CN106928043A - 续随子二萜烷型化合物结构重排衍生物的转化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物药物领域，涉及新型续随子二萜烷型化合物的制备及在抗肿瘤药物中的应用。所述化合物的结构特征是续随子二萜烷中骈合的三元环发生开环并重排，得到羟基和丙烯基取代的开环化合物。此类化合物是由5/11/3环系的续随子二萜烷型化合物经过拉曼被孢霉Mortierella ramanniana生物转化得到；该类续随子二萜烷型化合物经重排羟化后水溶性增强，提高成药性。进一步，可用于制备抗肿瘤活性的药物或药物组合物。

Description

续随子二萜烷型化合物结构重排衍生物的转化方法及其应用

技术领域

本发明属生物药物领域，涉及续随子二萜烷型化合物的转化方法，具体涉及利用已知微生物对续随子二萜烷进行微生物转化，制备具有抗癌活性的结构重排衍生物。

背景技术

现有技术公开了续随子二萜烷型化合物属于二萜骨架的天然产物，具有较明显的抗肿瘤活性与逆转肿瘤多药耐药性(MDR)活性。构效关系研究表明，其母核上取代基的差异能明显改变该类化合物的抗肿瘤活性和MDR活性。

有研究公开了从大戟科植物续随子Euphorbia lathyris L.中首次分离得到续随子二萜烷型化合物(Tetrahedron Letters,1971,18:1325-1328)；随后从其他植物中陆续分离得到多种续随子二萜烷型衍生物，如从大戟科植物Euphorbia lagascae中分离得到5个具有诱导肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤多药耐药性的续随子二萜醇酯衍生物(Planta Medica,2005,72:162-168)。研究表明，续随子二萜烷型化合物的结构特征具有5/11/3骈合的多元环体系，其中C-9、C-10、与C-11骈合的三元环是与其他大环二萜的主要不同点。虽然已经从植物中分离得到多种结构丰富的续随子二萜烷型化合物，但至今尚未获得C-9、C-10和C-11三元环开环的化合物，更无从得知该三元环裂环后的续随子二萜烷衍生物的抗肿瘤活性及MDR活性。

微生物转化是利用微生物生长过程中合成的特异酶完成特定的生化反应。据报道，微生物在生长过程中可以合成多种酶，催化不同反应，例如氧化反应、还原反应、水解反应、脱氢反应等。此外，微生物还可以催化多种特异性的结构重排反应，生成新型的化合物结构骨架。这种酶催化的结构重排反应，相对于化学反应，更高效环保，可能得到活性更好、副反应更低、具有抗肿瘤活性的先导化合物。迄今为止尚未见有关二萜骨架三元环开环的续随子二萜类化合物的报道。

因此，本申请的发明人拟利用微生物对续随子二萜烷型类化合物进行生物转化反应，以期获得新型的C-9、C-10和C-11三元环开环的新型续随子二萜结构重排衍生物。

发明内容

本发明的目的是提供续随子二萜烷型化合物骨架重排产物的结构改造方法，具体涉及续随子二萜烷型化合物C-9、C-10和C-11三元环开环的结构重排产物的微生物转化方法。

本发明涉及的续随子烷二萜结构重排产物具有式(I)的化学结构，经鉴定所获得的续随子烷型二萜结构重排化合物为：

化合物1C-10(11)裂环千金子二萜醇：R₁＝H

化合物2C-10(11)裂环7β-羟基千金子二萜醇：R₁＝OH

本发明中，续随子二萜烷型化合物骨架重排产物包括式(I)续随子二萜烷型化合物及其衍生物、立体异构体，以及其所形成的在药学上可接受的盐或溶剂化物或一种药物组合物，

其中，所述结构为5/11元环骈合，C-11位存在β-羟基，C-9位存在β构型2-丙烯基；R1是氢或羟基；

本发明中，所述的化合物由续随子二萜烷型化合物生物转化得到，续随子二萜骨架中原有的C-9、C-10和C-11三元环开环伴随重排反应；

所述的生物转化法中，利用拉曼被孢霉Mortierella ramanniana对续随子二萜烷型化合物进行酶催化反应；

本发明中，所述的药学上可接受的盐是指与盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、酒石酸、甲基磺酸、对甲基苯磺酸，二乙醇胺、三乙醇胺形成的化学计量形式和非化学计量形式的盐。

本发明采用现代药理筛选方法，进行续随子烷二萜经拉曼被孢霉Mortierellaramanniana转化得到的两个结构重排产物1和2的细胞试验，结果显示，转化得到的两个结构重排产物1和2对人乳腺癌细胞(MCF-7)和人结肠癌细胞(Caco-2)有抑制活性，证实其具有抗癌活性；所述的化合物或其药物组合物可用于制备抗肿瘤活性药物。

本发明的实施例中，采用微生物转化法转化所述的续随子二萜烷型化合物结构重排衍生物，包括以下步骤：

1)生产菌株为拉曼被孢霉Mortierella ramanniana，该菌株在琼脂培养基上生长良好，将生长在琼脂培养基上的拉曼被孢霉菌丝划线接种于马铃薯固体培养基上，在20-28℃的恒温培养箱中培养3-7天，得到试管种；其中，所述拉曼被孢霉Mortierellaramanniana菌种微生物还包括其功能等同的变异体和突变体。其中，固体培养基包含组分：马铃薯液体培养基加入1％琼脂，加热溶解并分装，121℃高压灭菌20分钟后，放凉使用；

2)将试管种中的菌丝接种到250mL的三角瓶中，每瓶含有50mL液体马铃薯培养基，培养温度为25-28℃，转速为130-180rpm，培养时间为24小时，获得种子液；

3)将种子液按2％～5％体积比接入新鲜马铃薯培养基，28℃，130-180rpm条件下培养24-72小时后，加入转化底物千金子二萜醇或7β-羟基千金子二萜醇，在20-28℃、130-180rpm的条件下转化培养72-240小时；

其中，液体培养基包括组分：200g马铃薯去皮，切成1立方厘米小丁，经1L水微沸煎煮20分钟，随后用8层纱布趁热过滤，放凉后滤液用水补齐到1L，加入20g葡萄糖，搅拌溶解；分装后121℃高压灭菌20分钟后，放凉使用；

4)将发酵液用布氏漏斗减压过滤，获得发酵滤液，按照1:1.5体积比用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压蒸干，发酵产物用硅胶柱层析法分离得到千金子二萜醇的发酵产物C-10(11)裂环千金子二萜醇(1)和7β-羟基千金子二萜醇的转化产物C-10(11)裂环7β-羟基千金子二萜醇(2)。

本发明还提供一种抗肿瘤活性的药物或药物组合物，其中含有式(I)的续随子二萜烷型化合物或其药学上可接受的溶剂化物及药学上可接受的载体。

本发明的优点在于：

提供了新型续随子二萜烷型化合物，所述化合物的结构特征是续随子二萜烷中骈合的三元环发生开环并重排，得到羟基和丙烯基取代的开环化合物，此类化合物是由5/11/3环系的续随子二萜烷型化合物经过拉曼被孢霉Mortierella ramanniana生物转化得到；该类续随子二萜烷型化合物经重排羟化后水溶性增强，提高成药性。

具体实施方式

实施例1高效液相色谱法(HPLC)检视拉曼被孢霉Mortierella ramanniana将千金子二萜醇(Lathyrol)和7β-羟基千金子二萜醇转化为各自结构重排的产物

所述菌种筛选培养基为马铃薯培养基：将200g去皮马铃薯切成1立方厘米小丁，用1L水煮沸20分钟，马铃薯液过滤后加入20g葡萄糖，分装于250mL三角瓶，每瓶50mL，在121℃、0.15Mpa下灭菌20分钟；

菌种接种于斜面固体培养基上，28℃培养7天，保存于4℃冰箱内，采用两步活化法活化菌种，先将菌种接种于马铃薯培养基，28℃，180rpm条件下摇瓶培养48h后，获得种子液；种子液以1％-3％体积比接种于另一马铃薯培养基内，同条件培养48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/mL的千金子二萜醇或7β-羟基千金子二萜醇乙醇溶液，终浓度为0.1mg/mL，空白对照组加入同体积乙醇溶液；同条件培养72h后，抽滤发酵液后得滤液，加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，残渣加1mL甲醇溶解作为待测样品；

用微孔滤膜将样品甲醇溶液过滤，取续滤液进行HPLC检测。液相条件为：

流动相：40％的甲醇-水至80％的甲醇-水于40分钟内线性梯度洗脱，流速：1mL/min

色谱柱：ODS-C18柱(250×4.6mm,5μm)，柱温：25℃

检测器：二极管阵列检测器(DAD)

新型续随子二萜醇的结构重排产物样品峰的保留时间小于千金子二萜醇(lathyrol)样品峰的保留时间；且该新型续随子二萜醇的结构重排产物的紫外图谱中最大吸收波长(λ_max)为254nm，而千金子二萜醇或7β-羟基千金子二萜醇的λ_max为280nm；与空白对照组相比，待测样品出现λ_max为254nm且保留时间小于各自底物的色谱峰，表明拉曼被孢霉Mortierella ramanniana已经将该底物转化为新型续随子二萜醇的结构重排产物。

实施例2制备千金子二萜醇的结构重排产物(1)

采用两步活化法活化菌种，获得的种子液以1％体积比接种于装有250mL马铃薯培养基、体积为1L三角瓶中，28℃，180rpm条件下摇瓶培养48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/mL的千金子二萜醇的乙醇溶液，终浓度为0.1mg/mL，同条件培养108h后，发酵液抽滤，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，得到发酵液总提物；

发酵液总提物用少量乙酸乙酯溶解，以1g硅胶拌样，二氯甲烷湿法上样于装有40g柱层析硅胶的硅胶柱内，用二氯甲烷-甲醇(30:1)洗脱，得到含千金子二萜醇的结构重排产物(1)的流分，回收溶剂，用甲醇溶解残渣，将样品溶液用微孔滤膜过滤，续滤液采用配有ODS色谱柱的高效液相色谱检测。流动相为40％～80％的甲醇-水，40min内线性梯度洗脱，在保留时间(t_R)14min左右出现一个λ_max为254nm的样品峰，即为化合物1；化合物1的NMR结构鉴定数据如表1所示。

实施例3制备7β-羟基千金子二萜醇的结构重排产物(2)

采用两步活化法活化菌种，获得的种子液以1％体积比接种于装有250mL马铃薯培养基、体积为1L三角瓶中，28℃，180rpm条件下摇瓶培养48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/mL的7β-羟基千金子二萜醇的乙醇溶液，终浓度为0.1mg/mL，同条件培养108h后，发酵液抽滤，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，得到发酵液总提物；

发酵液总提物用少量乙酸乙酯溶解，以1g硅胶拌样，二氯甲烷湿法上样装有40g柱层析硅胶的硅胶柱内，用二氯甲烷-甲醇(30:1)洗脱，得到含7β-羟基千金子二萜醇的结构重排产物(2)的流分，回收溶剂，用甲醇溶解残渣，将样品溶液用微孔滤膜过滤，续滤液采用配有ODS色谱柱的高效液相色谱检测。流动相为40％～80％的甲醇-水，40min内线性梯度洗脱，在保留时间(t_R)17min左右出现一个λ_max为254nm的样品峰，即为化合物2；化合物2的NMR结构鉴定数据如表1所示。

表1.化合物1和2的¹H-和¹³C NMR数据(CDCl₃,400MHz)

实施例4化合物1和2的体外抗肿瘤活性试验

采用人乳腺癌细胞(MCF-7)及人结肠癌细胞(Caco-2)作为测试化合物1和2的体外抗肿瘤模型；MCF-7细胞培养基为含有10％小牛血清的RPMI-1640培养基，Caco-2细胞培养基为含有10％小牛血清、1％谷氨酸的DMEM培养基。细胞经10％胰蛋白酶消化后，用培养基吹散制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为10⁵/mL，将细胞接种于96孔板，每孔体积为100μL。经过37℃、5％CO₂孵育24h后，弃去上清液，细胞分组加含药培养基200μL，每个浓度设置3个复孔。实验组加入不同浓度的化合物1和2的DMSO溶液(100.0、80.0、50.0、40.0、25.0、20.0、12.5、10.0、6.25、5.0μM)，空白组加入同体积不含药DMSO溶液；将96孔板置于37℃，含5％CO₂的细胞孵育箱内培养48h后，每孔加入10μL 5mg/mL的MTT，37℃避光孵育4h，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，用平板振荡仪振荡15min，使结晶溶解。用酶标仪在570nm波长下检测每孔光吸收值(OD值)；计算化合物1和2对MCF-7及Caco-2细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)；根据MTT比色法结果显示，化合物2在实验浓度内对MCF-7及Caco-2细胞均有抑制作用，其IC₅₀分别为51.3±2.8μM和16.5±1.6μM。

Claims (7)

1.具有通式(I)的续随子二萜烷型化合物及其衍生物、立体异构体，以及其所形成的在药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中，所述结构为5/11元环骈合，C-11位存在β-羟基，C-9位存在β构型2-丙烯基；R1是氢或羟基。

2.根据权利要求1所述的具有通式(I)的续随子二萜烷型化合物及其衍生物、立体异构体，以及其所形成的在药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述的化合物由续随子二萜烷型化合物生物转化得到，续随子二萜骨架中原有的C-9、C-10和C-11三元环开环伴随重排反应。

3.根据权利要求1所述的具有通式(I)的续随子二萜烷型化合物及其衍生物、立体异构体，以及其所形成的在药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述的药学上可接受的盐是指与盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、酒石酸、甲基磺酸、对甲基苯磺酸，二乙醇胺、三乙醇胺形成的化学计量形式和非化学计量形式的盐。

4.根据权利要求2所述的具有通式(I)的续随子二萜烷型化合物及其衍生物、立体异构体，以及其所形成的在药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述的生物转化法中，利用拉曼被孢霉Mortierella ramanniana对续随子二萜烷型化合物进行酶催化反应。

5.一种药物组合物，其中含有权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物及药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的化合物在用于制备抗肿瘤活性药物中的用途。

7.权利要求5所述的药物组合物在用于制备抗肿瘤活性药物中的用途。