CN109180593B

CN109180593B - 酚嗪生物碱类次生代谢产物及其应用

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Publication number: CN109180593B
Application number: CN201811121798.XA
Authority: CN
Inventors: 李一青; 胡林芳; 赵立兴; 苗翠苹
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109180593A

Abstract

本发明涉及一种酚嗪生物碱类次生代谢产物及其应用，属微生物农药技术领域。其特点是通过发酵培养保藏登记号为CCTCC NO：M 2018221的一株链霉菌（Streptomyces sp.）YIM PH20246，再对其发酵产物进行萃取浓缩及分离纯化，得到2种酚嗪生物碱类次生代谢产物。本发明的酚嗪生物碱类次生代谢产物对三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、黄瓜萎蔫病菌及草茎点霉菌均具有不同程度的抑制活性。本发明的酚嗪生物碱类次生代谢产物具有抑菌效果好，易重复生产，经济安全、绿色环保的优点，能作为制备拮抗三七根腐病剂的应用。

Description

酚嗪生物碱类次生代谢产物及其应用

技术领域

本发明涉及一种酚嗪生物碱类次生代谢产物及其应用，属微生物农药技术领域。

背景技术

三七的种植和加工是云南省生物医药产业发展的重要支柱，由于三七为多年生宿根草本植物，性喜温暖阴湿，其独特的生长环境非常容易诱发各种土传微生物病害，其中以尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌和黄瓜萎蔫病菌等真菌引起的根腐病害最为严重。目前对三七根腐病的防治很大程度上还是依赖于使用有机氯、有机磷以及氨基甲酸酯等化学农药进行药剂灌根，但长期使用化学农药易导致病害产生抗药性和环境被污染，且由于农药的大量使用所导致的三七农药残留已严重地影响了三七的品质和药用价值。

目前国内外对生物农药的研制给予了极大重视，生物防治被认为是农业病害防治中最具有发展潜力的防治方法。通过大量筛选和利用拮抗三七根腐病的有益微生物及其产生的活性次生代谢物进行三七根腐病害的防治，具有经济安全、绿色环保的优势，是三七根腐病防治中重要而有效的途径。获得结构明确的活性先导化合物不仅有利于知识产权的保护和产品的登记，还可使农药在生产过程中实现有效的质量控制，因此，从微生物次生代谢产物中发现活性先导化合物是绿色新型微生物农药研发的关键之一。

经国内外文献检索，目前没有与本发明相同的酚嗪生物碱类化合物应用于防治三七根腐病的报道。

发明内容

本发明的目的是从YIM PH20246菌株的次生代谢产物中获得具有抑制三七根腐病病原真菌活性的单体化合物，为新型微生物抑制三七根腐病剂的研发奠定物质基础。

本发明是这样实现的：

发明人在前期研究中，筛选得到一株具有抑制三七根腐病活性的链霉菌YIMPH20246（Streptomyces sp.YIM PH20246），该菌株已于2018年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO ：M 2018221。

本发明采用菌株种子液体培养及菌株液体发酵培养的方法，对YIM PH20246菌株进行二级发酵培养，发酵结束后将发酵液离心除去菌丝体，发酵上清液用等体积乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干溶剂浓缩得到菌株发酵粗提物。菌株发酵粗提物经过硅胶柱层析(氯仿/甲醇洗脱) 分离后得到五个组分，其中的活性组分采用反复Sephedex-LH20凝胶柱(甲醇)和硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯洗脱)的方法进一步分离纯化，即得到本发明的2个酚嗪生物碱类活性单体化合物。经质谱、红外、紫外光谱、旋光及核磁共振波谱数据分析，确定了这2个化合物结构。其中，化合物1为9-hydroxyphenazine-1-carboxamide，化合物2为methyl9-carbamoylphenazine-1-carboxylate，它们均为未见文献报道的新结构化合物。

化合物1（1）及化合物2（2）的化学结构如式（I）所示。

从菌株YIM PH20246的发酵产物中分离纯化得到的2个酚嗪生物碱类单体化合物的理化性质及化合物的质谱、红外、紫外光谱、旋光及¹H谱、¹³C谱数据结果如下：

化合物1：桔红色粉末，旋光值

-58.5185 (c 0.30，MeOH)，紫外吸收UV(MeOH) l_max(log e): 207 (4.59), 249 (4.34), 266 (4.59), 368 (3.86), 436(3.36)，红外吸收IR (KBr) n _max：3431, 2961, 2923, 2851, 1624, 1582, 1559, 1535,1473, 1399, 1164, 1129, 974, 867, 719 cm^-1，质谱HR-ESIMS m/z：240.0768 [M+H]⁺，262.0576 [M+Na]⁺，238.0632 [M-H]^-，分子量为239，分子式为C₁₃H₉N₃O₂。其¹H谱、¹³C谱数据为：¹H NMR (600MHz, CD₃OD, d, ppm, J/Hz)：8.85 (1H, dd, J = 7.08, 1.26, H-2),8.53 (1H, dd, J= 8.64, 0.96, H-4), 8.02 (1H, dd, J = 8.52, 7.26, H-3), 7.89(1H, dd, J = 8.76, 7.62, H-7), 7.81 (1H, t, J= 7.74, H-6), 7.26 (1H, dd, J =7.32, 0.54, H-8)。¹³C NMR (150MHz, CD₃OD, d, ppm)：169.15 (CONH₂), 154.84 (C-9),144.04 (C-4a), 142.98 (C-5a), 142.39 (C-10a), 137.06 (C-1), 136.63(C-4),135.51(C-2), 134.73(C-3), 130.66(C-7), 130.36 (C-9a), 120.40 (C-6), 111.92(C-8)。

化合物2：黄色粉末，旋光值

-36.2963 (c 0.45, DMSO)，紫外吸收UV (DMSO)l_max(log e): 257 (4.43), 369 (4.13), 393 (3.66), 红外吸收IR (KBr) n _max：3431,2950, 2925, 2853, 1732, 1674, 1655, 1631, 1617, 1533, 1453, 1435, 1384, 1340,1259, 1216, 1038, 854, 755, 671, 568 cm^-1，质谱HR-ESIMS m/z：282.0873 [M+H]⁺，分子量为281，分子式为C₁₅H₁₁N₃O₃。其¹H谱、¹³C谱数据为：¹H NMR (600MHz, DMSO-d ₆, d, ppm,J/Hz)：8.70 (1H, dd, J= 7.02, 1.38, H-2), 8.60 (1H, dd, J = 8.70, 1.20, H-8),8.41 (1H, dd, J = 8.64, 1.32, H-6),8.30 (1H, dd, J = 6.84, 1.26, H-4),8.11(1H, dd, J = 8.64, 7.08, H-7),8.09 (1H, dd, J = 6.06, 4.26, H-3), 4.01 (3H,s, CH₃)。¹³C NMR (150MHz, DMSO-d ₆, d, ppm)：166.61 (CONH₂), 165.64 (COOCH₃),142.73 (C-10a), 140.78 (C-4a), 140.30 (C-5a), 139.66 (C-9a), 134.65 (C-6),133.21 (C-4), 132.67 (C-2), 132.05 (C-8), 131.71 (C-9), 131.26 (C-1), 131.10(C-7), 130.92 (C-3), 52. 70 (COOCH₃)。

对照文献(J. Antibiot., 1995, 48, 1353-1354.)报道的核磁数据，化合物1鉴定为9-hydroxyphenazine-1-carboxamide；化合物2鉴定为methyl 9-carbamoylphenazine-1-carboxylate。

采用常规MIC法实验测定本发明的酚嗪生物碱类化合物对4株三七根腐病病原真菌的抑制活性，以最小抑制浓度（MIC）值表征活性结果，所得结果如表（1）所示。

表（1）本发明的酚嗪生物碱类化合物抗三七根腐病病原真菌活性：

MIC法实验表明：本发明的酚嗪生物碱类化合物对三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、黄瓜萎蔫病菌及草茎点霉菌均具有不同程度的抑制活性。化合物1对尖孢镰刀菌及黄瓜萎蔫病菌的抑菌活性最好，其最小抑制浓度均为32μg/mL；化合物2对草茎点霉菌的抑菌活性最好，其最小抑制浓度为32μg/mL。

因此，该类化合物可以作为制备拮抗三七根腐病剂的应用。

本发明具有抑菌效果好，易重复生产，经济安全、绿色环保的优势。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

酚嗪生物碱类化合物的制备方法：

(1)菌种液体种子培养：①液体种子培养基的制备：取酵母膏4.0g ；葡萄糖4.0g ；麦芽膏5.0g ；复合维生素0.35ml ；加水至1000ml，pH 7.2，120°C灭菌30min ；②发酵：将菌株YIM PH20246接种到灭菌后的培养基中，28°C下于转速为220转/分钟的摇床上摇瓶发酵2天。

(2)菌种发酵培养：①发酵培养基的制备：取淀粉24.0g ；牛肉膏3.0g ；葡萄糖1.0g ；酵母膏5.0g ；蛋白胨3.0g ；CaCO₃ 4.0g ；加水至1000ml，pH 7.0，120°C灭菌30 min；②发酵：将上述方法(1)中得到的菌株YIM PH20246种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10 %，28°C下于转速为220转／分钟的摇床上摇瓶发酵6天。

(3)发酵液处理：①发酵液经3000转／分钟离心除去菌丝体，离心时间为20分钟；②以等体积乙酸乙酯萃取发酵上清液4次，回收溶剂后得到菌株发酵粗提物；③进行硅胶柱层析（三氯甲烷-甲醇体积比80 ：1至10 ：1梯度洗脱）后得到Fr.1-Fr.5五个组分；④组分Fr.3经甲醇凝胶柱层析纯化后得到Fr.3-1和Fr.3-2二个组分，组分Fr.3-2经反复甲醇凝胶柱层析及硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯体积比8 ：1洗脱）后得到单体化合物1；⑤组分Fr.5经甲醇凝胶柱层析纯化后得到Fr.5-1、Fr.5-2和Fr.5-3三个组分，组分Fr. 5-3经甲醇凝胶柱层析及硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯体积比10：1洗脱）后得到单体化合物2。

结合化合物的质谱、红外、紫外光谱、旋光及¹H谱、¹³C谱数据，确定了本发明化合物1为9-hydroxyphenazine-1-carboxamide，其分子量为239，分子式为C₁₃H₉N₃O₂；化合物2为methyl 9-carbamoylphenazine-1-carboxylate，其分子量为281，分子式为C₁₅H₁₁N₃O₃，它们的化学结构如式（I）所示。

实施例2

实施例1中制备得到的酚嗪生物碱类化合物抑制三七根腐病病原真菌活性的测定采用常规MIC法，主要步骤为：

1. 三七根腐病病原真菌的培养与制备

将4株三七根腐病病原真菌：尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、黄瓜萎蔫病菌及草茎点霉菌分别接种到装有60mL PDB培养基的250mL三角瓶内，28°C下于转速为220转/分钟的摇床上振荡培养96小时，取摇瓶中一定量的菌液加入已灭菌的试管中，用无菌水将菌悬液浓度稀释为1×10³ CFU/mL备用。PDB培养基的配制方法为：马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟，过滤后得到1000ml滤液，然后加入葡萄糖20g，pH自然。

2. 待测化合物的配制

用二甲亚砜作溶剂将待测化合物溶解，将化合物的初始浓度配制为1024ug／mL，并将初始浓度样品采用二倍连续稀释法稀释成其余9个浓度，依次为512，256，128，64，32，16，8，4，2（单位：μg/mL）。

3. 活性测定方法

在96孔板每个横排的第1个孔中加入90μL供病原菌生长的PDB培养基和5μL病原菌悬液及5μL初始浓度化合物样品，此时第1孔总体积为100μL，化合物浓度为512μg/mL；依相同方法，第2至第10孔内的化合物浓度依次为256，128，…1（单位：μg/mL）；每排第11和12孔内分别加入等同浓度的菌悬液及5μL二甲亚砜作为空白对照，每孔内二甲亚砜浓度均不超过5%，96孔板的每一横排测试一种病原菌，并以制霉菌素作为阳性对照。将培养病原真菌的96孔板放置在28℃的恒温培养箱中培养48小时后观察化合物抑制真菌活性结果，将待测化合物能抑制培养基内病原菌生长的最低浓度作为最小抑制浓度（MIC），实验结果取三次重复的平均值。

4. 实验结果

MIC法实验结果表明：化合物1对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、黄瓜萎蔫病菌及草茎点霉菌的最小抑制浓度分别为32、64、32、128（单位：μg/mL）；化合物2对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、黄瓜萎蔫病菌及草茎点霉菌的最小抑制浓度分别为64、64、128、32（单位：μg/mL）。化合物1和化合物2对4株三七根腐病病原真菌均具有不同程度的抑制活性。

Claims

1.用于抑制三七根腐病病原真菌的酚嗪生物碱类次生代谢产物，由生产菌株经常规发酵、提取分离获得；其特征在于：

a.生产菌株链霉菌YIM PH20246(Streptomyces sp.YIM PH20246)已于2018年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018221；

b.酚嗪生物碱类次生代谢产物由2种化合物组成，其结构式为：

2.权利要求1所述的酚嗪生物碱类次生代谢产物的用途，其特征在于所述酚嗪生物碱类次生代谢产物用于制备拮抗三七根腐病剂的药物。