CN105602856B - 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的黑曲霉（Aspergillus niger）An‑19菌株、用途和发酵生产方法。黑曲霉（Aspergillus niger）An‑19菌株，保藏编号为：CCTCC M 2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年11月11日。本发明所涉及的An‑19菌株筛选自自然发酵的稻谷，经形态特征和18S rDNA基因序列分析，鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。经培养基配方和培养条件优化后，5 L发酵罐发酵116 h，Lovastatin产量可达267.02 mg/L。
Description
技术领域
本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株、用途和发酵生产方法。
背景技术
黑曲霉（Aspergillus niger）是在自然界广泛存在的一种丝状真菌，属半知菌门、丝孢纲（Hyphomycetes）、丛梗孢目（Moniliales）、丛梗孢科（Moniliaceae）。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，生长适宜 pH 为3~7。是重要的工业发酵菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。也是美国食品药品监督局（FDA）认定的GRAS（Generally Regarded As Safe）菌株之一，在有机酸、工业酶制剂方面应用广泛。此外有些菌株还会产生具有重要应用价值的生理活性物质如Lovastatin等。
1980年，Alberts等从土曲霉（Aspergillus terreus）中提取到称为洛伐他汀（Lovastatin）的化合物。Lovastatin是降血脂的他汀类药物，具有抑制体内生物合成胆固醇的关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG）的活性，可用于治疗心血管疾病。美国和日本等国家通过发酵的方式开发出一系列的Lovastatin药物，但我国对降脂曲霉的研究生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因主要是缺乏优良的生产菌株和适宜的发酵工艺。因而筛选出高产Lovastatin的曲霉菌株并对其发酵工艺进行优化，具有良好的理论意义和应用前景。
本发明所筛选的黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株，具有高产Lovastatin、生长速度快、培养方法简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为26℃条件下，An-19菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，5 L发酵罐发酵116 h，Lovastatin产量可达267.02 mg/L。
发明内容
针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株的缺乏等的问题。本发明的目的是提供1株高产Lovastatin黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株和发酵生产Lovastatin的方法。
本发明所述黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCC M2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，中国武汉大学。保藏日期为：2015年11月11日。
黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，后变成黑褐色粉粒状，15 d菌落直径达60 mm，有环形沟纹；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6 μm~8 μm的分支状；分生孢子头丰富，黑褐色，球状，直径150 μm～350 μm；分生孢子梗茎长短不一，壁较薄，光滑黄褐色；顶囊膨大成球形，双层小梗；分生孢子呈褐色球形或近球形，表面粗糙，直径4~5 μm×4~4.5 μm。
黑曲霉An-19菌株用于产生洛伐他汀（Lovastatin）的应用。黑曲霉An-19菌株的发酵培养条件为pH 5.0~6.0，温度20~30℃。
本发明所涉及的An-19菌株筛选自自然发酵的稻谷，经形态特征和18S rDNA基因序列分析，鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。经培养基配方和培养条件优化后，5 L发酵罐发酵116 h，Lovastatin产量可达267.02 mg/L。
高产洛伐他汀（Lovastatin）的发酵方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）用接种针挑少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2~4d；
2）取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2~4d，制得一级种子；
3）在种子培养液中，按种子培养液质量2~10%加入一级种子，摇床培养1~3d成二级种子；
在发酵培养基中，按发酵培养基质量10~20%接入二级种子，发酵培养时间为110 h~120 h。
作为优选，发酵培养条件为pH 5.0~6.0，温度20~30℃。
作为优选，发酵培养的发酵罐搅拌桨转速200 r/min，通气量120 L/h，罐压0.1MPa~0.5 MPa。
作为优选，一级种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%、pH 5.5~6.0。
作为优选，二级种子培养基：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、NaNO3 0.1%、pH 5.5~6.0。
作为优选，发酵培养基：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO3 0.2%、KH2PO4 0.1%、ZnSO4 0.2%、pH 5.5。
取上述制得发酵液10 mL，加甲醇40 mL（按1:4的比例），超声处理20 min，50℃水浴2 h，3000 r/min离心3 min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，可达220 mg/L~ 270 mg/L。黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株5 L发酵罐发酵110 h~120 h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin，与滤液混合；用远藤章教授方法提取Lovastatin，蒸干后得微黄色块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明Lovastatin提取物结构与Lovastatin标准品一致。
黑曲霉在食品生产中已获得了长期的实践证明，其生产和应用均不存在安全隐患，An-19菌株可用于Lovastatin的生产，是较有潜力的工业菌株。
附图说明
图1 An-19菌株PDA培养基上培养15 d菌落正面。
图2 An-19菌株PDA培养基上培养5 d分生孢子头生长的显微特征（100 X）。
图3 An-19菌株分生孢子头显微特征（呈球状，200 X）。
图4 An-19菌株分生孢子显微特征（400 X）。
图5 An-19菌株18S rDNA基因序列（1302 bp） 。
图6 基于16株曲霉属（Aspergillus）18S rDNA基因序列建立的An-19菌株系统发育树 。
图7 An-19菌株在5 L发酵罐中的生长曲线和Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。
图8 An-19菌株发酵液中Lovastatin提取物外观（10 X）。
保藏声明
黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCC M 2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年11月11日。
具体实施方式
下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。
实施例1 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株的筛选和鉴定
1 培养基
① PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%，水1 L，pH 5.5~6.0。用于曲霉菌株的分离纯化和鉴定。
② PD培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1 L，pH 5.5~6.0。用于高产Lovastatin曲霉菌株的筛选。
实验方法
2.1 曲霉菌株的分离纯化
从不同生境收集的自然发酵样品表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面，26℃培养24 h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3 d产生孢子后，显微镜观察具有曲霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的曲霉纯菌株。将分离纯化获得的曲霉菌株编号保存于25%甘油中，置于4 ℃冰箱备用。
高产Lovastatin曲霉菌株的筛选
用高效液相色谱法（HPLC）检测曲霉各菌株发酵液中Lovastatin产量进行筛选。曲霉各保存菌株26℃ PDA平板培养3 d后，用打孔器取1菌饼（直径0.8 mm）转接种于PD培养液中，26℃、200 r/min摇床培养7 d。取发酵液1 mL，加甲醇4 mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2 h，3000 r/min 离心3 min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，利用HPLC法检测Lovastatin产量，筛选高产Lovastatin的曲霉菌株。色谱条件：Agilent Prep-C18 液相色谱柱，波长：λ = 237 nm。
菌株的鉴定
An-19菌株PDA培养基平板上26℃培养5 d，显微镜观察An-19菌株的菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、分生孢子等的形态特征。
提取An-19菌株的基因组DNA，扩增18S rDNA基因序列，送上海生物工程公司测序。根据形态特征和18S rDNA基因序列，参考曲霉属《The Genus Aspergillus》分种检索表，确定分类地位。
实验结果
3.1曲霉菌株的获得和高产Lovastatin曲霉菌株的筛选
通过分离纯化从各地不同生境收集的自然发酵样品（食品、土壤、有机质等）中分离纯化共获得256株曲霉纯菌株。
利用高效液相（HPLC）法对256株曲霉纯菌株发酵液进行Lovastatin产量检测，经筛选获1株Lovastatin产量较高的曲霉菌株，编号为An-19菌株，该菌株分离自自然发酵的稻谷。
菌株的鉴定结果
An-19菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，后变成黑褐色粉粒状，15 d菌落直径达60 mm，有环形沟纹（附图1）；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6 μm~8 μm的分支状；分生孢子头丰富，黑褐色球状，直径150 μm～350 μm（附图2）；分生孢子梗茎长短不一，壁较薄，光滑黄褐色；顶囊膨大成球形，双层小梗（附图3）；分生孢子呈褐色球形或近球形，表面粗糙，直径4~5 μm×4~4.5 μm（附图4）。
18S rDNA基因序列分析结果表明，其长度为1302 bp（附图5），与黑曲霉（Aspergillus niger）（附图6）。根据An-19菌株的形态特征和18S rDNA基因序列，结合曲霉属（Aspergillus）分种检索表，将An-19菌株鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。
实施例2 An-19菌株在5 L发酵罐中的生长曲线、Lovastatin的产生和制备
1 菌株：An-19曲霉菌株。
培养基
① PDA培养基：配方同实施例1。
② PD培养液：配方同实施例1。
③ 一级种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%、pH 5.5~6.0。
④ 二级种子培养基：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO3 0.1%、pH 5.5~6.0。
⑤ 发酵培养基：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%，NaNO3 0.2%、KH2PO4 0.1%、ZnSO4 0.2%、pH 5.5。
实验方法
3.1 An-19菌株的培养
用接种针挑少量An-19菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3 d；取平皿中1菌饼（直径0.8 mm）接种于PD培养液中，摇床培养3 d，制得一级种子；在种子培养液中，按6%加入一级种子，200 r/min摇床培养2 d成二级种子；在5 L发酵罐中按15%接入二级种子进行发酵培养。
发酵培养条件：26℃、pH 5.5、转速200 r/min，通气量120 L/h，罐压0.1 MPa~0.5MPa。
菌丝干重的测定
1.5 mL空离心管放于在85℃的烘箱中烘干取出，称取空离心管质量为m；每管吸取1 mL培养液，在4 ℃，10000 r/min离心10 min，弃上清；加无菌蒸馏水洗3次，10000 r/min离心10 min，弃上清，放入85℃烘箱中烘至恒重，称取质量为M；菌丝干重质量为M-m。每隔4 h取1 mL An-19菌株发酵液测定菌丝干重。以取样时间为横坐标，An-19菌株菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线。
产量随发酵时间变化曲线分析
每隔4 h取发酵液1 mL，加甲醇4mL（按1:4的比例），超声处理20 min，50℃水浴2h，3000 r/min 离心3 min，取上清液，经0.45 μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，以培养时间为横坐标，An-19菌株的Lovastatin产量为纵坐标，绘制An-19菌株Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。
发酵液中Lovastatin的分离纯化和鉴定
An-19菌株5 L发酵罐发酵110 h~120 h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin成分，与滤液混合；用远藤章教授方法分离纯化Lovastatin，蒸干后得晶体；将晶体样品分别溶于甲醇和氘代氯仿中，核磁共振波谱技术分析鉴定。
实验结果
4.1An-19菌株的生长曲线
每隔4 h取样测定菌丝干重，An-19菌株生长曲线见图7。An-19菌株0 ~20 h生长速度慢，为迟缓期；24 h~68 h快速生长，菌体量大增，为对数生长期；发酵至72 h后，长势趋于平缓，菌体量达到最高，为稳定生长期，菌丝干重达260.5 g/L；104 h后出现泡沫，进入衰亡期。
发酵液中Lovastatin产量随发酵时间变化曲线
每隔4 h取样用HPLC法测定An-19菌株发酵液Lovastatin产量，Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线见图7，发酵至116 h后，发酵液中Lovastatin产量不再增高，最大值为267.02 mg/L。
发酵液中Lovastatin提取物及其鉴定
用远藤章教授方法提取Lovastatin，得到微黄色块状晶体（附图8）；用核磁共振波谱技术对Lovastatin标准品和发酵液中Lovastatin提取物分析比对，结果表明Lovastatin提取物结构与Lovastatin标准品一致，纯度较高。
Claims (3)
1.高产洛伐他汀（Lovastatin）的发酵方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）用接种针挑少量菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2~4d，所述的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为：CCTCC NO：M 2015673，保藏日期为：2015年11月11日；
2）取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2~4d，制得一级种子；
3）在种子培养液中，按种子培养液质量2~10%加入一级种子，摇床培养1~3d成二级种子；
4）在发酵培养基中，按发酵培养基质量10~20%接入二级种子，发酵培养时间为110h~120h；
其中，所述一级种子培养基：马 铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%、pH5.5~6.0；
二级种子培养基：乳 糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO30.1%、pH5.5~6.0；
发酵培养基：乳糖 18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO30.2%、KH2PO40.1%、ZnSO40.2%、pH5.5。
2.根据权利要求1所述的高产洛伐他汀的发酵方法，其特征在于：发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。
3.根据权利要求1所述的高产洛伐他汀的发酵方法，其特征在于：发酵培养的发酵罐搅拌桨转速200r/min，通气量120L/h，罐压0.1MPa~0.5MPa。
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