CN109439561B - 一株铜绿假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物农药领域，尤其涉及一株铜绿假单胞菌及其应用，所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌2016NX1，保藏在中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC NO：15767，本发明提供的铜绿假单胞菌2016NX1能够产生1‑吩嗪氧基乙酸甲酯，该成分对多种植物病原真菌具有很好的抑制效果，抑菌谱广，繁殖快，培养条件简单，抗逆性强，易规模化生产，具有良好的开发前景。

Description

一株铜绿假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物农药领域，尤其涉及一株铜绿假单胞菌及其应 用。
背景技术
微生物农药是指微生物及其代谢产物和由它们加工而成的具有 抑制植物病害的生物活性物质，具有选择性强、广谱、抗药性低及与 环境相容性好等特点，已成为当代农业发展的必然趋势，符合人们对 绿色食品的需求，是农业可持续发展的保障；国内外已有多种微生物 农药被发现并应用，井冈霉素是目前我国应用较为广泛的一类微生物 杀菌剂，该类农药可以有效防治水稻的纹枯病，除了井冈霉素，常用 的微生物杀菌剂还有木霉菌、春雷霉素、武夷霉素、中生美素等，这 些微生物杀菌剂都是效果良好的广谱杀菌剂。
研究表明，铜绿假单胞菌可产生吩嗪-1-羧酸、藤黄绿脓菌素、硝 吡咯菌素等多种次生代谢产物，对水稻纹枯病、烟草黑胫病、杂交竹 梢枯病等多种植物病原菌具有抑制作用，因此铜绿假单胞菌是一株具 有较大开发潜力的生防细菌。
随着人们对无公害农产品以及可持续农业关注度提升，植物病害 的生物防治研究和应用迅速发展，新型微生物农药的研发及应用前景 广阔；本发明提供的一株产1-吩嗪氧基乙酸甲酯的铜绿假单胞菌 2016NX1其菌体和纯产物1-吩嗪氧基乙酸甲酯能抑制多种植物病原 菌的生长，在植物病害微生物农药防治领域添加新物质。
发明内容
为克服上述现有技术的缺陷，本发明提供一株铜绿假单胞菌及其 应用。
具体是通过以下技术方案得以实现的：。
一株铜绿假单胞菌，所述的铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌 2016NX1，保藏编号为CGMCC NO：15767。
本发明提供的铜绿假单胞菌，其分类命名为假单胞菌 (Pseudomonas sp.)，已于2018年05月16日保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京，邮编100101，保 藏号为CGMCC No.15767。
上述铜绿假单胞菌的制备方法，包括以下步骤：
a、将铜绿假单胞菌2016NX1梯度稀释后涂布牛肉膏蛋白胨固体 培养基37℃活化培养24h，取单菌落接种于种子培养基，于37℃下 振荡培养24h，摇床转速为100r/min，得种子液；
b、将所述种子液以2％的接种量接种于发酵培养基，于37℃下 振荡培养3d，摇床转速为100r/min，获得发酵液。
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基为常规牛肉膏蛋白胨固体培养基， 或者采用本发明牛肉膏蛋白胨液体培养基配方制备的牛肉膏蛋白胨 固体培养基。
所述种子培养基和发酵培养基均为牛肉膏蛋白胨液体培养基。
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方包括：牛肉膏3.0g、蛋白胨 10.0g、NaCl5.0g、水1000mL，调节pH值为7.4～7.6。
所述铜绿假单胞菌2016NX1用于生产新型微生物农药成分1-吩 嗪氧基乙酸甲酯的应用。
所述1-吩嗪氧基乙酸甲酯对病源真菌有抑制作用。
所述的病源真菌为玉米大斑病菌、茶轮斑病菌、甘蓝黑斑病菌、 甘蔗凤梨病菌、贡柑链格孢菌、辣椒炭疽病菌、水稻胡麻叶斑病菌、 烟草黑胫病菌、金橘沙皮病菌、立枯丝核菌、香蕉枯萎病菌、根异 茎点霉中任一种。
所述1-吩嗪氧基乙酸甲酯的制备，包括以下步骤：
a、将权利要求2制备的发酵液用三氯甲烷进行萃取，得萃取液；
b、将萃取液45℃旋转蒸发后，获得含1-吩嗪氧基乙酸甲酯的 蓝色混合物A；
c、将蓝色混合物A用氯仿溶解配制100mg/ml蓝色混合物溶液 B；
d、采用展开剂对蓝色混合溶液B进行分离，鉴定。
所述展开剂为氯仿：甲醇按照30：1体积比配制的混合液。
所述铜绿假单胞菌2016NX在生物防治菌剂中的应用。
所述1-吩嗪氧基乙酸甲酯，其化学结构如下：
Figure BDA0001736228420000031
本发明人在分离过程中进行深入研究，发现不同展开剂对含1- 吩嗪氧基乙酸甲酯的蓝色混合物的分离效果有所差异，因此筛选了其 中3组分离效果较优的展开剂作为对比组，V氯仿：V石油醚：V甲醇＝6:3:1，V 氯仿：V乙酸乙酯＝5：1，V氯仿：V甲醇＝30:1，分离结果为图2，从图中观察可知， V氯仿：V甲醇＝30:1的效果最好，显示为两个清晰的斑点；V氯仿： V石油醚：V甲醇＝6:3:1虽然也分离为两个斑点，但是有拖尾的现象，V氯仿：V乙酸乙酯＝5：1的两个斑点在薄层层析板上离得很近，不 易于分离，此外，还针对现有技术中的展开剂，分离效果都很差，斑 点数不明显，故不采用。
表1蓝色素薄层层析展开剂及其Rf值
Figure BDA0001736228420000041
有益效果
本发明铜绿假单胞菌2016NX1是从患有枯萎病的牛大力植物根 中分离纯化得到的一株野生型菌株；该菌株能稳定产生1--吩嗪氧基乙 酸甲酯，1-吩嗪氧基乙酸甲酯能有效抑制植物病害，即能抑制玉米大 斑病菌(Exserohilum turcicum)、茶轮斑病菌(Pestalotiopsis theae)、 甘蓝黑斑病菌(Alternaria oleracea)、甘蔗凤梨病菌(Ceratocystis paradoxa)、贡柑链格孢菌(Alternaria citri)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、水稻胡麻叶斑病菌(Cochliobolus miyabeanus)、烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.Nicotianae)、 金橘沙皮病菌(Diaporthe citri)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、 香蕉枯萎病菌(Fusarium spp.)、根异茎点霉(Paraphoma radicina)12 种植物病原真菌的生长；该菌株的发酵代谢产物制备能够有效控制植 物病原真菌的微生物农药。
本发明的一株产新型微生物农药成分——1-吩嗪氧基乙酸甲酯 的菌株铜绿假单胞菌2016NX1作为生物防治菌剂的菌种。
本发明提供的产生物农药新成分——1-吩嗪氧基乙酸甲酯的菌 株铜绿假单胞菌2016NX1对多种植物病原真菌具有很好的抑制效果， 抑菌谱广，繁殖快，培养条件简单，抗逆性强，易规模化生产，具有 良好的开发前景。
附图说明
图1为含1-吩嗪氧基乙酸甲酯的蓝色混合物图；
图2为本发明V氯仿：V甲醇＝30:1作为展开剂对含1-吩嗪氧基乙酸 甲酯的蓝色混合物的分离效果图；
图3为通过硅胶柱层析分离洗脱出的两种不同组分的化物；Z1为 黄色物质，Z2为蓝色物质；
图4为Z1黄色物质的高效液相质谱图；
图5为Z2蓝色物质的高效液相质谱图；
图6为Z1黄色物质的1H-NMR图谱；
图7为Z1黄色物质的13C-NMR图谱；
图8为Z1黄色物质的13C NMR DEPT-90图谱；
图9为Z1黄色物质的13C NMR DEPT-135图谱；
图10为铜绿假单胞菌2016NX1产的1-吩嗪氧基乙酸甲酯对12种病 原真菌的抑制效果图；
具体实施方式
实施例1
铜绿假单胞菌2016NX1的制备，包括以下步骤：
a、将铜绿假单胞菌2016NX1梯度稀释后涂布牛肉膏蛋白胨固体 培养基37℃活化培养24h，取单菌落接种于种子培养基，于37℃下 振荡培养24h，摇床转速为100r/min，得种子液；
b、将所述种子液以2％的接种量接种于发酵培养基，于37℃下振 荡培养3d，摇床转速为100r/min，获得发酵液。
所述种子培养基和发酵培养基均为牛肉膏蛋白胨液体培养基。
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方包括：牛肉膏3.0g、蛋白胨 10.0g、NaCl5.0g、水1000mL，调节pH值为7.4。
所述牛肉膏蛋白胨液体经过121℃高压灭菌处理20min。
实施例2
铜绿假单胞菌2016NX1的制备，包括以下步骤：
a、将铜绿假单胞菌2016NX1梯度稀释后涂布牛肉膏蛋白胨固体 培养基37℃活化培养24h，取单菌落接种于种子培养基，于37℃下 振荡培养24h，摇床转速为100r/min，得种子液；
b、将所述种子液以2％的接种量接种于发酵培养基，于37℃下振 荡培养3d，摇床转速为100r/min，获得发酵液。
所述种子培养基和发酵培养基均为牛肉膏蛋白胨液体培养基。
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方包括：牛肉膏3.0g、蛋白胨 10.0g、NaCl5.0g、水1000mL，调节pH值为7.6。
所述牛肉膏蛋白胨液体经过121℃高压灭菌处理20min。
实施例3
铜绿假单胞菌2016NX1的制备，包括以下步骤：
a、将铜绿假单胞菌2016NX1梯度稀释后涂布牛肉膏蛋白胨固体 培养基37℃活化培养24h，取单菌落接种于种子培养基，于37℃下 振荡培养24h，摇床转速为100r/min，得种子液；
b、将所述种子液以2％的接种量接种于发酵培养基，于37℃下振 荡培养3d，摇床转速为100r/min，获得发酵液。
所述种子培养基和发酵培养基均为牛肉膏蛋白胨液体培养基。
所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方包括：牛肉膏3.0g、蛋白胨 10.0g、NaCl5.0g、水1000mL，调节pH值为7.5。
所述牛肉膏蛋白胨液体经过121℃高压灭菌处理20min。
实施例4
铜绿假单胞菌2016NX1产1-吩嗪氧基乙酸甲酯的制备，包括以下 步骤：
a、将权利要求2制备的发酵液用三氯甲烷进行萃取，得萃取液；
b、将萃取液45℃旋转蒸发后，获得含1-吩嗪氧基乙酸甲酯的蓝 色混合物A；
c、将蓝色混合物A用氯仿溶解配制100mg/ml蓝色混合物溶液 B；
d、采用展开剂对蓝色混合溶液B进行分离，鉴定。
上述操作具体为：
(1)用三氯甲烷充分萃取发酵液，得萃取液；
(2)将萃取液45℃旋转蒸发后，获得含1-吩嗪氧基乙酸甲酯的 蓝色混合物；
(3)称量，以氯仿溶解配制100mg/ml蓝色混合物溶液；
(4)称取40g 200-300目硅胶，加等体积氯仿充分搅拌成匀浆备 用，先加少量氯仿于柱中，再充柱，待氯仿充分平衡后，将100mg/ml 蓝色混合物溶液上样分离(洗脱剂为V氯仿：V甲醇＝30:1)，收集不同色 带的组分(每30ml收集一馏分)；
(5)鉴定：
a、对上述组分进行薄层层析检测，如果组分有完全相同Rf值的 点则合并，得到分离条件下的蓝色混合物溶液分离后的分离化合物； 图3显示的是通过硅胶柱层析分离洗脱出的两种不同组分的分离化合 物，Z1为黄色物质，Z2为蓝色物质，Z1黄色物质比例大(为蓝色混 合物的30-40％)且干燥后呈粉末壮，不吸水，再进行薄层层析检测时 只呈现一个斑点，可知Z1黄色物质纯度较高，故将Z1可进行纯度检 测以及结构分析；
b、将柱层析分离到的Z1黄色物质组分和1-羧酸-吩嗪标准品分 别高效液色谱分析，结果如图4(Z1黄色物质组分)、图5(1-羧酸- 吩嗪标准品)所示，可见黄色物质组分Z1并非是1-羧酸-吩嗪，需进 一步确定其物质结构；图4显示两个峰，说明Z1黄色物质尚存在杂质， 通过制备型高效液相色谱仪制备，获得纯化合物Z1，再质谱及核磁共 振谱分析；
c、黄色物质Z1的质谱图如图5，从图5中可知，离子峰多且杂， 可能样品中还含有杂质，不能确定Z1的准确分子质量，其核磁共振检 测结果如图6(黄色物质Z1的1H-NMR图谱)、图7(黄色物质Z1的 13C-NMR图谱)、图8(黄色物质Z1的13C NMR DEPT-90图谱)、图9(黄色物质Z1的13C NMR DEPT-135图谱)所示；
d、分析表明，1H-NMR图谱中化学位移在7.6～7.9和8.2～8.4之 间是含有苯环的特征；化学位移在7.23左右有个大的单峰出现，可能 是苯环上连有NH2；13C-NMR图谱中显示12个芳香碳，且化学位移 与1-羧酸-吩嗪的结构数据相似，说明黄色物质Z1是吩嗪类化合物； 从1H-NMR中可以看到7个芳香氢，且都不呈单峰，说明该样品为1- 单取代的吩嗪类化合物；结合1H-NMR中化学位移在3.85和13C-NMR 中化学位移在52.41的信号峰可知有甲氧基的存在；综上推断，该样 品为是含芳香环、-NH2、甲氧基等结构的吩嗪类化合物，即1-吩嗪氧 基乙酸甲酯，分子式为C15N2O3H12，其化学结构如下：
Figure BDA0001736228420000091
Z1黄色物质比例大(为蓝色混合物的30-40％)且干燥后呈粉末 壮，不吸水，再进行薄层层析检测时只呈现一个斑点，可知Z1黄色物 质纯度较高，故将Z1可进行纯度检测以及结构分析。
实施例1
铜绿假单胞菌2016NX1产的1-吩嗪氧基乙酸甲酯对12种病原真 菌的抑制作用：
(1)PDA培养基：
马铃薯葡萄糖液体培养基：称取200g去皮马铃薯，切成小块，加 适量水煮沸30min，冷却后纱布过滤；在滤液中加入葡萄糖20g完全溶 解，定容至1L，121℃高压灭菌20min。固体培养基者为液体培养基 加入20g琼脂粉；
采用菌丝生长速率法测定1-吩嗪氧基乙酸甲酯对12种病原真菌 的抑制作用。在每一个培养皿中，将0.5mL配制好的1-吩嗪氧基乙酸 甲酯溶液(将干燥后的1-吩嗪氧基乙酸甲酯以甲醇配制成2g/L的储备 液，0.22μm除菌滤膜过滤备用)在与20mL热熔PDA固体培养基在 其冷凝前均匀混合，制成终浓度为0.05g/L的带药平板；对照组为加 入等体积甲醇；在带药平板中央接种直径为5mm的病原真菌菌饼，每 个处理设置3组重复，在28℃恒温培养5天后，采用十字交叉法测定对 照及处理的菌落直径，计算抑菌率。
Figure BDA0001736228420000092
结果表明:菌株2016NX1产的1-吩嗪氧基乙酸甲酯对玉米大斑病 菌(Exserohilumturcicum)、茶轮斑病菌(Pestalotiopsis theae)、甘 蓝黑斑病菌(Alternariaoleracea)、甘蔗凤梨病菌(Ceratocystis paradoxa)、贡柑链格孢菌(Alternaria citri)、辣椒炭疽病菌 (Colletotrichum capsici)、水稻胡麻叶斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)、烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.Nicotianae)、 金橘沙皮病菌(Diaporthe citri)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、 香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、根异茎点霉(Paraphoma radicina)12种病原真菌均有抑制作用，结果见图10，抑菌率如表2。
表2浓度为0.05g/L时1-吩嗪氧基乙酸甲酯对12种植物病原真 菌的抑菌率
Figure BDA0001736228420000101
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技 术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进 一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的 发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

Claims (10)

1.一株铜绿假单胞菌，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌2016NX1，保藏编号为CGMCCNO：15767。
2.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、将铜绿假单胞菌2016NX1梯度稀释后涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基37℃活化培养24h，取单菌落接种于种子培养基，于37℃下振荡培养24h，摇床转速为100r/min，得种子液；b、将所述种子液以2％的接种量接种于发酵培养基，于37℃下振荡培养3d，摇床转速为100r/min，获得发酵液。
3.如权利要求2所述的铜绿假单胞菌的制备方法，其特征在于，所述种子培养基和发酵培养基均为牛肉膏蛋白胨液体培养基。
4.如权利要求3所述的铜绿假单胞菌的制备方法，其特征在于，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方包括：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、水1000mL，调节pH值为7.4～7.6。
5.如权利要求1所述铜绿假单胞菌2016NX1或权利要求2～4任一项所述方法制备的铜绿假单胞菌2016NX1用于生产微生物农药成分1-吩嗪氧基乙酸甲酯的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述1-吩嗪氧基乙酸甲酯对病源真菌有抑制作用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的病源真菌为玉米大斑病菌、茶轮斑病菌、甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌、贡柑链格孢菌、辣椒炭疽病菌、水稻胡麻叶斑病菌、烟草黑胫病菌、金橘沙皮病菌、立枯丝核菌、香蕉枯萎病菌、根异茎点霉中任一种。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述1-吩嗪氧基乙酸甲酯的制备，包括以下步骤：a、将权利要求2制备的发酵液用三氯甲烷进行萃取，得萃取液；b、将萃取液45℃旋转蒸发后，获得含1-吩嗪氧基乙酸甲酯的蓝色混合物A；c、将蓝色混合物A用氯仿溶解配制100mg/ml蓝色混合物溶液B；d、采用展开剂对蓝色混合溶液B进行分离，鉴定。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述展开剂为氯仿：甲醇按照30：1体积比配制的混合液。
10.如权利要求1所述铜绿假单胞菌2016NX1在生物防治菌剂中的应用。
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