CN107129936B - 一种产紫杉醇的青霉bp6t3及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株从红豆杉科巴山榧树的组织中分离筛选出的产紫杉醇的内生菌，经过分类鉴定命名为青霉(Penicillium sp.)BP6T3，保藏编号为CCTCC NO:M2016320。该菌株具有抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性，发酵液中脂溶性提取物含量可达105mg/L，其中紫杉醇的相对百分含量为15.8%，产量为16.59 mg/L，高于现有技术已公开的产量；以L‑苯丙氨酸为前体，紫杉醇的产量可增长425.17%。采用CCK‑8试剂法证明了青霉BP6T3的发酵液提取物对Hela肿瘤细胞的抑制作用，抑制率可达到56.68%。

Description

一种产紫杉醇的青霉BP6T3及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种从巴山榧树中分离出的青霉BP6T3，该菌株具有高产紫杉醇的特性，还涉及青霉BP6T3在治疗肿瘤细胞中的应用。
背景技术
根据内共生理论，内生真菌可能产生与宿主相同或相似的次生代谢产物，而药用植物是中药的重要来源，因此药用植物的内生真菌可能产生与中药相同或相似的化合物。根据这一观点，药用植物内生真菌一直是近年来筛选一些重要医用药物的理想途径，特别是生产成本高、价格昂贵或其它途径不易得到的药物。近年来在植物内生真菌中发现的有益次生代谢产物的结构类型主要有：萜类、黄酮类、异香豆素类、生物碱类、苯并呋喃类、多肽类、甾体化合物等。
植物与其内生菌构成了稳定的共生关系。植物茎和叶的化石提供的证据表明，植物与其内生菌之间的内生关系早在高等植物出现在地球上的时候就已存在，在植物与内生菌长期的协同进化，建立了独特的遗传与代谢关系[王梅霞，陈双林，闫淑珍，霍娟.一株产黄酮银杏内生真菌的分离鉴定与培养介质的初步研究[J].南京师大学报(自然科学版)，2003，26(1)：106-110.]。由于植物与内生菌相互间基因交换的结果，使内生菌具有产生某些与植物相同或相似化合物的能力，因此，可作为天然活性物质的重要来源。
目前已经发现了能够产生抗肿瘤的多种植物内生菌，红豆杉属植物内生菌产生的抗癌物质紫杉醇是一个典型的例子。紫杉醇及其类似物是一种高效、低毒、广谱、作用机制独特的天然抗肿瘤药物，属于二萜生物碱。它的相对分子质量为853.9，熔点213-216℃，为白色结晶粉末，具有高度亲脂性，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮、甲醇等有机溶剂(李媛，李振宇.天然抗癌药物—紫杉醇[J].中山大学研究生学刊(自然科学、医学版)，2006，27(4)：58～61.)，其化学结构式(Wani MC,Taylor HL,Wall ME,et al.Plant antitumoragents.VI.The isolation and structure of taxol,a novel antileukemic andantitumor agent from Taxus brevifolia[J].J Am Chem Soc,1971,93:2325～2327.)如图1。
上世纪五十年代末，美国国家癌症研究所制定了一项从全美植物中筛选抗癌活性物质的庞大计划。受该计划资助，Wall和Wani于1963年从太平洋红豆杉(Taxusbrevifolia)树皮中提取出紫杉醇粗提物，1966年，紫杉醇得到纯化，并确定了它的结构。随后几年，证明其具有较高的抗B16黑色瘤活性。1979年，Schiff和Horwitz阐明了紫杉醇特异性结合于分裂中的细胞如癌细胞的维管束蛋白，尤其是β－微管蛋白。至1992年12月29日，美国食品药品管理局(FDA)批准Bristol-Myers-Squibb(BMS)公司将紫杉醇上市，商品名为Taxol，主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌。
随着对紫杉醇的需求量日益增大(紫杉醇在红豆杉属植物树皮中的含量仅约为0.003﹪-0.069﹪)，寻找紫杉醇的新来源已经成为当务之急。自第一株产紫杉醇植物内生真菌被发现以后，利用微生物发酵生产紫杉醇为解决紫杉醇药源危机提供了一条新的途径。目前发现的紫杉醇产生菌近30种。在发现的这么多产生菌中，有的已经确定了能产紫杉醇，有的初步推断有可能产紫杉醇的真菌，其中19个仅仅是通过TLC或HPLC的色谱方法来检测。
Strobel等(Strobel G,Yang XS,Sears J,et al,Taxol from Pestalotiopsismicrospora,an endophytic fungus of Taxus walachiana[J].Microbiology,1996,142:435～440.)在分离产紫杉醇真菌的方法中，综合使用了色谱、质谱、光谱和核磁共振以及免疫化学，非常有效地确定了产紫杉醇的真菌，并经过发酵准确地测定了紫杉醇的含量，所分离的产紫杉醇的真菌中，产率最高的是1996年从西藏红豆杉中分离的，其产率达到了60-70μg/L，产量极为有限。
迄今为止，产紫杉醇内生真菌菌株主要从濒危物种红豆杉属的植物中分离，却忽略了红豆杉科中其它属植物。有研究表明，红豆杉科榧属植物中也发现有紫杉烷类化合物，但含量极低，紫杉醇含量低于0.003％，认为药用开发价值不大(易官美，邱迎春.榧树的研究现状与发展[J].资源与环境，2013，29(8)：844-848.)。刘艳等从海南粗榧(Cephalotaxushainanensis Li)中分离到的产次生代谢产物的菌种，主要产生的抗肿瘤物质为三尖杉酯碱类化合物(刘艳等.海南粗榧内生真菌CH1307鉴定及其抗肿瘤活性研究[D].海南大学,2012.蒋春洁.海南粗榧内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选[D].海南大学,2014.)
本发明的目的是从神农架国家地质森林公园巴山榧树(红豆杉科，榧属)组织中分离内生真菌，通过抑菌试验，筛选出具有抗菌活性植物的内生真菌；再通过高效液相色谱分析和抗肿瘤活性分析，筛选出产生紫杉醇或类似物次生代谢产物的菌种，并通过用液质联用仪进行定性检测，推测该菌株产生的紫杉烷类化合物为紫杉醇。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种从巴山榧树中分离出的内生菌青霉(Penicillium sp.)BP6T3，该菌株具有抗金黄色葡萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)活性，同时还具有高产紫杉醇的特性。
本发明的另一个目的是在于提供了一种青霉BP6T3的培养方法，通过在培养基中添加前体物质L-苯丙氨酸，紫杉醇的产量可增长425.17％。
本发明的再一个目的是在于提供了一种青霉BP6T3在制备治疗肿瘤细胞药物中的应用，经试验证明，青霉BP6T3发酵液提取物对Hela肿瘤细胞具有明显的抑制作用。
为了达到上述的目的，本发明通过下述技术方案实现：
一种青霉(Penicillium sp.)BP6T3的分离筛选方法，其步骤是：
1、将巴山榧树的根、茎、叶、树皮分别用无菌水冲洗后，无菌吸水纸吸干，分别经75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然后用无菌水冲洗，用无菌刀将采集到的根、茎和树皮切成小段，取各部位的材料置于PDA固体培养基平皿，于28℃恒温箱中培养，待上述平皿中接种物切面边缘长出细小菌丝，挑取菌丝转接入新的PDA固体平板上纯化直至为纯培养物；
2、用菌丝尖端接种法将纯化的真菌接种至PDA平板上，28℃培养，记录菌落大小、颜色、菌丝致密程度、菌落边缘是否整齐、菌落生长速度以及产色素情况；
3、用琼脂块法测定内生真菌的抑菌活性：将待测供试细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)用LB培养基活化后，分别涂布于LB固体培养基表面，每个平皿中接种带有琼脂培养基的内生菌，37℃培养1-2天，观察琼脂块周围的抑菌圈，获得一株具有同时具有抗金黄色葡萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)活性的菌株，记为BP6T3；
4、经过平皿培养，观察该菌株菌落颜色呈绿色，菌落质地为丝绒状，显微镜下菌丝为多细胞分枝，菌丝有横隔；分生孢子梗亦有横隔，基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生2轮不对称的小梗，形如扫帚，分生孢子球形或椭圆形，光滑或粗糙；大部分孢子生长时呈蓝绿色，菌丝发生直立的多细胞分生孢子梗，其上各生一串灰绿色分生孢子，由此可初步鉴定为青霉(Penicillium sp.)菌株BP6T3；
5、将菌株BP6T3在PDA液体培养基中，180rpm、28℃活化3天，作为种子液，将种子液以5％(v/v)的接种量，接入PDA液体培养基中，180rpm，28℃培养7-10天收获发酵液；
6、发酵结束后，收集滤液，滤液中加入1/3体积的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上层有机相，于旋转蒸发仪中除去有机溶剂，获得萃取物，萃取物的含量平均为105mg/L；
7、高效液相色谱(HPLC)测定，发现抽提物中含有与紫杉醇标准品保留时间基本一致的成分，测得保留时间为12.8min，与标准品保留时间相近，表明其含有紫杉醇或类似物；
8、液质联用仪测定代谢抽提物中紫杉醇类似物的结构，表明其母离子Da为876.300，子离子Da分别为307.900、591.200和531.200，源电压均为150，碰撞能分别为36、36和40，与紫杉烷类化合物紫杉醇标准品完全一致，故判断青霉BP6T3产生的紫杉醇或类似物为紫杉醇。
所述的青霉(Penicillium sp.)BP6T3，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2016年6月8日，保藏编号：CCTCC NO.M2016320，其特征是具有抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活性，发酵液中紫杉醇的含量达到16.59mg/L。
青霉BP6T3高产紫杉醇的培养方法：在PDA培养基中添加前体物质L-苯丙氨酸可增加紫杉醇的产量，实验表明添加3.0mg/L的L-苯丙氨酸可将青霉BP6T3的紫杉醇产量增长425.17％。
青霉BP6T3在制备预防或治疗肿瘤细胞药物中的应用：通过CCK-8法测定青霉BP6T3的发酵液提取物对Hela细胞的抑制作用，结果表明随着提取物浓度的升高，对细胞增殖的抑制作用增强，其中以10.57μg/mL浓度处理的抑制作用最强，抑制率为56.68％，再根据液质联用测定结果，故推测青霉BP6T3产生的抗Hela细胞物质为紫杉醇。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1、本发明是从巴山榧树(红豆杉科，榧属)组织中分离的内生真菌，从红豆杉属以外的植物中分离到具有产生紫杉醇或类似物能力的植物内生真菌，大大扩大了获取产生紫杉醇或类似物菌种的资源范围，有利于更广泛地利用微生物资源。
2、该植物内生菌青霉BP6T3可以非常稳定地产生紫杉醇，其脂溶性提取物含量平均约为105mg/L，紫杉醇相对百分含量为15.8％，紫杉醇的产量为16.59mg/L，高于现有技术已公开的产量(Strobel G,Yang XS,Sears J,et al.Taxol from Pestalotiopsismicrospora,an endophytic fungus of Taxus walachiana[J].Microbiology,1996,142:435～440；邱德有等.一种云南红豆杉内生真菌的分离，《菌物学报》,1994(4):314-316；LiJ,et al.Ambuic acid,a highly functionalized cyclohexenone with antifungalactivity Pestalotiopsis spp.and Monochaetia sp Phytochemistry,2001,56(5):463-468；周东坡，平文祥，孙剑秋等.紫杉醇产生菌分离的研究[J].微生物学杂志，2001，2l(1)：18—20；赵凯，平文祥,马玺等，紫杉醇高产菌株的原生质体诱变选育及其遗传变异初探，微生物学报，2005，45(3)：355-358.)；以L-苯丙氨酸为前体，紫杉醇的产量可增长425.17％。
3、经CCK-8试剂法检验，青霉BP6T3发酵液提取物对Hela肿瘤细胞具有显著的抑制作用，抑制率最高达到56.68％，推测青霉BP6T3产生的抗Hela细胞物质为紫杉醇。
4、利用本发明的植物内生菌青霉BP6T3发酵生产紫杉醇，可以不受资源、环境、条件、设备等的各种限制，短时间、大规模进行生产。
附图说明
图1为紫杉醇的化学结构式
图2为青霉BP6T3的菌苔照片
图3为青霉BP6T3的显微照片
图4为紫杉醇的标准品高效液相(HPLC)色谱图，箭头所示峰为紫杉醇标准品
图5为青霉BP6T3代谢抽提物的高效液相(HPLC)色谱图，箭头所示峰为紫杉醇/紫杉醇类似物
具体实施方式
实施例1：巴山榧树植物内生菌的分离纯化
1、巴山榧树材料的预处理
于湖北省神农架国家地质森林公园采集巴山榧树的根、茎、叶、树皮，用无菌水冲洗后，吸干；分别经75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然后用无菌水冲洗3遍；再用无菌刀将采集到的根、茎和树皮切成与叶片约2-3cm，叶片从中间切出剖面。
2、巴山榧树植物内生菌的分离
取预处理的各部位的材料置于PDA固体培养基平皿，在28℃培养；PDA培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1000mL，加琼脂(15％)为PDA固体培养基。
3、巴山榧树植物内生菌的纯化
当平皿中接种物切面边缘长出细小菌丝时，在无菌条件下用接种针挑取菌丝接入新配制PDA固体平板上，在PDA斜面培养基上反复纯化，直至得到纯培养物。
实施例2：内生真菌抑菌活性检测
1、将供试细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)用LB液体培养基活化后，分别涂布于LB固体培养基表面；
2、切下实施例1获得的纯化植物内生菌琼脂培养基块，分别放置接种于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌平皿中，37℃培养1-2天，观察琼脂块周围的抑菌圈。
通过上述方法，筛选获得一株同时具有抗金黄色葡萄球菌(G+)和抗大肠杆菌(G-)活性的菌株，记为BP6T3。
实施例3：内生真菌BP6T3的鉴定
经过平皿培养特性观察，该菌株菌落颜色呈绿色，菌落质地为丝绒状(图2)，显微镜下菌丝为多细胞分枝，菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生2轮不对称的小梗，形如扫帚，分生孢子球形或椭圆形，光滑或粗糙，大部分生长时呈蓝绿色，菌丝发生直立的多细胞分生孢子梗，其上各生一串灰绿色分生孢子(图3)，根据《中国真菌志(第35卷):青霉属及其相关有性型属》(孔华忠主编，中国真菌志(第三十五卷)青霉属及其相关有性型属[M].北京：科学出版社，2007，5～10.)可初步鉴定为青霉(Penicillium sp.)，记为BP6T3。
实施例4：青霉BP6T3发酵液中脂溶性物质的提取
1、将实施例2获得的青霉BP6T3于PDA液体培养基中活化(活化条件：28℃，180rpm，培养5-7天)，作为种子液；
2、按照5％(v/v)的接种量接入PDA液体培养基中，28℃，180rpm，培养7-10天；
3、过滤收集滤液，滤液中加入1/3体积的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上层有机相；
4、于旋转蒸发仪上35℃除去有机溶剂，用甲醇溶解粘在壁上的物质并挥发干燥，通过重量法测定发酵液脂溶性提取物含量；测定青霉BP6T3发酵液中脂溶性提取物含量平均约为105mg/L。
实施例5：高效液相色谱(HPLC)定量检测青霉BP6T3提取物紫杉醇类似物
1、实施例4中获得的脂溶性提取物及流动相处理：将实施例4中获得的浓缩产物13200r/min离心2min，吸取上清液，经0.22μm孔径滤膜过滤除去杂质，然后同配好的流动相(甲醇/水＝65/35，V/V)一起超声波排气，时间分别为3min、10～15min；
2、色谱条件为：色谱柱，ODS(C18)柱4.6×250mm,5nm；柱温，常温；样品及流动相，甲醇/水＝65/35(V/V)；流速，1.0mL/min；样品进样量，20μL；紫外检测波长，227nm；
3、测得紫杉醇标准品(购自Sigam)的RT(保留时间)为13～14min(图4)；
4、在实施例4制得的提取物样品中发现与紫杉醇标准品保留时间基本一致的成分，出峰时间为12.8min(图5)，可鉴定为紫杉醇类似物；
5、使用HPLC伍丰液相色谱工作站软件根据色谱图测算出青霉BP6T3代谢抽提物中紫杉醇类似物的相对峰面积为12887.11(图5)，相对百分含量为15.8％。
实施例6：青霉BP6T3发酵液提取物对Hela肿瘤细胞的抑制作用
1、取对数生长期的Hela细胞(华联科生物技术有限公司)铺板，将细胞按100μL/孔(1～5×103个细胞/孔)接种于96孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
2、将实施例4中提取的和实施例5中初步鉴定为含紫杉醇类似物的的内生菌BP12±3发酵液提取物配置不同浓度(表1)，取10μL分别加入样品孔中，37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
3、取出培养板，吸去上清，每孔加入90μL新鲜培养液(含有10％胎牛血清的DMEM培养液)和CCK-8 10μL，同样的条件下继续培养4h；
4、用酶标仪在450nm处读取A450值，计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率计算：Hela细胞抑制率(IR)＝(对照孔A值—样品孔A值)/对照孔A值×100％(表1)。
通过上述实验，证明青霉BP6T3发酵液提取物对肿瘤细胞Hela有明显的抑制作用，并随着提取物浓度的升高，对细胞增殖的抑制作用增强，当药物浓度为0.1057μg/mL时，抑制率为24.14％，而当浓度增加到10.57μg/mL时，抑制率达到56.68％。
表1 CCK-8法测定紫杉醇类化合物对Hela细胞的抑制作用
样品浓度(μg/mL) A<sub>450</sub>值 抑制率(％)
空白对照 1.100 ----
0.1057 0.783 24.14％
1.057 0.6666 35.47％
10.57 0.447 56.68％
实施例7：液质联用仪(HPLC-MS)确定青霉BP6T3发酵液含有紫杉醇
1、液相色谱仪器型号：岛津LC-30A UPLC
(1)样品及流动相处理：将实施例4制备的青霉BP6T3发酵液的脂溶性提取物，13200r/min离心2min，吸取上清液，经0.22μm孔径滤膜过滤除去杂质，然后同配好的流动相(乙腈/水＝65/35，V/V)一起超声波排气，时间分别为3min、10～15min；
(2)色谱条件为：色谱柱，ODS(C18)柱4.6x250mm,5nm；柱温，常温；样品及流动相，甲醇/水＝65/35(V/V)；流速，1.0mL/min；样品进样量，20μL；紫外检测波长，227nm；
2、质谱仪器型号为AB sciex 4500 QQQ(三重四级杆液质联用仪)；
经过液质联用仪测定代谢抽提物中紫杉醇类似物的结构(表2)，表明其母离子Da为876.300，子离子Da分别为307.900、591.200和531.200，源电压均为150，碰撞能分别为36、36和40，与紫杉烷类化合物紫杉醇标准品完全一致，可将青霉BP6T3发酵液中紫杉醇类似物定性为紫杉醇，故推测青霉BP6T3产生的抗Hela细胞物质为紫杉醇。
表2紫杉醇标准品与青霉BP6T3发酵液中紫杉醇类似物的质谱分析参数
Q1 Mass(Da) Q3 Mass(Da) DP CE Dwell(msec)
876.300 307.900 150 36 50
876.300 591.200 150 36 50
876.300 531.200 150 40 50
实施例8：不同前体物质对青霉BP6T3产紫杉醇的影响
1、配制苯甲酸钠、乙酸钠、L-苯丙氨酸3种前体溶液，在0.08MPa下灭菌20min；
2、将青霉BP6T3接种于PDA液体培养基，28℃，180rpm，发酵培养至第5天，将3种前体分别加入发酵培养基中，其中一瓶不加任何前体做为对照，前体添加量分别为L-苯丙氨酸溶液终浓度3.0mg/L，乙酸钠溶液终浓度3.5g/L，苯甲酸钠溶液终浓度32.0mg/L；
3、每种发酵培养基中均补加蔗糖溶液，终浓度5.0g/L。
培养至第10天，通过实施例4所述的方法提取青霉BP6T3脂溶性代谢产物并采用高效液相色谱(HPLC)对代谢抽提物中紫杉醇进行定性和定量检测，并计算紫杉醇的增长率，结果见表3。以L-苯丙氨酸为前体，紫杉醇的产量增加最多，增长率为425.17％，结果表明，L-苯丙氨酸能够作为一种有效的前体物质，用于培养青霉BP6T3高效生产紫杉醇。
表3 不同前体对青霉BP6T3产紫杉醇的影响

Claims (3)

1.一株产紫杉醇的内生菌，其特征在于：所述的内生菌为青霉(Penicillium sp.)BP6T3，该菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2016320。
2.权利要求1所述的内生菌产紫杉醇的培养方法，其特征在于：在PDA培养基中添加L-苯丙氨酸。
3.权利要求1所述的产紫杉醇的内生菌在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为宫颈癌。
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