CN1827633A - 从蝉拟青霉培养物中提取n6－（2－羟乙基）腺苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明名称为从蝉拟青霉培养物中提取N⁶－(2－羟乙基)腺苷的方法。本发明包括从自然界分离选育出生活力强、代谢活性物质产量高、质量好的蝉拟青霉新菌株APC－20；提出利用该菌株进行产业化固体培养或液体培养进行发酵生产的方法；进而从该发酵产品中提取所含镇痛化合物(其提取得率为0.36％)及各有效部位与制备成多种剂型镇痛药物的方法；该化合物用小白鼠扭体法测定有99％的镇痛率。该化合物镇痛机理不同于目前常用的阿片类镇痛剂，不具有成瘾性，安全，有较大的开发应用前景。

Description

从蝉拟青霉培养物中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法

本申请是原申请日：2004年10月30日，申请号：200410094511.0，发明创造名称为“蝉拟青霉新菌株的人工培养及其镇痛化合物的提取与利用”申请的分案申请。

                            技术领域

本发明涉及虫草真菌发酵物有效部位的提取方法领域，尤其是涉及一种蝉拟青霉新菌株APC-20的人工固体或液体发酵培养物，从中提取镇痛化合物N⁶-(2-羟乙基)腺苷的方法。

                            背景技术

蝉花自古以来是一种药用价值很高的珍贵中药材，它是由蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)(属虫草属)寄生于蝉若虫的复合体。以往人们主要采集稀有的天然蝉花用于各种保健品或作为配伍用药材以及滋补药膳。但天然蝉花已越来越少，且产量低，一年只能采收一次，同时产品质量受环境影响而参差不齐。自然界现有的蝉拟青霉菌存在有长势、产量、质量不一的问题，不能适应工业化生产的需要；并有文章报导认为(冯立马，上海应用技术学院学报(自然)2002年02期)，把该天然菌种直接用来进行人工固体培养发酵一般长不出子实体(孢梗束)；而用来工业化液体发酵时存在工艺不配套，菌丝体产量低，品质不佳等问题。这既不能满足中医临床用药对孢梗束的大量需求，也制约了对蝉拟青霉菌代谢产物的产业化深加工开发利用。

虫草是一类重要的昆虫病原真菌，其代谢产物具有多样性及多种药理作用等特点，最早报道虫草对中枢神经系统有作用的是Brewster和Alsberg，他们给家兔及小鼠静脉或皮下注射冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sscc.)浸提液证明对中枢抑制有作用。国内张士善等也报道了冬虫夏草浸剂有镇静及催眠作用(张士善药学学报，1991，26[5]：326-330)。本研究组陈祝安等报道蝉花及其人工培养物蝉拟青霉(Paecilomyces Cicadae)，以25g生药/Kg剂量注射小鼠腹腔可抑制由醋酸所致的扭体反应，镇痛率达95％以上，其效果相当于10mg/Kg吗啡(陈祝安等，蝉花的人工培养及其药理作用真菌学报，1993，12[2]：138-144)。此外，细脚拟青霉(Paecilomyces teniupes(Peck)Samson)也有类似作用。李淑芳等报道用小鼠扭体法实验观察到，在所试古尼虫草(Cordyceps Gunnii(Berk.)Berk.)菌丝体浸提液，热板刺激法15小时后镇痛阈延长为79％，其镇痛强度与杜冷丁相似(李淑芳，鲍淑娟贵阳医学院学报，1990，15(1)：25～28)。虽然国内外报道了虫草及其无性型具有镇痛作用，但尚未揭示其镇痛作用的化学成分。张士善等研究认为冬虫夏草的镇静作用是由氨基酸，尤其是色氨酸所引起。朱振元报道古尼拟青霉(Paecilomyces Gunnii Liang)菌丝体镇痛作用的活性物质是分子量不高于12000的多肽(朱振元，梁宗琦，常胜军等古尼虫草的生物活性物质I含肽镇痛组分的分离及性质微生物学报2002。42(6)：722～726)。国外也有报道从粉被虫草(Cordyceps pruinosa Petch)中分离提取到N⁶-(2-羟乙基)腺苷及其结构式，由于该化合物的特有性，已用它作为冬虫夏草制品的质量控制指标之一，其生物学用途一般作为Ca2+拮抗剂和肌肉收缩活性，但该化合物的镇痛作用未见报道(Tsutomu FuruyaN⁶-(2-HYDROXYETHYL)ADENOSINE，A BIOLOGICALLY ACTIVECOMPOUND FROM CULTURED MYCELIA OF CORDYCEPS AND ISARIASPECIES，Phytochemistry，Vol.22.No.11，pp.2509-2512，1983)。综上所述，有关蝉拟青霉的镇痛活性物质及其制备方法与利用尚未见报道，因此明确蝉拟青霉具镇痛作用的化学成分及其提取方法，进而开发成新型安全的镇痛药物具有重要的社会和经济效益。

                            发明内容

本发明针对上述不足，提出以下发明目的，一是从自然界分离并人工选育生活力强、代谢活性物质产量高、质量好的蝉拟青霉新菌株；二是研究提出利用该蝉拟青霉新菌株进行产业化固体培养和/或液体培养，生产高产、优质的孢梗束、菌丝体及其代谢产物与培养基混合物的制备方法；三是明确蝉拟青霉菌发酵产物中所含镇痛化合物的特性及其结构；四是提出从蝉拟青霉菌发酵产物包括孢梗束、菌丝体及其代谢产物与培养基的混合物中逐步提取具镇痛活性的各有效部位及其纯品的方法；五是进一步将以上提取物制备成多种剂型的镇痛药物。

本发明目的是通过下述方案得以实现的。

菌株的分离、选育、鉴定与保藏：

从浙江温州不同立地条件、不同生态环境采集标本，从中选择子实体大，孢梗束粗壮，无污染菌者进行分离纯化，分别予以编号，并进一步通过单孢分离方法，建立了25株菌株保存。其中从022009号起始菌中，分离选育到单孢优株APC-20菌株，经固体培养基发酵菌丝生长势，液体培养基菌丝体干重及多糖含量三个指标的测试表现最好，该菌株经中国科学院微生物研究所复核鉴定为蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)，并通过卫生部菌株安全性毒力实验为无毒安全菌株，该菌种在40％含水量的无菌土，4℃冰箱中保存544天未见失活。

本发明的蝉拟青霉APC-20菌株已于2004年03月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO：1104。蝉拟青霉APC-20菌株(CGMCC NO：1104)具有以下微生物学特性：

1、形态特征：

(1)、孢梗束(蝉花)橙黄色，单生或成丛，30-50×2-5mm，顶尖或反复分枝成花菜状的头，并产生大量粉状分生孢子。

(2)、菌株形态特征在PDA培养基上，菌丝灰白到浅黄，茸毛状。分生孢子梗分枝，78-203×2.9-50mm，通常2-5个瓶梗簇生于短枝上，成轮状排列。瓶梗基部近球形膨大，4.2-7(-13.5)×2.3-3.5(-5.2)mm，梗颈细长，向基式产生分生孢子链。分生孢子圆柱状或长卵形，无色单孢，壁光滑，3.5-9×1.5-3.7mm，少数弯曲。

2、培养特征：

在PSA培养基上生长快，24℃培养14天，菌落直径60-72mm。菌丝体灰白或浅黄，茸毛状。有时表面出现轮纹或放射线。产孢后，菌落外貌显粉质状，背面无色，渗出液无色，水珠样。

在Czapek培养基上生长慢而局限，14天直径为49-55mm。菌落平展，菌苔薄，灰白，茸毛状密致，背面无色，未见渗出液产生。

在蛋白胨蔗糖琼脂上生长好，14天直径54-70mm。菌落表面有隆起环线，边缘有放射状沟纹，肉色，背面深褐色，未见渗出液。

在麦粒或麸皮+玉米+谷糠等自然培养基上，菌丝体茸毛状至絮状，灰白至浅黄。15天形成菌核，并产生孢梗束。孢梗束掌状或圆柱状，橙黄色或蛋黄色，20-30×3-5mm，长的可达80cm。一般30天后产生大量分生孢子，以后孢梗束逐渐枯萎倒伏。

3、碳，氮源利用：

(1)碳源利用  测定了葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、菊糖、山梨糖、鼠李糖、乳糖、甘油等10种C源，除菊糖、山梨糖、鼠李糖、乳糖不能利用外，其余均能利用。但用葡萄糖作C源，孢子产量极显著高于其它C源(t＞t_0.01)，用果糖作C源，菌丝体产量显著高于其它C源(t＞t_0.05)。

(2)氮源利用  测定了KNO₃、NaNO₃、(NH₄)₂SO₄、(NH₄)₂HPO₄、NH₄NO₃、(NH₂)₂CO、NH₄CL、NaNO₂、H₂NCSNH₂含硝基、氨基、亚硝基等9种N源，以KNO₃利用为好。但不能利用NaNO₂和硫脲，对硝基氮的利用有比氨基氮好的趋势。

该菌对蔗糖、葡萄糖以及N源中的KNO₃利用尽好，但对C源量的要求较敏感。当C源量维持在2％的正常生长发育水平上，提高N源或降低N源，对孢梗束生长和产孢量影响不大；但N源固定在正常生长水平上，将C源从2％降低到0.5％，发现不产生孢梗束或仅极少孢梗束。反之，将C源提高10陪(20％)，则孢梗束多而不易老化，分生孢子有推迟产生现象。

4、人工培养品多糖含量测定：

天然蝉花多糖含量为4.40％，液体培养品多糖含量为11.4％，固体培养品多糖含量为12.8％。

此外，将APC-20菌株与亲株22009(对照)经固体培养与液体培养试验，在长势、孢梗束产量，菌丝体干重等方面存在较大区别：

表1固体培养基上生长状况

菌株	生长状况	平均孢梗束长度(mm)	始发孢梗束时间(天)	孢梗束老化倒伏时间(天)
					APC-20对照(亲株)(22009，生长一般)	菌被厚孢梗束粗壮，白或浅黄，长势旺，无渗出液孢梗束长势差，柔弱，产孢量较多，见水株状渗出液	78.0×3.5155.47×3.10	715	4022

表2液体培养基上菌丝体干重

菌株	菌丝体干重(g/200ml)
		APC20对照(022009，生长一般)	2.761.51

注：

摇床培养转速110r/min，马铃薯-蔗糖培养液，培养10天。

菌丝体干重测定取发酵液100ml用100目纱滤网过滤，每次取样3次重复，取其中的滤渣菌丝体于CT-C-O型热风循环烘箱内70℃烘干至恒重，换算成每100毫升发酵液中菌丝的干重。

使用本发明菌株进行人工固体发酵或液体深层发酵的方法，包括在含有碳源、氮源，无机物和其它营养物的培养基中培养蝉拟青霉APC-20菌株的步骤、工艺，直至在固体培养基的表层，形成子实体(孢梗束)，在其内层也同时形成了大量的菌丝体及其有效代谢产物；在液体培养基中形成菌丝体的同时，也积累了菌丝体的有效代谢产物，与培养基一起成为具有进一步开发价值的培养产物。

A、固体培养发酵方法：

1、培养条件

(1)菌种制备：

①、斜面菌种的制备  4℃冰箱内保存的APC-20菌株移植到PSA培养基上培养7天，活化待用。

②、一、二级种子的制备  一级种子的制备：每支摇瓶(500ml三角瓶装200ml种子培养基)移接入斜面菌种上的分生孢子粉3环，置DHZ-C振荡器内25℃，120r/min转速下培养4天。二级种子的制备：10L发酵罐中装7.5L(以75％容积计算，下同)二级种子培养基，121℃灭菌30min后冷却至24℃，接入一级种子，接种量10％(下同)，控制发酵条件(24℃，罐压约0.01-0.05Mpa，空气流量约0.75m³/h)，发酵48h。

(2)培养基：

斜面培养基：采用PSA或Richard培养基；

一级种子培养基：PSA固体培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g、水1000ml)或Richard培养基(KNO₃10.0g、KH₂PO₄5.0g、MSO₄.7H₂O2.5g、FeCl₃0.02g、蔗糖50.0g、水1000ml)；

二级种子培养基：PSA液体培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、水1000ml)；固态发酵用培养基：纯麦粒或麸皮(2-4)∶玉米(1-3)∶谷糠(1-3)的重量比配制，优选配方是麸皮2∶玉米1∶谷糠1并加2％果糖；

(3)接种量  封闭式培养，接种量用1％-5％，优选为3％；开放式培养，接种量为5％-20％，优选为10％；

(4)培养时间  斜面种培养时间以5-7天为宜。1-2级种子采用液体摇床或种子罐培养，龄期2-3天为好，接种后生长旺。固体培养时间20-30天，一般35天后孢梗束开始老化倒伏，菌丝产生自溶现象。

(5)培养温度  斜面种以及种子培养阶段，6-38℃均可生长，其中最适为24-25℃。固体发酵的菌丝体生长阶段温度以24-25℃为宜，孢梗束始发期温度应控制在20-22℃。

(6)pH  pH6.5左右。该菌要求偏酸性，在碱性条件下，菌丝容易老化色变。

(7)光灯光、自然光均能刺激孢梗束生长，暗培养不产生孢梗束，或孢梗束量少，柔弱、色变。

(8)培养器和培养室封闭式培养容器可用蘑菇瓶(500mL)或塑料制品ZP4瓶(500ml)或聚丙烯塑料袋来培养。开放培养容器可用金属或陶瓷浅盘，但高度要求在6cm左右。开放式培养室要求有温湿调控以及通气(无菌过滤)、光照等设备，并便于消毒灭菌，洁净度达到100级。

2、培养方法和步骤

用斜面种接种一级种子，500ml三角瓶摇床培养(72h，110-120r/min)；

二级种子采用10L种子罐制备(24℃，罐压0.04-0.05Mpa，空气流量约0.75m³/h培养36h)；采用70L种子罐制备(24℃罐压约0.05Mpa，空气流量1.3-1.6m³/h)培养36h，就可用来接种。接种量为1-5％然后置室内培养，前期培养温度可控制24-25℃，孢梗束始发后应控制在20-22℃，培养20-30天，可采收。

用曲盘作开放式培养时，灭菌后培养料厚度可控制在1.5-3.0cm左右，接种量为5-20％。接种后料面盖二层灭菌的湿纱布，纱布上再覆一层灭菌过的聚丙烯薄膜。整个培养过程要注意保湿并保持清洁。孢梗束生长始期后可揭开纱布与聚丙烯薄膜(接种后一周)，20-25天始采收，采收后孢梗束晒干或80℃烘干。

B、液体培养发酵方法

1、培养条件：

(1)菌种种子制备：制法同固体培养；

(2)培养基：

斜面母种培养基：PSA或PDA培养基：马铃薯200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、琼脂20g、水1000mlPH自然；

一级种子培养基：PSA培养液体培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、水1000ml；

二级种子培养基：PSA培养液：马铃薯200g、蔗糖20g、水1000ml；

生产发酵培养基：马铃薯20％，果糖2％，蛋白胨0.1％，天冬氨酸0.01％，KH₂PO₄0.15％，MgSO₄0.05％，植物油0.1-0.15％、水77.54-77.59％；

(3)接种量  一级种子或二级种子接入二级培养基或生产发酵液的接种量为10％；

(4)发酵温度  温度的变化对菌丝体的生长影响较明显，18-34℃均可生长，其中23-26℃生长较好，优选是24-25℃，最佳为24℃，菌丝体生长最快，干重量高(见表3)；

表3发酵温度对蝉拟青霉菌丝生长的影响

(5)PH值  APC-20菌株在PH4-12均能正常生长发育，优选PH为6.5，该范围菌丝体干重产量最高；也可采用自然PH值，便于生产操作；

(6)发酵时间  以菌丝得率为指标，放罐时间选择在84h左右为最优。

2、培养方法与步骤：

采用70L发酵罐装52.5L发酵培养液，其中添加消泡剂植物油0.1-0.15％，121℃灭菌30min后冷却至24℃接入培养好的二级种子，控制发酵条件(罐压约0.05Mpa，空气流量约1.3-1.6m³/h，温度24℃左右)，发酵84小时后放罐。

C、将以上固体培养物孢梗束和液体培养物菌丝体与天然蝉花主要成份作如

下比较分析：

1、糖醇类成份比较  经硅胶GTLC层析，以异丙醇∶乙酸乙酯∶水(83∶11∶6)为展开剂，0.5％高锰酸钾及0.5％联苯胺醇液为显色剂，二者出现的蓝底黄斑点与甘露醇的Rf值一致。

2、有机酸类成份比较  经纸层层析，以正丁醇∶冰醋酸∶水(3∶1∶1)为展开剂，溴甲酚绿为显色剂，培养物出现蓝底黄点比天然产物多3个斑点。若以正丁醇∶乙醇∶氨水∶水(4∶1∶2∶2)为展开剂，溴酚蓝为显色剂，两者出现的斑点、Rf值一致。

3、生物碱类比较  经硅胶GTLC层析，以氯仿∶甲醇(9∶1)为展开剂，出现橙红色斑点较天然产物少1个。若以正丁醇∶乙醇∶水∶氨(4∶1∶2∶2)为展开剂，两者出现的斑点和Rf值一致。

4、甾醇类成份比较  经硅胶GTLC层，以茴香醛醋酸硫酸液显色后置110℃加热10分钟，两者显示色斑不少于10个，其斑点颜色及Rf值均基本一致。

此外，两者都含有15种相同水解氨基酸和12种微量元素。由此可见，蝉拟青霉人工培养物和天然蝉花化学成份基本相同，均含有脂肪类、蛋白质、氨基酸、甾醇类、有机酸和生物碱等有效成份。

一种从蝉拟青霉新菌株APC-20人工发酵产物中提取的镇痛化合物

包括从固体或液体培养发酵生产的孢梗束、菌丝体及其代谢产物与固体培养基混合物和/或菌丝体及其代谢产物与液体培养基混合物中提取获得的具有镇痛活性的化合物，该化合物纯品CYDd-2-A经RP-HPLC分析(中国科学院上海药物研究所)、红外谱、ESI高分辨、ESI电喷雾分析、H谱、¹³C核磁共振谱、碳氢关系(HMQC)核磁共振谱(中国科学院上海有机化学研究所)及傅里叶变换(FTMS)质谱解析，明确该化合物化学名称为N⁶-(2-羟乙基)腺苷【N⁶-(2-hydroxyethyl)-adenosine】，有99％的镇痛率(用小白鼠扭体法测定)，具有下述理化特性：

(1)分子量：311.297；

(2)准确分子量：311.12297；

(3)分子组成：C46.30％；H5.50％；N22.50％；O25.70％；

(4)分子式：C₁₂H₁₇N₅O₅；

(5)外观：白色粉末；

(6)紫外光谱：λmax＝213.5nm，267nm(logε＝4.19，4.20)[乙醇中]；

(7)红外光谱：IRbands，3300cm^-1(OH，NH)和1625cm^-1(-C＝N-)；

(8)熔点：193℃；

(9)性状：甲醇培育针晶；

(10)溶解性：溶于水，甲醇；

(11)酸性、中性和碱性的辨别：弱碱性物质；

(12)显色反应：硫酸—香兰醛显色；硫酸∶5％苯酚水(体积比5∶1)显色；茚三酮不显色；

(13)薄层色谱：Rf值0.38，展开溶剂：氯仿∶甲醇(体积比)＝5∶1；

(14)酸碱稳定性：PH＝3，活性不变；

(15)热稳定性：100℃下10分钟，活性稳定；

(16)酶稳定性：不被胃蛋白酶降解；

(17)结构式：

C₁₂H₁₇N₅O₅Exact Mass：311.12Mol.Wt.：311.29C，46.30；H，5.50；N，22.50；O，25.70

2-[6-(2-Hydroxy-ethylamino)-purin-9-yl]-5-hydroxymethy

            l-tetrahydro-furan-3，4-diol

在提取上述镇痛化合物过程中，其各有效部位包括CYD、CYDd和CYDd-2也均含有该化合物，采用小白鼠醋酸扭体法测得镇痛率分别达95.25％，97.81％及98.20％。

一种从蝉拟青霉新菌株APC-20人工发酵产物中提取镇痛化合物的方法，包括从固体培养或液体培养发酵生产的孢梗束、菌丝体及其代谢产物与固体培养基混合物或菌丝体及其代谢产物与液体培养基混合物中提取CYDd-2-A，可按

以下顺序步骤，条件进行：

(1)原料粉碎：将固态原料或液态原料经80℃通风烘干后粉碎成200目粒径颗粒，备用；

(2)乙醇浸提：将粉碎原料与40％乙醇按1∶3(重量体积比)浸渍，经超声波提取与多次85℃水加热回流抽滤后，混合所提滤液，70℃旋转蒸发仪浓缩；

(3)溶剂分配：将浓缩液按2∶1比例(体积)，分别用二氯甲烷(CH₂Cl₂)乙酸乙酯(Ethyl Acetate)、正丁醇(n-Butyl Alcohel)分配，得CYA二氯甲烷部位、CYB乙酸乙酯部位、CYC正丁醇部位和CYD水相部位，将其中水相部位蒸干得CYD；

(4)CYD去除多糖：将CYD与95％乙醇按1∶3体积比混合，3600γ/min4℃离心15min，取上清液1后，在沉淀物中加适量水溶解，离心后去除沉淀，将上清液同上法重复2次，得上清液2、3，合并上清液1、2、3，旋转蒸干即为去除多糖后的CYDd；

(5)CYDd树脂分离：采用CDA-40型大孔树脂，经9cm×1.0m柱子吸附后，依次加水，50％乙醇，95％乙醇洗脱，将其中50％乙醇洗脱液蒸干得CYDd-2；

(6)CYDd-2柱层分离：采用Art.10626柱，洗脱液：甲醇∶水＝2∶8，得CYDd-2-A、CYDd-2-B、CYDd-2-C，将其中59～77管合并液，蒸干后呈淡黄色(为3.932min的大峰)即为CYDd-2-A；

(7)CYDd-2-A柱层析纯化  Sephedex LH-20Φ2cm，长50cm，溶剂为甲醇，纯化蒸干后得白色粉沫，即为镇痛化合物纯品CYDd-2-A.该化合物的最终提取得率为0.36％。(见实例7)。

在提取上述镇痛化合物过程中，其各有效部位可采用同样原料，经60～80℃烘干、粉碎、乙醇浸提、溶剂分配后可得CYD，去除多糖后可得CYDd，再经树脂分离、50％乙醇回收即得CYDd-2。

本发明的有益效果，一是选育获得了生长势强，人工发酵培养物(孢梗束，菌丝体)产量高，品质好的蝉拟青霉APC-20新菌株；二是本发明提出了应用APC-20菌株进行人工培养固体发酵生产子实体(孢梗束)的优化工艺及配套方法，从而实现了人工，周年，大批量生产品质优良(最高单株孢梗束干重达9.77克，平均长度达18.92mm)质量一致的传统名贵真菌中药蝉花的目标；三是本发明提出了应用该菌株进行人工培养液体发酵生产菌丝体及其代谢产物与培养液混合物的优化工艺及配套方法，使菌丝体干重产量由亲菌株的1.51g/200ml提高到APC-20菌株的2.76mg/200ml，最高的达到3.03mg/200ml，而且液体发酵还具有生产周期短(3-5天)，质量便于控制(工业化标准生产)，操作方便等优点；上述方法生产的产物所含糖醇类、有机酸类、生物碱类及甾醇类均与天然蝉花基本一致；四是本发明首次从蝉拟青霉中分离提取出N⁶-(2-羟乙基)腺苷【N⁶-(2-hydroxyethyl)-adenosine】，该化合物及其结构式虽与Tsutomu所报导的相同，但提取的生产菌种不同，并首次发现了该化合物具有镇痛作用，该化合物是通过与α受体结合抑制了神经递质释放产生镇痛作用，其机理不同于目前常用的阿片类镇痛剂，不具有成瘾性，纯品镇痛率高达99.00％，该纯品与提取过程中各有效部位可制成多种剂型，安全的镇痛药物，具有较大的开发应用前景；五是蝉拟青霉培养条件为23-26℃，较冬虫夏草菌类低温度、高海拔的要求为低，故本发明所提出的从菌种培养发酵到镇痛化合物提取的整套方法，具设计合理，切实可行，得率较高，成本低廉等特点。

                              附图说明

图1镇痛化合物CYDd-2-A及各有效部位提取工艺流程示意图

图2原料乙醇浸提流程示意图

图3CYD对胃蛋白酶稳定性测定示意图

图4CYD去除多糖流程示意图

图5CYDd-2-A RP-HPLC分析谱图

图6CYDd-2 RP-HPLC分析谱图

图7CYDd-2-A红外谱图

图8CYDd-2-A的ESI高分辨谱图

图9CYDd-2-A的ESI电喷雾分析谱图

图10H谱图-1

图11H谱图-2

图12¹³C核磁共振谱图-1

图13¹³C核磁共振谱图-2

图14碳氢关系(HMQC)核磁共振谱图-1

图15碳氢关系(HMQC)核磁共振谱图-2

图16傅里叶变换质(FTMS)谱图

                            具体实施方式

通过以下实施例将更详细说明本发明，以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。

实施例1：(固体培养发酵方法《1》)

取4℃冰箱内保存的APC-20菌株移植到斜面培养基上(注1)培养7天，活化待用；每支500ml三角瓶装200ml一级种子培养基(注2)，接入斜面菌种孢子粉3环，置DHZ-C振荡器内25℃，120r/min转速，培养4天为一级种子；在10L发酵罐中装7.5L二级培养基(注3)，121℃灭菌30min冷却至24℃，按10％接种量接入一级种子，24℃，罐压约0.04Mpa，空气流量约0.75m³/h，发酵48小时为二级种子。将固体培养基(注4)与水按1∶2拌匀后，一种方式可直接装入培养容器内，装料约占容量的2/5为宜，置高压蒸汽锅内，经121℃，0.11Mpa灭菌1.5小时后，冷却到20℃，按1.5％的接种量接入二级种子拌匀后进行封闭式室内培养，前期温度保持24℃，待孢梗束始发后降至21℃，培养20-30天，可采收；另一种方式，可将同法灭菌后的固体培养基装入边高约6公分的曲盘中，(料厚3公分)，按20％接种量接种拌匀后，在料面上复盖二层灭菌湿纱布及一层聚丙烯薄膜以保湿防蒸发，置经消毒，洁净，明亮室内进行开放式培养，温度同上，一周后孢梗束始发，揭开纱布与薄膜，培养20-25天可采收，采收后晒干或80℃烘干。

注1：斜面培养基，采用PSA或PDA培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g、水1000ml PH自然；

注2：一级种子PSA培养液，马铃薯200g、蔗糖20g、水1000ml；

注3：二级种子PSA培养液，马铃薯200g、蔗糖20g、水1000ml，加植物油1-1.5ml；

注4：固体发酵培养基，麸皮、玉米、谷糠，按3∶2∶2重量组份配比。

实施例2：(固体培养发酵方法《2》)

本实施例的固体发酵培养基为麸皮∶玉米∶谷糠按2∶1∶1配比；固体培养基干料与水按1∶2.9重量组份比例拌匀；

容器封闭式培养的二级菌种接种量为3％；曲盘开放式培养的二级菌种接种量为10％；

本实施例的培养基及其余工艺与步骤均同于实施例1。

实施例3：(固体培养发酵方法《3》)

以小麦麦粒为固体培养基，先将麦粒用水浸泡过夜，蒸熟(直至麦粒开裂)，装入容器或曲盘均占容积三分一为宜；容器封闭式培养的二级或三级菌种接种量为3％；曲盘开放式培养的菌种接种量为10％；其余培养工艺与步骤均同于实施例1。

实施例4：(液体培养发酵方法《1》)

本实施例菌种制备的斜面、一、二级种子培养基及方法基本同于实施例1，仅在二级种子培养基中加入植物油0.1％作为消泡剂；其发酵培养基也同于二级种子培养基；

本实施例采用70L发酵罐装52.5L发酵培养液，PH4.5，121℃灭菌30min后冷却至24℃，按10％接种量接入培养好的二级种子，控制罐压约0.05Mpa，空气流量1.3m³/h，温度24℃，发酵84小时后放罐即成。

实施例5：(液体培养发酵方法《2》)

本实施例二级种子培养基和生产发酵培养液中均加入0.15％植物油作消泡剂；PH为6.5；温度控制在26℃；空气流量为1.6m³/h；

本实施例的其余工艺与步骤均同于实施例4。

实施例6：(液体培养发酵方法《3》)

本实施例菌种制备的斜面、一、二级种子培养基及方法基本同于实施例1，生产发酵培养基为马铃薯20％，果糖2％，蛋白胨0.1％，天冬氨酸0.01％，KH₂PO₄0.15％，MgSO₄0.05％，植物油0.10.15％、水77.54-77.59％。

本实施例的其余工艺与步骤均同于实施例4。

实施例7：(镇痛化合物纯品提取方法1)

整个方法步骤按图1所示进行，将固体或液体发酵的蝉拟青霉产品(孢梗束或菌丝体及其代谢产物与培养基混合物)，经60～80℃烘干，粉碎成200目颗粒(称重525g)；—→将粉碎原料与40％乙醇按1∶3比例浸提，(浸提流程如图2)，合并滤液1、2、3，旋转蒸发仪70℃浓缩为1800ml；—→将浓缩液按2∶1比例(体积)，分别用二氯甲烷(CH₂Cl₂)、乙酸乙酯(Ethyl Acetate)、正丁醇(n-ButylAlcohel)分配，得CYA二氯甲烷部位、CYB乙酸乙酯部位、CYC正丁醇部位和CYD水相部位，分别蒸干，进行镇痛率测定；—→将水相部位CYD去除多糖，仪器：TH-1型梯度混合器(上海沪西机电厂)，LC-6离心机(上海离心机械研究所)，试剂：乙醇、乙醚和丙酮为国产分析纯(流程见图3)，得CYDc(多糖)与去除多糖后的CYDd，进行镇痛率测定；→将CYDd进行大孔树脂分离，采用CDA-40型大孔树脂南京化工大学生产，加样90g经9cm×1.0m柱子吸附后，依次加水，50％乙醇，95％乙醇洗脱，分别蒸干后得CYDd-1 65.904g，CYDd-211.094g，CYDd-30.494g，并进行镇痛活性测定；—→将CYDd-2LOBAR柱分离：采用Art.10626柱，BSZ-100自动部分收集器，1管/3min，15ml/管，压力500psi，流速8ml/min，洗脱液：甲醇∶水＝2∶8，每隔10管作RP-HPLC检测，相同的合并，得CYDd-2-A、CYDd-2-B、CYDd-2-C，其中CYDd-2-A为59～77管合并液，蒸干后呈淡黄色，为3.932min的大峰；CYDd-2-B为最后冲冼柱子部分；CYDd-2-C为1～56管，3.932min大峰前部分，经镇痛率测定CYDd-2-A上升为99.0％；—→将CYDd-2-A Sephedex LH-20纯化Sephedex LH-20Φ2cm，长50cm，溶剂为甲醇，纯化蒸干后得白色粉沫1.892克，即为镇痛化合物纯品，其提取得率为0.36％。

实施例8：(各镇痛有效部位的提取方法)

各镇痛有效部位的提取方法采用实施例7同样原料，经60～80℃烘干、粉碎后，乙醇浸提、溶剂分配得CYD，去除多糖后得CYDd，再经树脂分离、50％乙醇回收即得CYDd-2，各步骤具体方法同实施例7(见附图1)。

实施例9：(镇痛胶囊的制造)

以CYD、CYDd、CYDd-2或CYDd-2-A为原料，80℃烘干，粉碎过100目，均匀加入适量淀粉(100目)，测含量后，用胶囊机分装(5号胶囊壳)，使制成镇痛胶囊含CYDd-2-A 50mg/粒，成品检验合格后包装。

实施例10：(片剂的制造)

将原料药CYDd-2-A，以及微晶纤维素，乳糖分别粉碎过100目，按等量递加将上述三组分混匀，用8％淀粉浆混匀制成16目颗粒，通风干燥3-6小时(水分5％以内)，呈14目整粒后，加入羧甲基淀粉钠(80目)、硬脂酸镁(80目)混合均匀，测含量后冲压成片剂，毛重1.5g/粒，含有效成分50mg/粒，成品检验合格后包装。

实施例11：(注射用粉剂的制造)

在100级洁净环境下：将药物原料CYDd-2-A加水溶解，加针用活性肽，无菌过滤，喷雾干燥，粉碎过300目筛，分装于去除热源的无菌玻璃瓶中，100mg/瓶，立即加塞，铝盖密封。使用时用注射用无菌水溶解。

试验例1(镇痛活性各有效部位及化合物对动物镇痛率的试验)

实验动物：昆明小白鼠雌雄各占50％，体重25g/头左右，统一饲养3-4天，由中国科学院上海药物研究所动物试验中心提供。

镇痛测定方法：采用扭体法，处理剂量为5g生药/Kg体重，注射给药(Sc)，30-40分钟后腹腔注射0.7％乙酸，记录小白鼠10分钟内的扭体数，计算对0.7％乙酸产生的疼痛扭体反应的抑制率。

(1)提取物溶剂分配后镇痛率测定：

由表4可见，溶剂分配后镇痛活性主要集中在CYD部位。

表4不同溶剂部位对小白鼠的镇痛作用(扭体法)

样品

剂量(g生药/K体重)

小白鼠数(头)

镇痛抑制率(％)

生理盐水CYA(二氯甲烷部位)CYB(乙酸乙酯部位)CYC(正丁醇部位)CYD(水相部位)

-  Sc5  Sc5  Sc5  Sc5  Sc

188888

-23.2133.3358.4095.25**

注：^**P＜0.01水平显著；生理盐水为对照；

(2)CYD去除多糖后的镇痛率测定：

由表5可见，去多糖后的CYD即CYDd镇痛率显示最高，达97.81％，而多糖CYDc镇痛率为0。

表5    CYDa～d对小白鼠的镇痛作用

样品	剂量(g生药/K体重)	小白鼠数(头)	镇痛率抑制率(％)
				生理盐水CYDa(胃蛋白酶处理)CYDb(Buffer处理)CYDc(多糖)CYDd(去除多糖)	-    Sc5    Sc5    Sc5    Sc5    Sc	188888	-95.10**96.30**0.0097.81**

注：^**P＜0.01水平极显著

(3)CYDd经树脂分离后镇痛率的测定：

CYDd经树脂分离后，其中CYDd-2(50％乙醇部位)镇痛率最高(见表6)。

(4)CYDd-2柱析纯化后镇痛率的测定：

表6 CYDd-2～CYDd-2-C对小白鼠的镇痛作用(扭体法)

样品	剂量(g生药/Kg)	小白鼠数(头)	平均扭体数	镇痛抑剂率(％)
					生理盐水CYDd-2(树脂分离后)CYDd-2-A(纯化后)CYDd-2-BCYDd-2-C	-    Sc5    Sc5    Sc5    Sc5    Sc	188888	25.804.330.2523.7033.70	-98.20**99.00**8.100.00

注：^**P＜0.01水平显著；生理盐水为对照。

表6表明，纯化后的CYDd-2-A镇痛率达99％，说明该镇痛化合物纯度越高，活性越高。

试验例2(镇痛化合物对胃蛋白酶、胰蛋白酶及酸性稳定性试验)

胃蛋白酶购于美国HyClone-PIERCE公司。

PH＝3的Buffer配制：柠檬酸(0.1M 18.6ml)+柠檬酸钠(0.1M 1.4ml)。

试验流程如图4。

由表5可见，CYD不受胃蛋白酶的影响，胃蛋白PH4，30℃反应12h，不改变镇痛活性，CYDa镇痛率仍达95.10％，而且酸性下(PH3)稳定，即CYDb镇痛率达96.30％。

Claims (1)

1、从蝉拟青霉培养物中提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于以蝉拟青霉菌株APC-20人工固体或液体培养发酵产物孢梗束、菌丝体及其代谢产物与固体培养基混合物或菌丝体及其代谢产物与液体培养基混合物为原料，经60～80℃烘干、粉碎、乙醇浸提、溶剂分配、去除多糖、树脂分离回收、柱层析提纯，获得化合物N⁶-(2-羟乙基)腺苷纯品。

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