豆粉发酵培养液具体为，每1L培养液的制备方法包括如下步骤：取去离子水978毫升、黄豆粉65克、玉米浆16克、葡萄糖12克、无水乙醇22毫升，混合，pH调节为6.8～7.2，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。

2.吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的提取方法；

向所得发酵液中加入适量6M盐酸，将发酵液pH调整至3.0～4.0后，加入3倍发酵液体积的氯仿对发酵液中的吩嗪类物质进行萃取。静置后，取下层氯仿萃取液，在35～45℃下将萃取液旋转蒸干，可得粗提吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺混合物(纯度达88～95％)，其中，吩嗪-1-羧酸的含量为800～1000毫克／升发酵液，吩嗪-1-酰胺的含量为350～450毫克／升发酵液。

所述吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺定量分析方法如下：吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺在发酵液中的含量通过HPLC分析测定：色谱柱为C₁₈分析柱；流动相为5mM乙酸铵水溶液：乙腈(40：60，v／v)；流量为0.7ml／min；检测波长为252nm；进样量为2μL。化合物的出峰顺序依次为：吩嗪-1-羧酸(1.9min)、吩嗪-1-酰胺(2.9min)。

根据已知浓度的吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺标准样品通过上述方法测定的出峰峰面积，可得这两个物质含量的线性回归方程：

吩嗪-1-羧酸含量(毫克／升发酵液)=(实测峰面积-23.283)／68.281(R²=0.99986)

吩嗪-1-酰胺含量(毫克／升发酵液)=(实测峰面积-2.863)／54.101(R²=0.99999)

根据回归方程，可计算出未知发酵液萃取液中吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的含量。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一株高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根际假单胞菌，其特征在于，所述根际假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201CCTCC NO：M2013441。

2.一种用如权利要求1所述的根际假单胞菌制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

A、菌株发酵；

B、调节发酵液pH值为3.0～4.0，加入氯仿对发酵液进行萃取，即得所述吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺混合物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述菌株发酵具体为：接种所述菌株PA1201于LB平板上，在25～37℃下活化生长18～28小时，然后挑取所述PA1201单克隆接种于LB培养液，在25～30℃的摇床中震荡培养16～24小时，摇床转速为180～220转／分，得种子液；将所述种子液以1～5％的接种量接种于黄豆粉发酵培养液中进行放大发酵培养，在25～30℃的摇床中震荡发酵培养36～48小时，摇床转速为180～220转／分。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述LB培养液具体为，每1L培养液的制备方法包括如下步骤：取去离子水1升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克，混合，pH调节为7.0～7.4，121℃高压灭菌15分钟后，即得。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述黄豆粉发酵培养液具体为，每1L发酵培养液的制备方法包括如下步骤：取去离子水978毫升、黄豆粉65克、玉米浆16克、葡萄糖12克、无水乙醇22毫升，混合，pH调节为6.8～7.2，121℃高压灭菌15分钟后，即得。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述调节发酵液pH值采用的是5～7M的盐酸溶液。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氯仿与发酵液的体积比为3：1～4：1。

8.一种如权利要求1所述的根际假单胞菌在制备防治水稻白叶枯病农药中的用途。