CN108353906A

CN108353906A - 吲哚-3-甲醛及其衍生物在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用

Info

Publication number: CN108353906A
Application number: CN201810019919.3A
Authority: CN
Inventors: 张炼辉; 刘诗胤; 周佳暖; 贺飞; 林诺翘
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-01-09
Filing date: 2018-01-09
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2038-01-09
Also published as: CN108353906B

Abstract

本发明公开了吲哚‑3‑甲醛及其衍生物在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用。本发明提供了吲哚‑3‑甲醛或其衍生物或其药学上可接受的盐在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用，或在制备防治由植物病原真菌引起的植物病害的农药或生防制剂中的应用。本发明通过抑菌活性测定，证明了吲哚‑3‑甲醛及其衍生物对植物病原真菌具有良好的抑制活性，其对植物病原真菌的生长以及有性配合具有较好的抑制效果，可阻断双核菌丝体的形成，使植物病原真菌不能正常侵染植物，从而有效抑制植物真菌病害的发生，为绿色防控由植物病原真菌引起的植物病害提供了借鉴，其应用前景广阔。

Description

吲哚-3-甲醛及其衍生物在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及吲哚-3-甲醛及其衍生物在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用。

背景技术

吲哚-3-甲醛是一种重要的医药中间体，主要用于制取吲哚衍生物。吲哚类化合物是一类重要的杂环化合物，具有广泛的生物活性。十字花科蔬菜中及大量海洋生物和放线菌中广泛存在着吲哚类次生代谢产物。近年来，其在抗癌方面的活性引起了人们的普遍关注。目前，SU11248(商品名：舒尼替尼)、长春碱(VLB，Vinblastine)、长春新碱(VCR，Vincristine)、长春地辛(VDS，Vindesine)、长春瑞滨(VBR，Vinorelbine)、靛玉红等少量含吲哚结构的品种已上市投入使用，毒副作用小和选择性强等特点已凸现出吲哚类抗癌化合物的特殊效果。

甘蔗黑穗病(Sugarcane smut)是由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)侵染引起的真菌性病害，是影响甘蔗经济和生产安全的世界性重要病害之一，严重制约着甘蔗产业的健康发展。我国是甘蔗种植大国，主要分布在广东、广西、云南、海南、福建、四川和台湾等地区。由于栽培品种单一化，随着甘蔗黑穗病的发生与流行，甘蔗鞭黑粉菌生理小种不断地变化，使得我国甘蔗种植区域均有该病报道，且发病愈加严重，严重影响我国甘蔗产业的发展，每年因甘蔗黑穗病造成的直接经济损失达50亿元。该病防治难度大，尚未有直接作用于田间的化学药剂。

甘黑鞭黑粉菌是两型真菌，也属于半专性寄生菌，单倍体可以在人工培养上生长，菌丝体在培养基不能存活太久，具有其它黑粉菌相似的生活史，冬孢子萌发产生单倍体孢子，单倍体通过芽殖繁殖，菌落呈酵母状孢子成雪茄状，不具致病性。甘蔗鞭黑粉菌通过残存在田间的冬孢子作为初侵染源侵染甘蔗，冬孢子在萌发过程中分化成“+”、“-”两种交配型的担孢子，只有当两者有性配合形成双核菌丝体后才能侵染甘蔗，引发黑穗病，发病的甘蔗将毫无价值，且污染环境，同时释放大量的冬孢子作为再侵染源和次年的初侵染源。由此可看出有效的阻止甘蔗黑穗病的发生，最佳的方法是破坏不同遗传交配型进行有性配合产生具有致病力的双核菌丝。

近年来，有部分关于甘蔗黑穗病生物防治的报道，但是近些年大面积长期重复性地使用作用机制相同的杀菌剂，很容易使甘蔗黑穗病产生抗药性，从而引起防效下降，甚至完全无效，给甘蔗生产造成重大的经济损失。因此，新药剂的筛选和研制具有重要的意义，在生产上应交替施用不同作用机制的杀菌剂，以延缓病原菌抗药性的出现。

目前，国内外尚无吲哚-3-甲醛对植物病原真菌具有抑制作用的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供吲哚-3-甲醛及其衍生物在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用。本发明通过抑菌活性测定，证明了吲哚-3-甲醛及其衍生物对植物病原真菌具有良好的抑制活性，其在0.2mM的浓度下就能抑制甘蔗鞭黑粉菌的有性配合，可作为新型生防药剂用于黑粉病的防控。

本发明的目的是提供吲哚-3-甲醛及其衍生物在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用。

本发明的另一目的是提供一种植物病原真菌的杀菌剂或有性配合抑制剂。

本发明的再一目的是提供一种吲哚-3-甲醛的生产方法。

本发明的再一目的是提供来源于假单胞菌的发酵液提取物在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明涉及吲哚-3-甲醛或其衍生物或其药学上可接受的盐在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用，或在制备防治由植物病原真菌引起的植物病害的农药或生防制剂中的应用。

本发明通过抑菌活性测定，证明了吲哚-3-甲醛及其衍生物对植物病原真菌具有良好的抑制活性，其对黑粉菌(包括甘蔗鞭黑粉菌和玉米瘤黑粉菌)的最低抑菌浓度(MIC)为2mM；同时，可作为植物病原真菌的有性配合抑制剂，抑制植物病原真菌的有性配合过程，平板使用MIC值为1mM。吲哚-3-甲醛及其衍生物可作为农药或生防制剂，其高效、低毒，适合于植物病害化学防治的要求。

优选地，所述的植物病原真菌为异宗配合型真菌；所述的植物病害为甘蔗黑穗病、玉米瘤黑粉病、疫霉病、霜疫霉病、稻瘟病、锈病等其他经异宗配合的真菌病害。

进一步优选地，所述的异宗配合型真菌为黑粉菌。

更进一步优选地，所述的黑粉菌为甘蔗鞭黑粉菌、玉米瘤黑粉菌、小麦印度腥黑粉菌、小麦网腥黑穗粉菌或高粱黑粉菌等。实验发现，吲哚-3-甲醛对甘蔗鞭黑粉菌、玉米瘤黑粉菌等多种黑粉菌具有优异的抑菌活性。

优选地，所述植物包括但不限于甘蔗、玉米、高粱、水稻、小麦、花生或荔枝等。

优选地，应用于抑制植物病原真菌的有性配合。

更优选地，吲哚-3-甲醛抑制植物病原真菌的有性配合的最低使用浓度为1mM。当吲哚-3-甲醛的浓度为0.5mM时，甘蔗鞭黑粉菌仍能配合形成双核菌丝体，但其形成菌丝的时间有所延长，菌丝数量很少；当其浓度为1mM时，黑粉菌完全保持细菌状，无菌丝产生。

优选地，应用于抑制植物病原真菌的生长。

优选地，吲哚-3-甲醛抑制植物病原真菌生长的最低使用浓度为2mM。当吲哚-3-甲醛的浓度≥2mM时，黑粉菌不能正常生长；田间使用浓度为3mM，其生防效果达94.44％。

优选地，所述衍生物包括吲哚、1-甲基吲哚-3-甲醛、3-氰基吲哚、吲哚-3-羧酸、3-甲基吲哚、3-吲哚乙腈、3-吲哚丁酸、3-吲哚甲醇、吲哚-2-甲醛、吲哚-5-甲醛、吲哚-6-甲醛、吲哚-7-甲醛、5-氯吲哚-3-甲醛、3,3'-亚甲基二吲哚。

本发明还提供了一种植物病原真菌的杀菌剂和有性配合抑制剂，含有吲哚-3-甲醛或其衍生物或其药学上可接受的盐。

优选地，所述的植物病原真菌为异宗配合型真菌。

进一步优选地，所述异宗配合型真菌为黑粉菌。

更进一步优选地，所述黑粉菌为甘蔗鞭黑粉菌、玉米瘤黑粉菌、小麦印度腥黑粉菌、小麦网腥黑穗粉菌或高粱黑粉菌等。

本发明还提供了一种吲哚-3-甲醛的生产方法，主要包括以下步骤：

S1.采用固体发酵方式，将假单胞菌接种于PDA培养基上，在26～30℃培养36～60h后擦去菌落，获得发酵培养基；

S2.将上述发酵培养基切成小块后浸泡于2～3倍体积的由乙酸乙酯、甲醇和冰醋酸组成的混合溶液中，过滤收集上清液，减压浓缩后去除上清液中的有机溶剂，用2～3倍体积的乙酸乙酯萃取水相溶液2～3次，得到发酵液提取物；

S3.将S2所得发酵液提取物经层析分离得到吲哚-3-甲醛；所述层析分离方法包括硅胶柱层析、中压液相色谱分离、分析型高效液相色谱分离或半制备型高效液相色谱分离。

该方法操作简单快速，根据有机溶剂的极性有效的分离不同极性的化合物，能提高化合物的分离效率。

优选地，所述假单胞菌为假单胞菌ST4，该菌株已于2015年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015526，保藏地址为中国武汉。

优选地，步骤S1中PDA培养基的配方(1L)为：200g去皮马铃薯切小块煮沸30min后过滤，滤液加入20g葡萄糖和18g琼脂粉。

优选地，步骤S2中乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸的体积比为80：15：5。

具体优选地，所述吲哚-3-甲醛的生产方法，主要包括以下步骤：

S1.将过夜培养的假单胞菌ST4菌液接种于PDA培养基，28℃培养48h后用灭菌纱布擦去菌落，获得发酵培养基；

S2.将发酵培养基切成小块后浸泡于3倍体积的由乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸按80：15：5的体积比组成的混合溶液中，震荡2h后过滤收集上清液；减压浓缩去除上清液中的乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂，留水相溶液；用3倍体积的乙酸乙酯萃取水相溶液3次，分别收集水相和有机相，得到发酵液提取物；

S3.将S2所得发酵液提取物经Claricep FlashSilica(CS)标准硅胶柱层析分离、布奇中压分离仪分离、高效液相色谱分离和HPLC半制备得到吲哚-3-甲醛。

优选地，步骤S1中过夜培养时采用LB液体培养基，培养基配方为(1L)：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g。

优选地，步骤S3中所述Claricep FlashSilica(CS)标准硅胶柱为Agela生物技术公司生产的含60目的正向硅120g，可耐受压力为180psi；固定相硅胶60～100目，流动相为以不同比例(100:0、99:1、98:2、95:5、9:1、8:2、1:100)混合的氯仿与甲醇的混合液。

优选地，步骤S3中所述HPLC半制备的方法，主要包括如下步骤：

S11.将待制备的样品溶于甲醇，浓度为50～100mg/mL，过滤杂质后装于样品瓶，进样量为50～100μL，洗脱液为乙腈和超纯水的混合液，洗脱液流速为3mL/min；其中HPLC半制备的洗脱方法为：0～30min，乙腈的浓度由5％～100％梯度洗脱色谱柱；30～35min，100％乙腈冲洗色谱柱；35～40min，5％乙腈平衡色谱柱；

S12.按照制备时间与色谱图效果分批次收集混合液，将各组分蒸干，称重，溶于适量的甲醇后分别用HPLC和TLC分析分离效果，同时检测各组分的抑菌活性；

其中，对HPLC和TLC分析显示为单一物质且具有抑菌活性的组分，进行再蒸干，称重后分别溶解于甲醇和氘代甲醇溶液，用于LC-MS和核磁共振色谱进行分析；对有活性，但HPLC和TLC分析物质较多的组分，进行HPLC再制备，直到为组分单一为止。

本发明对组分单一的活性物质进行进一步的核磁共振(NMR)和质谱(MS)分析，具体方法如下：

S21：对HPLC色谱峰单一和TLC板上仅一个点的组分蒸干后，用适量的氘代甲醇溶解，装于核磁管，封口后进行核磁共振谱分析，然后根据核磁共振分析结果确定分离物质可能存在的结构，结合质谱分析确定分子结构；其中，所述分析方法包括核磁共振氢谱1HNMR，核磁共振碳谱13C NMR，核磁碳谱dept135谱、dept90谱，二维核谱(COSY、QC、BC)；

S22：将分离纯化后的物质溶于适量甲醇后，用质谱仪检测分离物质的分子量和可能的化学结构，根据质谱分析结果确定分离物质的分子量，结合核磁共振谱图确定物质的分子结构。

优选地，步骤S21所述1HNMR和13C NMR采用Bruker Avance III 600在600MHz下进行分析。

优选地，步骤S22所述MS分析仪为Bruker maXis impact。

本发明还提供了一种假单胞菌ST4的发酵液提取物，含有吲哚-3-甲醛，由上述的生产方法中步骤S1、步骤S2得到。

另外，上述的发酵液提取物在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用，或在制备防治由植物病原真菌引起的植物病害的农药或生防制剂中的应用，也在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明所述的吲哚-3-甲醛或其衍生物或其药学上可接受的盐在防治由植物病原真菌引起的植物病害中具有重要用途，其对植物病原真菌的生长以及有性配合具有较好的抑制效果，可阻断双核菌丝体的形成，使植物病原真菌不能正常侵染植物，从而有效抑制植物真菌病害的发生；尤其可以抑制甘黑鞭黑粉菌有性配合菌丝生长及抑制甘黑鞭黑粉菌的生长，从而有效防治甘蔗黑穗病，为防控由植物病原真菌引起的甘蔗黑穗病等植物病害提供了绿色安全的农药。

2、吲哚-3-甲醛是一种无污染且对环境友好的小分子化合物，并且其对非靶标生物及人畜安全、病原菌对其抗药性差，能够保证农产品的高品质，符合可持续发展的要求，其研究和市场应用前景广阔。

3、本发明提供了一种固体发酵提取生防菌有效代谢产物的方法，为获取有效活性物质效率较低的生防菌提供了很好的借鉴。

附图说明

图1为菌株ST4代谢物4个馏分(ST4-1～ST4-4)的TLC和抑菌活性分析。A为ST4代谢物4个馏分ST4-1～ST4-4的TLC分析；每组分均溶于甲醇，终浓度为50mg/mL，各取0.5μL点在TLC平板，将硅胶板置于含少量展开剂(氯仿：甲醇＝9：1)的染色缸，展开剂略低于点样位置，上行法展开，展开后于紫外灯下观察条带分离情况，再用10％硫酸乙醇侵泡和高温显色；B为ST4代谢物4个馏分ST4-1～ST4-4的抑菌活性分析；0.5μL的MAT-1和MAT-2混合液(OD₆₀₀≈1.5)点在PDA琼脂条上，一端放上浸了馏分的无菌滤纸，平板于28℃培养两天后观察菌丝生长状况。

图2为活性组分ST4-2分离出的9个组分ST4-2-1～ST4-2-9的HPLC、TLC和抑菌活性分析。A为ST4-2的9个组分ST4-2-1～ST4-2-9的HPLC图谱，紫外吸收为λ＝254nm。B为ST4-2的9个组分ST4-2-1～ST4-2-9的TLC分析。C为ST4-2的9个组分ST4-2-1～ST4-2-9的抑菌活性分析。

图3为单一活性组分ST4-2-8与标准样吲哚-3-甲醛的HPLC图谱。

图4为化合物吲哚-3-甲醛对甘蔗鞭黑粉菌的抑菌效果。

图5为生防菌ST4及化合物吲哚-3-甲醛对玉米瘤黑粉病的防治效果。b为混合接种U9(玉米黑粉菌“+”型孢子)+U10(玉米黑粉菌“-”型孢子)和3mM吲哚-3-甲醛；c为ST4培养液(OD₆₀₀＝0.5)加2％葡萄糖；d为ST4培养液(OD₆₀₀＝0.5)；e为接种YePS培养基；f为接种U9+U10。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1假单胞菌ST4代谢物的提取及其生物活性的检测

1、菌株ST4代谢物的提取

(1)将过夜培养的ST4菌液接种于PDA平板上(13×13cm)，28℃培养48h后用灭菌纱布擦去菌落，获得发酵培养基；

(2)将发酵培养基切成小块后浸泡于3倍体积的由乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸按80：15：5的体积比组成混合溶液中，震荡2h后过滤收集上清液；用旋转蒸发仪将上清液中的乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂去除，留水相溶液；

(3)用3倍体积的乙酸乙酯萃取水相溶液3次，分别收集水相和有机相，将有机相使用旋转蒸发仪蒸干，浓缩温度为45℃，称取重量后，取少量乙酸乙酯萃取物溶解于适量的甲醇中，用于检测其抑菌活性；水相则用3倍体积的正丁醇萃取3次，分别收集水相和正丁醇相，正丁醇相旋转蒸干后称取重量，溶于适量的甲醇，用于检测正丁醇萃取物对甘蔗鞭黑粉菌有性配合的抑制作用。

2、活性物质的检测：

(1)准备0.6×0.6cm(或0.6cm直径)大小的无菌滤纸片，将PDA平板切成0.8cm宽、6cm长的条带，一端放置无菌滤纸片并吸取100μL检测液，待滤纸片晾干后，将MAT-1和MAT-2混合菌液均匀地点至PDA条带上，并于28℃培养至空白对照组产生白色绒毛状菌丝后，记录不同检测物对甘蔗黑粉菌有性配合的抑制情况。

(2)为获得足够多的粗提物用于后续活性物质分离，本发明共获得20L生防菌ST4的培养物。乙酸乙酯萃取获得38.82g粗体物，正丁醇萃取获得12.51g粗提物。取少量乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物溶于适量的甲醇，分别配成浓度为50mg/mL的溶液，并检测其对甘蔗鞭黑粉菌的影响。

3、检测结果

(1)抑菌试验结果发现，含正丁醇萃取物的滤纸片中，甘蔗鞭黑粉菌的菌丝也能生长，但长势较弱于空白处理；而含乙酸乙酯萃取物的条带，靠近滤纸片的甘蔗鞭黑粉菌均保持为细菌状，不能形成白色菌丝，而且越靠近滤纸片的菌落密度越低。

(2)上述实验结果说明，乙酸乙酯萃取物中不仅含有抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的活性物质，可能也含有某些抑制甘蔗鞭黑粉菌正常生长的物质，而正丁醇提取物中不含或仅有很少量的活性物质。因此，将乙酸乙酯萃取物(ST4)用于后续活性物质的分离。

实施例2假单胞菌ST4有效活性物质的分离纯化

1、分离纯化方法

将实施例1所得的乙酸乙酯萃取物依次经Claricep FlashSilica(CS)标准硅胶柱层析分离、布奇中压分离仪分离、高效液相色谱分离和HPLC半制备等分离，具体方法如下：

(1)标准硅胶柱层析分离：

1)上样：每次准确称取假单胞菌ST4的乙酸乙酯萃取物5～6g，用适量的甲醇溶解，加入2倍的60～100目硅胶，充分搅拌均匀，风干甲醇后，将含样品的硅胶加入至样品柱中，与Claricep FlashSilica(CS)标准硅胶柱相连接，同时与布奇中压分离仪和分析级甲醇和氯仿相连，检查各连接处是否正常；

2)分离：利用布奇中压分离仪在18psi压力下将氯仿和甲醇按以下比例混合后洗脱样品，洗脱液依次为氯仿：甲醇＝100：0、99：1、98：2、95：5、9：1、8：2和0：100，洗脱流速为30mL/min，每个梯度洗脱10min，按每梯度洗脱300mL洗脱液分步收集；

3)收集：用旋转蒸发仪分别将收集的洗脱液蒸干，称取重量，并将分离物用适量的甲醇溶解，分别使用高效液相色谱(HPLC)和薄层层析法(TLC)分析不同洗脱液分离情况，同时，使用平板对峙试验检测不同组分对甘蔗鞭黑粉菌有性配合的抑制效果。

(2)高效液相色谱分离：高效液相色谱仪为安捷伦1260，紫外检测波长为202、210、230、254和280nm，色谱柱为C18分析柱和C18半制备柱，流动相为乙腈和超纯水。分析方法为：

1)将步骤(1)的溶于甲醇的样品定容至10～50mg/mL，过滤杂质后装于样品瓶，样品进样2μL，洗脱液为乙腈和超纯水的混合液，洗脱液流速为1mL/min；

2)HPLC洗脱条件为0～30min，乙腈的浓度由5％～100％梯度洗脱色谱柱；30～35min，100％乙腈冲洗色谱柱；35～40min，5％乙腈平衡色谱柱；

3)观察色谱图，分析不同组分的分离效果。

(3)高效液相色谱半制备：

1)将步骤(2)的待制备样品溶于甲醇，浓度为50～100mg/mL，过滤杂质后装于样品瓶，样品进样50～100μL，洗脱液为乙腈和超纯水的混合液，洗脱液流速为3mL/min。HPLC条件为0～30min，乙腈的浓度由5％～100％梯度洗脱色谱柱；30～35min，100％乙腈冲洗色谱柱；35～40min，5％乙腈平衡色谱柱；

2)按照制备时间与色谱图效果分批次收集混合液，用旋转蒸发仪将各组分蒸干，称重，溶于适量的甲醇后分别用HPLC和TLC分析分离效果，同时检测各组分的抑菌活性；

3)对HPLC和TLC分析显示为单一物质，且具有抑菌活性的组分再蒸干，称重后分别溶于甲醇和氘代甲醇用于LC～MS和核磁共振色谱分析；对有活性，但HPLC和TLC分析物质较多的组分进行HPLC再制备，至组分单一为止。

(4)TLC分析：经硅胶分离和HPLC制备的各部分样品的TLC分析，可以直观的观察所分离组分的纯度。TLC硅胶板为购买的铝制硅胶板，展开剂为氯仿和甲醇(9：1)混合液，显示剂为10％的硫酸乙醇。具体方法为：

1)将铝制硅胶板按样品数量切割成合适大小的硅胶板块，用甲醇溶液配制样品浓度为10～50mg/mL，铅笔标记每个样品的点样位置和样品名称，使用毛细血管吸取少量样品点于对应位置；

2)将硅胶板置于含少量展开剂的染色缸，展开剂略低于点样位置，上行法展开，展开后于紫外灯下观察条带分离情况，再用10％硫酸乙醇侵泡和高温显色，通过紫外灯和显示观察不同样品的物质纯度和分离情况。

2、分离纯化结果

(1)根据TLC结果合并获得粗提物组分4份，分别为0.0821g的ST4-1、0.7328g的ST4-2、2.1634g的ST4-3和12.3515g的ST4-4，并对这4份分离物进行TLC分析和活性鉴定(图1)。从图1可知，ST4-1中含有抑制甘蔗鞭黑粉菌有性孢子生长的物质，抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的主要物质在ST4-2和ST4-3中，由于两者的TLC分析相差显著，说明ST4的代谢物中可能存在多种抑制甘蔗鞭黑粉菌的物质，其中可能包含抑制细胞生长和细胞有性配合的物质。TLC分析表明，ST4-2条带简单，极性适中，ST4-3极性较大且TLC条带模糊，存在物质比较复杂。因此，使用ST4-2进行HPLC半制备分离。

(2)ST4-2的HPLC分析显示(图2A)，ST4-2结合紫外吸收峰和分离时间分别收集了9份样品，分别为ST4-2-1收集时间0～8.6min，74.4mg；ST4-2-2收集时间8.6～9.4min，18.6mg，ST4-2-3收集时间9.4～10min，35.7mg；ST4-2-4收集时间10～11.5min，6.6mg；ST4-2-5收集时间11.5～18.6min，37mg；ST4-2-6收集时间18.6～20min，9.1mg；ST4-2-7收集时间20～23.4min，36.8mg；ST4-2-8收集时间23.4～24.5min，6.9mg；ST4-2-9收集时间24.5～40min，307.5mg。

(3)TLC分析显示(图2B)，ST4-2的HPLC分离组分中，ST4-2-6和ST4-2-8只含一个条带，纯度较高，显示为只含一个化合物的可能，而其他组分仍为混合物，需调整条件继续分离。各分离组分活性分析表明(图2C)，ST4-2的多个分离组分对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用，其中ST4-2-4和ST4-2-6抑制甘蔗鞭黑粉菌生长比较明显，近滤纸的甘蔗鞭黑粉菌菌落生长较弱甚至无生长迹象；ST4-2-8在抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的同时也能抑制菌落的生长；ST4-2-7显著的抑制甘蔗鞭黑粉菌的有性配合，且菌落生长较好；其他部分对甘蔗鞭黑粉菌抑制作用不明显。

由此可知，生防菌假单胞菌ST4对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用是多方面的，所产生的抑菌活性物质不是单一的而是多种物质混合作用，其活性物质既有抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的发生，也有抑制甘蔗鞭黑粉菌生长。这对生防菌ST4抑制甘蔗鞭黑粉菌提供了多种措施，更有利于田间对甘蔗黑穗病的防治。

实施例3化合物ST4-2-8的分子式和结构鉴定

1、结构鉴定：对实施例2获得ST4-2-8进行NMR和LC-MS分析，鉴定其化学结构。

2、鉴定结果：

ST4-2-8的NMR分析表明，该化合物包含有9个碳，7个H，1个N和1个O原子，包含一个苯环和吡咯环的并联结构，在苯并吡咯的3号位包含一个醛基，可能的结构为吲哚-3-甲醛；LC-MS分析该物质的分子量为146.15，与吲哚-3-甲醛一致；通过与成品的HPLC分析显示(图3)，ST4-2-8与吲哚-3-甲醛的保留时间均为8.255min，峰型和三维结构完全一致，因此，将ST4-2-8鉴定为吲哚-3-甲醛。

实施例4吲哚-3-甲醛对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果

1、试验药品

通过对ST4代谢产物的分离，确定了化合物ST4-2-8的结构。活性分析发现，ST4-2-8(吲哚-3-甲醛)为既能抑制甘蔗鞭黑粉菌的有性配合，又能抑制甘蔗鞭黑粉菌的生长。从上海阿拉丁生化科技股份有限公司购买纯品，来验证该化合物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。

2、抑菌效果

如图4所示，结果表明，吲哚-3-甲醛的浓度为0.5mM时，开始对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用，甘蔗黑粉菌仍能配合形成双核菌丝体，但其形成菌丝的时间有所延长，菌丝的数量很少；其浓度为1mM时，甘蔗鞭黑粉菌完全保持细菌状，无菌丝产生；但当吲哚-3-甲醛的浓度达到2mM时，甘蔗鞭黑粉菌不能正常生长。说明吲哚-3-甲醛低浓度(＜2mM，尤其是0.5～1mM)时抑制甘蔗鞭黑粉菌的有性配合，高浓度时(≥2mM)抑制甘蔗鞭黑粉菌的生长。

实施例5吲哚-3-甲醛对玉米瘤黑粉病的防治效果

1、试验方法

(1)玉米种植：玉米种子为华南农业大学园艺学院培育的糯性玉米，购买于当地种业公司。用清水浸泡适量的玉米种子24h后，将玉米种子均匀种植于30×50cm的育苗盘中，播种14d待玉米株高15cm左右，选取长势均匀的玉米幼苗接种不同处理液。

(2)玉米接种：使用无菌注射器吸取0.5mL不同处理液注射于玉米基部离地面约1cm处，将处理液缓慢注射至玉米茎部，可见处理液从叶鞘流出即为合格的接种处理。接种玉米继续培养7～10d，对不同处理玉米瘤黑粉病发病情况进行调查和统计发病情况。每处理接种玉米幼苗10株。

(3)试验处理：

b为混合接种U9+U10和3mM吲哚-3-甲醛；

c为ST4培养液(OD₆₀₀＝0.5)+2％葡萄糖+U.maydis；

d为ST4培养液(OD₆₀₀＝0.5)+U.maydis；

e(负对照)为接种YePS培养基；

f(正对照)为接种U9+U10。

2、试验结果

(1)如图5和表1所示，接种玉米瘤黑粉菌的玉米发病率，发病快，茎秆、叶鞘、叶片等感染了黑粉菌的部位严重畸形，可见白色瘤状突起，培养的时间越长，瘤状突起由白色变为黑色，甚至破裂，发病率为100％。

(2)如图5和表1所示：

1)经过吲哚-3-甲醛处理的玉米发病率低，仅为5.56％(表1)，而且发病株的畸形小，说明吲哚-3-甲醛对玉米瘤黑粉病有较好的防治作用；

2)混合接种假单胞菌ST4菌株的玉米发病率为88.89％(表1)，防治效果不显著；

3)而当接种加入有葡萄糖时，假单胞菌ST4菌株能有效的防治玉米瘤黑粉病的发生，其发病率仅为15.38％(表1)。

由此可知，吲哚-3-甲醛对玉米瘤黑粉病有较好的防治作用，同时ST4菌株在葡萄糖的作用下能够产生某些防治玉米瘤黑粉病的物质，从而降低玉米瘤黑粉病的发生。

表1生防菌ST4对玉米瘤黑粉病的防治效果

实施例6吲哚-3-甲醛及其衍生物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用

1、试验方法

(1)实施例4表明，吲哚-3-甲醛对甘蔗鞭黑粉菌有性配合具有一定的抑制效果，为探讨该物质的有效作用结构，本发明购买了大量不同结构的吲哚类衍生物并验证它们对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。吲哚及其衍生物(表2)购买至上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

(2)为明确吲哚-3-甲醛及相关衍生物是否对甘蔗鞭黑粉菌MAT-1和MAT-2担孢子的有性配合具有抑制作用及其抑制浓度，本试验将不同浓度的吲哚-3-甲醛及相关衍生物与MAT-1和MAT-2担孢子混合菌液共同培养，观察甘蔗鞭黑粉菌担孢子和菌丝生长情况。具体方案为：

1)称取适量的吲哚-3-甲醛及相关衍生物，溶于甲醇，浓度为100mM；

2)配制PDA培养基，待冷却至60～80℃时混合适量的吲哚或相关衍生物后倒板，化合物终浓度分别为0.2、0.4、0.6和0.8mM；

3)准备MAT-1和MAT-2担孢子，待培养基表面吹干后均匀接种MAT-1和MAT-2混合菌液和单独菌液，于28℃培养2～3d，期间观察甘蔗鞭黑粉菌MAT-1或MAT-2生长情况，及混合菌液菌丝生成情况；

4)接种甘蔗鞭黑粉菌担孢子于不含化合物的PDA培养基为空白对照，接种于含ST4代谢产物的培养基为阳性对照。试验重复2次，每处理重复3次。

2、试验结果

(1)如表2所示，试验发现，吲哚对甘蔗鞭黑粉菌的有性配合抑制效果最好，0.2mM的吲哚就能抑制甘蔗鞭黑粉菌的有性配合，其最低抑制浓度比吲哚-3-甲醛低3～5倍。

(2)醛基的位置对其抑制作用影响有限，除吲哚-4-甲醛外，其他位置的吲哚甲醛对甘蔗鞭黑粉菌的抑制浓度为0.6mM。

(3)吲哚3号位甲醛替代基团越复杂，其抑制作用越弱，越简单抑制作用越强，还原型甲醇基团的抑制作用强于氧化型的甲酸基团；在吲哚的其他位置增加不同基团能够增加吲哚-3-甲醛对甘蔗鞭黑粉菌生长的抑制。

综上所述，试验结果提示，吲哚-3-甲醛对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用主要为吲哚基团，吲哚上的添加基团越简单，抑制作用越明显。

表2吲哚-3-甲醛及其衍生物对甘蔗黑粉菌的抑制效果

注：培养3d记录结果，+有抑制作用，(+)部分抑制，-无抑制作用。

Claims

1.吲哚-3-甲醛或其衍生物或其药学上可接受的盐在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用，或在制备防治由植物病原真菌引起的植物病害的农药或生防制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物病原真菌为异宗配合型真菌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为甘蔗黑穗病、玉米瘤黑粉病、疫霉病、霜疫霉病、稻瘟病或锈病。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的异宗配合型真菌为黑粉菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的黑粉菌为甘蔗鞭黑粉菌、玉米瘤黑粉菌、小麦印度腥黑粉菌、小麦网腥黑穗粉菌或高粱黑粉菌。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述衍生物包括吲哚、1-甲基吲哚-3-甲醛、3-氰基吲哚、吲哚-3-羧酸、3-甲基吲哚、3-吲哚乙腈、3-吲哚丁酸、3-吲哚甲醇、吲哚-2-甲醛、吲哚-5-甲醛、吲哚-6-甲醛、吲哚-7-甲醛、5-氯吲哚-3-甲醛、3,3'-亚甲基二吲哚。

7.一种植物病原真菌的杀菌剂，其特征在于，含有吲哚-3-甲醛或其衍生物或其药学上可接受的盐。

8.一种植物病原真菌的有性配合抑制剂，其特征在于，含有吲哚-3-甲醛或其衍生物或其药学上可接受的盐。

9.一种吲哚-3-甲醛的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 采用固体发酵方式，将假单胞菌接种于PDA平板上，在26～30℃培养36～60 h后擦去菌落，获得发酵培养基；

S2. 将上述发酵培养基切成小块后浸泡于2～3倍体积的由乙酸乙酯、甲醇和冰醋酸组成的混合溶液中，过滤收集上清液，减压浓缩后去除上清液中的有机溶剂，用2～3倍体积的乙酸乙酯萃取水相溶液2～3次，得到发酵液提取物；

S3. 将S2所得发酵液提取物经层析分离得到吲哚-3-甲醛。

10. 根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述假单胞菌为假单胞菌ST4，该菌株已于2015年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015526。