CN102559510B - 一种嗜盐曲霉菌f1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种嗜盐曲霉菌F1及其应用。嗜盐曲霉菌F1(Aspergillus sp.F1)，保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学内)，保藏号为：CCTCC NO：M 2011277，保藏日期为：2011年8月4日。并且将该菌株发酵后其40升发酵产物可分别获得Rosellichalasin和Cytochalasin E纯品约1.5克和2.0克，纯度达99％以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种嗜盐曲霉菌F1及其应用。
背景技术
细胞松弛素类化合物是一类由真菌代谢产生的毒素，它们中有一些具有显著的生物学活性，如抑制哺乳动物细胞分裂、抑制HIV-1蛋白酶、抗菌和抗肿瘤等活性。细胞松弛素因为具有改变细胞微结构的作用，因此成为细胞生物学中细胞微结构和功能研究的常用工具，用于探讨细胞分裂、细胞运动和吞噬、细胞核和质的关系和细胞生物合成等生命活动。
细胞松弛素类化合物Rosellichalasin，Cytochalasin E分别对大肠杆菌，假单胞菌，白色念珠菌都有一定的抑制作用。Cytochalasin E是目前国内外应用较为广泛的细胞松弛素类化合物，它作为动植物细胞结构和功能研究的常用工具，表现出独特的选择多样性，尤其是，它作为一种血管生成抑制剂，并不抑制葡萄糖的转运，这一点是其它细胞松弛素类化合物所不具备的。据文献报道，Cytochalasin E在浓度为10-9-10-6mol/L时，通过抑制肌动蛋白的聚合来抑制肿瘤细胞的增殖，在浓度为10-14-10-9mol/L时，通过其它途径来抑制肿瘤细胞的增殖。Cytochalasin E有望被用来治疗与血管生成相关的癌症和老年性黄斑退化病。由于Cytochalasin E结构复杂，难以人工合成，并且目前细胞松弛素类工具化合物多为进口产品，商品价格偏高，因此，开发具有我国自主知识产权的高产Cytochalasin E微生物菌株显得尤为必要。
发明内容
本发明的目的在于提供嗜盐曲霉菌F1及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种嗜盐曲霉菌F1(Aspergillus sp.F1)，保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学内)，保藏号为：CCTCC NO：M 2011277，保藏日期为：2011年8月4日。
嗜盐曲霉菌F1的应用，将所述嗜盐曲霉菌F1发酵培养于F1的液体发酵培养基中发酵培养，所得发酵物经纯化分离即得到细胞松弛素类化合物Rosellichalasin和Cytochalasin E。
将所述嗜盐曲霉菌F1发酵培养于F1的液体发酵培养基中于28-30℃静止发酵培养25-30天所得发酵物经纯化分离即得到细胞松弛素类化合物Rosellichalasin和Cytochalasin E。
所述发酵物经纯化分离为将发酵培养后的发酵物的菌丝体和发酵液过滤分离，将菌丝体用其2倍体积乙醇浸提4-5次，再用过量的乙酸乙酯萃取10-15次，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏，然后采用硅胶柱层 析、重结晶和Sephadex LH-20凝胶柱层分离纯化，即分别得到Rosellichalasin和Cytochalasin E。
将所述浸膏用乙酸乙酯溶剂溶解后，加200-300目硅胶搅拌，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为溶剂进行梯度洗脱，洗脱速率20ml/min，收集石油醚-乙酸乙酯比例为2∶1(v/v)洗脱液，经TLC检测收集Rf＝0.575组分，洗脱组分减压浓缩至干，再在正己烷-乙酸乙酯比例为1∶1(v/v)中重结晶，收集无色针状晶体Rosellichalasin；
或收集石油醚-乙酸乙酯比例为1∶2(v/v)洗脱液，经TLC检测收集Rf＝0.35组分，洗脱组分减压浓缩至干，再在己烷-丙酮比例为1∶1中重结晶，收集无色针状晶体Cytochalasin E；
将上述所得无色针状晶体分别经Sephadex LH-20柱层析，用甲醇洗脱，洗脱速率为，5ml/min，洗脱液减压浓缩至干，分别得白色无定形物。
所述石油醚-乙酸乙酯梯度为100∶0-0∶100(v/v)；正己烷-乙酸乙酯比例为1∶1(v/v)；己烷-丙酮比例为1∶1(v/v)。所述嗜盐曲霉菌F1的液体发酵培养基成分为：葡萄糖2.0％(W/V)，海盐6.0％(W/V)，马铃薯200克，加适量水煮沸30分钟，4层纱布过滤，滤液用蒸馏水定容至1升。
本发明所具有的优点：
本发明所述嗜盐曲霉菌F1(Aspergillus sp.F1)，保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学内)，保藏号为：CCTCC NO：M 2011277，保藏日期为：2011年8月4日。该菌株采用价格便宜的改良土豆培养基培养，静止发酵，无需摇床震荡培养，发酵过程中，无需调试pH值和补料，即可得到大量菌丝体，降低了发酵过程中的能耗，并且将该菌株发酵后其40升发酵产物经过简单纯化即可分别获得Rosellichalasin和Cytochalasin E纯品约1.5克和2.0克，纯度达99％以上，产量高，发酵和制备成本低，并且制备过程中所用试剂乙醇，乙酸乙酯和甲醇等试剂可循环回收利用，大大降低了有机溶剂对环境的污染。由于Cytochalasin E是目前细胞松弛素类化合物中应用最为广泛，活性最好的细胞松弛素类工具化合物，故本发明所述嗜盐曲霉菌F1是一株颇有市场潜力的细胞松弛素类化合物Rosellichalasin和Cytochalasin E产业化菌株。
附图说明
图1为本发明实施例提供的细胞松弛素类化合物结构式；
图2为本发明实施例提供的细胞松弛素类化合物结构式。
具体实施方式
本发明的化合物可通过微生物发酵培养来获取，首先获得含有该化合物的发酵物，然后采用硅胶柱层析、重结晶和Sephadex LH-20凝胶柱层析等方法从发酵产物中分离纯化得到。
嗜盐曲霉菌F1(Aspergillus sp.F1)，保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学内)，保藏号为：CCTCC NO：M 2011277，保藏日期为：2011年8月4日。该菌株菌丝为白色，褐色孢子丰富，以子囊孢子和菌丝 分裂两种方式繁殖，产褐色色素，可耐受18％的高盐环境，属于中等嗜盐菌，在海盐浓度为3-6％(w/v)长势旺盛。
嗜盐曲霉菌F1产生的细胞松弛素类化合物的方法：
1、化合物的发酵生产及分离精制
(1)发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取曲霉菌F1适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在30℃恒温培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的曲霉菌F1适量，接种到装有400ml培养液的1000ml锥形瓶中，30℃静止培养30天。获得菌丝体和发酵液(40升)。
所述培养液组成(克/升)：葡萄糖2.0％(W/V)，海盐6.0％(W/V)，马铃薯200克，加适量水煮沸30分钟，4层纱布过滤，滤液用蒸馏水定容至1升，pH6.5-7.0。
(2)发酵产物的分离提纯
用棉布将菌丝体和发酵液分离，将菌丝体用其2倍体积的95％的乙醇浸提4-5次，浸提液减压浓缩至膏状，得乙醇粗提物，加水溶解，再用等体积乙酸乙酯萃取10-15次，萃取液减压浓缩得乙酸乙酯粗浸膏(20克)。
(3)化合物的分离精制及薄层色谱表征
浸膏用乙酸乙酯溶剂充分溶解后，加硅胶(200-300目)搅拌，减压除去溶剂后，干法上样，用硅胶柱层析(60x5cm)，以石油醚-乙酸乙酯(100∶0，50∶1，20∶1，10∶1，2∶1，1∶2，0∶100)为溶剂进行梯度洗脱，洗脱速率为20ml/min。
收集经硅胶柱石油醚-乙酸乙酯比例为2∶1(v/v)洗脱系统得到组分即为Rosellichalasin，所得洗脱液经薄层色谱TLC检测收集Rf＝0.575组分，Rosellichalasin在254nm波长下显褐色斑，5％硫酸乙醇显色为砖红色斑，洗脱液减压浓缩至干，再在正己烷-乙酸乙酯(1∶1，v/v)中重结晶，收集无色针状晶体Rosellichalasi纯品(0.5克)；
收集经硅胶柱石油醚-乙酸乙酯比例为1∶2(v/v)洗脱系统得到组分即为Cytochalasin E，所得洗脱液经薄层色谱TLC检测收集Rf＝0.35组分，Cytochalasin E在254nm和365nm波长下无吸收，5％硫酸乙醇显色为黑色斑。洗脱液减压浓缩至干，再在正己烷-丙酮中重结晶(1∶1，v/v)，收集无色针状晶体Cytochalasin E纯品(0.7克)；
上述Rosellichalasin和Cytochalalsin E的结晶液分别经SephadexLH-20柱层析，均采用甲醇进行洗脱，洗脱速率5ml/min洗脱液分别经TLC分析，洗脱液分别减压浓缩至干，得白色无定形物，分别重结晶即分别得无色针状晶体Rosellichalasin(1.0克)和Cytochalasin E(1.3克)。
(4)化合物的结构表征
ESI-MS显示Rosellichalasin和Cytochalasin E的分子离子峰分别在486.22和518.23[M+Na]+，由此可以推断其分子量分别为463.55和495.56， 与NMR解析的结果一致。根据核磁(1H-NMR，13C-NMR)对所得化合物进行结构鉴定，确定化合物的分子式为：C28H33NO5，C28H33NO7，结构式见图1和2。
1H-NMR(600MHz，(CD3)2CO)和13C-NMR(150MHz，(CD3)2CO)数据如表1所示，表1信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。
表1.化合物1，2的1H and 13C NMR数据
1H and 13C NMR Spectral Data for Compounds 1 and 2 in(CD3)2CO(δ inppm，J in Hz)
(5)化合物体外抗肿瘤活性的测试，将上述所得化合物1，2进行药效学试验：细胞：人结肠癌细胞(RKO)
实验方法MTT法：将肿瘤细胞株按照常规方法培养传代，收集对数生长期细胞，调节细胞悬液浓度4×104个/ml左右。将细胞悬液加入96孔培养板中，每个孔加入180μl。置于37℃恒温培养箱中培养24h后。分别将上述化合物Rosellichalasin和Cytochalasin E和5-FU用细胞培养基配成不同浓度(1000，500，250，125，62.5，31.25μg/ml)的溶液，实验组加入各浓度化合物C(以5-FU作为阳性对照组)20μl/孔，每组各设4个平行孔，并设空白孔(细胞培养基)以调零。在培养箱37℃，培养48h后，用移液枪将96孔板中液体洗净后每孔加入MTT(1mg/ml)30μl，置CO2培养箱37℃培养4h，弃去上清，每孔加入DMSO 150μl，置摇床摇匀30min，用酶标仪在492nm下检测，利用SPSS统计软件，计算细胞死亡率，求取IC50。
试验结果表明，不同浓度的化合物Rosellichalasin和Cytochalasin E对用于试验的人结肠癌细胞(RKO)有不同程度的抑制作用，并且呈一定的剂量依赖关系，IC50值详见表2。
表2不同浓度的Rosellichalasin和Cytochalasin E对结肠癌细胞RKO的抑制率
Claims (7)
1.一种嗜盐曲霉菌F1，其特征在于：嗜盐曲霉菌F1(Aspergillus sp.F1)，保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学内)，保藏号为：CCTCC NO：M 2011277，保藏日期为：2011年8月4日。
2.一种按权利要求1所述的嗜盐曲霉菌F1的应用，其特征在于：将所述嗜盐曲霉菌F1发酵培养于F1的液体发酵培养基中发酵培养，所得发酵物经纯化分离即得到细胞松弛素类化合物Rosellichalasin和Cytochalasin E。
3.按权利要求2所述的嗜盐曲霉菌F1的应用，其特征在于：将所述嗜盐曲霉菌F1发酵培养于F1的液体发酵培养基中于28-30℃静止发酵培养25-30天所得发酵物经纯化分离即得到细胞松弛素类化合物Rosellichalasin和Cytochalasin E。
4.按权利要求2或3所述的嗜盐曲霉菌F1的应用，其特征在于：所述发酵物经纯化分离为将发酵培养后的发酵物的菌丝体和发酵液过滤分离，将菌丝体用其2倍体积乙醇浸提4-5次，再用过量的乙酸乙酯萃取10-15次，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏，然后采用硅胶柱层析、重结晶和Sephadex LH-20凝胶柱层分离纯化，即分别得到Rosellichalasin和Cytochalasin E。
5.按权利要求4所述的嗜盐曲霉菌F1的应用，其特征在于：将所述浸膏用乙酸乙酯溶剂溶解后，加200-300目硅胶搅拌，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为溶剂进行梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯比例为2∶1(v/v)洗脱液，经TLC检测收集Rf＝0.575组分，洗脱组分减压浓缩至干，再在正己烷-乙酸乙酯比例为1∶1(v/v)中重结晶，收集无色针状晶体Rosellichalasin；
或收集石油醚-乙酸乙酯比例为1∶2(v/v)洗脱液，经TLC检测收集Rf＝0.35组分，洗脱组分减压浓缩至干，再在己烷-丙酮比例为1∶1中重结晶，收集无色针状晶体Cytochalasin E；
将上述所得无色针状晶体分别经Sephadex LH-20柱层析，用甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干，分别得白色无定形物。
6.按权利要求5所述的嗜盐曲霉菌F1的应用，其特征在于：所述石油醚-乙酸乙酯梯度为100∶0-0∶100(v/v)；正己烷-乙酸乙酯比例为1∶1(v/v)；己烷-丙酮比例为1∶1(v/v)。
7.按权利要求2或3所述的嗜盐曲霉菌F1的应用，其特征在于：所述嗜盐曲霉菌F1的液体发酵培养基成分为：葡萄糖2.0％(W/V)，海盐6.0％(W/V)，马铃薯200克，加适量水煮沸30分钟，4层纱布过滤，滤液用蒸馏水定容至1升。
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