CN1215754A - 冬虫夏草发酵产物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备蝙蝠蛾拟青霉发酵产物的新方法,这种产物可用作食品添加剂和治疗药品。本发明还包含一种蝙蝠蛾拟青霉的新菌株和用此新菌株进行发酵的方法。蝙蝠蛾拟青霉发酵产物含有活性成分,其药理学和营养学性质与天然产的冬虫夏草相似。其药方及食品配方能用于治疗和预防多种疾病,包括高脂血疾病,心血管疾病,脑血管疾病,高血压,肺疾病,肾疾病,生殖功能紊乱及免疫功能紊乱。这些方剂也能用于维持老年人的最适健康和使病后恢复期患者恢复精力。

Description

冬虫夏草发酵产物的制备方法及其应用

本发明涉及一种制备冬虫夏草发酵产物的新方法，其所得到的虫草发酵产物能用作食品添加剂及/或治疗药物。本发明还涉及将此虫草发酵产物用于促进健康及治疗和预防多种疾病和机能失调的方法。

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)为一种天然存在的稀有生物，也是久享盛誉的名贵中药。它由真菌和昆虫两者所组成，存在于中国西北和西南部海拔3000-4000m山区的多草的土壤中。露在土壤表面部分为真菌的子实体，长3-6cm，色黑，形如刀刃。埋在土中的虫体部分长2.5-4cm，黄色至深棕色。因其形态随季节发生独特的变化，冬季为虫形夏季呈草状，故在我国称之为“冬虫夏草”(Pereira et at.,1943,New York J Medicine,1:128-32)。在日本称作Tochukaso.在亚洲不同地区还有蛹草(Cordyceps militaris),亚香棒虫草(Cordyceps haw)和香棒虫草(Cordyceps barnesii)等不同种的虫草品种。

冬虫夏草中的真菌为寄生菌，靠虫体提供营养生长而最后致虫以死命。其宿主是一种昆虫的幼虫，如虫草蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)，生活在高海拔低温度地区。随着纬度、海拔、及局部生态因子的不同，Hepialus属的其他种昆虫如Hepialusganggaensis也可被寄生性真菌感染而形成虫草。通常这类昆虫生活在地表下15-25cm，以食一些野草(如珠芽蓼、园穗蓼)的地下茎为生。这种昆虫在低于20℃时难以生长，从每年11月至来年4月在地下冬眠。正常情况下在3-4年内经6-8次蜕皮，经蛹而羽化为蛾。其生活周期中的各期，如幼虫期的长短、何时化蛹、何时羽化等，无不受温度影响。

从冬虫夏草(Cordyceps sinensis)中也分离出过有些属于子囊菌科(Ascomycetes)寄生性真菌的种或株，例如冬虫夏草头孢菌(Cephalosporium dongchongxiacao)，中国被毛孢(Hirsutellasinensis)，中国拟青霉(Paecilomyces sinensis)，蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)，蝙蝠蛾蛀霉(Scytalidium hepiali)等。夏季来临，真菌子囊散发孢子于地上，随雨水进入土壤，与虫子接触。经3-4次蜕皮的虫子最易被感染。在酶和机械力的共同作用下真菌进入虫体，菌丝生长遍布虫体。宿主变得脱水，通常在11月份因真菌菌丝繁殖而死亡。来年春天，温度再次升高，真菌的子实体从虫子的头部长出，出现在地面。光线促进子实体的生长，而真菌孢子的成熟约需50天(尹定华唐雪梅：中国中药杂志，20:707-709)。

传统上冬虫夏草在6-7月份从野外采集，阳光下晒干。虫草在中医传统上作为滋补药物应用，用于治疗多种疾病和机能失调。有一种补药的制法是用虫草炖鸡、鸭或肉，或者煮汤代茶。也可磨成粉加在食物中，或与其他补药(例如人参)配伍制成浸膏。

冬虫夏草的医药用途早在<本草从新>(公元1757年)已有记载。谓其味甘性温，归肺、肾经。中医认为其主要作用在于补肾，慢性哮喘和肺机能失调与肾虚有关。虫草还能补精生髓、祛痰止血保肺。也有认为虫草对癌症及结核病病人有益，能补益精气。还有用于治疗各种严重损伤及治黄疸和哮喘。

虫草在我国的主要应用包括减轻支气管炎症，治慢性气管炎、肺炎、肺气肿及结核病。其他用途包括治疗结核病人的痰中带血、病后虚弱、无力、贫血、盗汗、自汗及各种恶性病变。

为治疗病后虚弱，衰竭，贫血，盗汗，咳嗽或阳痿，虫草的传统用法为每剂6-9克，小火慢煎，日服两次。安神、守敛也用此剂量。虫草也被认为有滋补肺、肾(包括生殖腺，如睾丸、卵巢，及肾上腺)作用。

虫草资源稀少，虫与菌的关系独特；但应用广泛，需求量大，有必要对其营养学及药理学作用及其有效成分作深入研究。文献报道，用多种疾病及代谢的动物模型可知虫草有广泛的生理学作用。例如孙云汉，1985，中药通报10(12)3-5；Tsunoo et al.，日本真菌学会第3次国际讨论会文集，1985年11月30日至12月，日本，千叶县，自然历史博物馆和研究所；Chang and But,“Pharmacology andApplication of Chinese Materia Medica”,1,410-413(Philadelphia,World Scientific,1986)。

另一种虫草，蛹草(Cordyceps militaris)能大量产生一种代谢产物--虫草菌素(cordycepin)(Cunningham et al.,1951,J.Chem.Soc.,2299；Kredich et al.,1960,Biochem.Biophys.Acta,41:363-365)。它是一种腺嘌呤核苷，含一个带侧碳链的3-脱氧戊糖，可从蛹草培养物的乙醇或正丙醇提取物中结晶出来。虫草菌素有抗微生物作用(Cunningham et al.,1960,Nature,166:949)，抗肿瘤作用(Jagger et al.,1961,Cancer Res.,21:216)。虫草菌素及冬虫夏草(Cordyceps sinensis)的乙醇提取物能抗枯草杆菌(Bacillus subtilis)但不能抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶血链球菌(Streptococcus homiletics)、粪链球菌、败血性巴斯德(Pasteurella septica)、产气荚膜杆菌(Bacillus welchii)及变形杆菌。

由于虫草可能具有如此重要的药用价值，揭开这个传统草药的神秘面纱显得十分有意义。据信，虫草的各种有益的作用是因为它的多种已知和未知的有效成分，但还没有一种已被确定与某种特定的生理效应相关。因此有必要进一步了解这些有效成分的基础生化和其对人体各种生物系统的作用方式。

由于其药用价值以及资源稀少，各种产生虫草的方法已被研究过。其例有陈传盈，等的文章(中草药，1992,23(8):409-11)及一些人的专利申请(Nanying等：中国专利85101971,1985年4月1日申请；Dai等：中国专利CN1075402；Kuan等：中国专利CN1079653)。

在我国四川省，一组研究人员在1979-1986年对一种昆虫贡嘎蝙蝠蛾(Hepialus ganggaensis)的生物学和生态学进行了广泛的研究。他们发现了这种虫子的最适生长和繁殖条件。最后，他们可以在低海拔的实验室繁殖此虫，其生活周期从3-4年缩短到约1年。虫子的成活率从野生的3-5％增加到40％。曾用一种寄生性真菌中国被毛孢(Hirsutlla sinensis)的孢子人工感染此虫，而此菌最初也是从冬虫夏草(Cordyceps sinensis)中分离出来的。实验室得到的真菌性物质在形态上与天然虫草相似(尹定华唐雪梅：中国中药杂志，20:707-709)。

然而从虫草Codyceps sinensis分离寄生菌且不用宿主来培养则十分困难，因为生长很慢而且有特殊的营养需要。分离出来的菌形态上不一样，但其化学组分及药理性质似乎相近。也有报道，从Codycepssinensis中分得一菌可以在实验室培养，不必用孢子感染活的虫子(高俊德，等：中药通报，1981,6:3)。将其放在含有葡萄糖、蛋白及昆虫干粉的培养基中，26℃、pH6.8、搅拌培养15天，可以得到菌丝体。

实际上，维持和补充大量死虫先要化几个月在人工气候下饲养大量活虫子，这既麻烦又不经济。从商业上来说，用含有死虫子的东西作为药品或食品添加剂也不太受欢迎，尽管说这种东西有益于健康。因此对这种有益真菌仍迫切需要有一种能满足GMP标准的大规模商业生产方法。

此外，为了开发虫草和它的有效成分作为安全、有效的药物应用于临床，或作为一种食品添加剂供应市场，也需要大量和稳定的虫草类真菌物质。在本发明之前，大规模生产虫草发酵产物且其能产生与天然虫草相似有效成分的方法尚未被彻底研究及最适化过。本发明用大规模发酵方法生产虫草菌丝体，所得的现代化产品具有可重复的营养方面和医药方面的优点。

本发明涉及制备蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)，特别是Cs-4菌株(Paecilomyces hepialiChen et Dai)发酵产物的新方法。用本发明得到的虫草发酵产物能用于药品及食品配方中，使之能预防和治疗哺乳动物特别是人类的多种疾病和失调。这些配方还能用于维持老年人的最适健康及促进病后恢复期病人恢复精力。

本发明部分地根据以下发现而完成，即蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)的发酵产物含有有效成分，其药理和营养作用与天然虫草(Codyceps sinensis)相似。本发明的方法不用昆虫作宿主。本发明的方法可生产大量虫草发酵产物，它具有多种生理活性物质，其生产周期较使用昆虫作宿主的其他方法短得多。按照发酵规模大小，在约3-20天内，用本发明的方法可重复性地生产高产量优质的虫草发酵产物。例如，用本发明的方法已得到含腺嘌呤核苷及甘露醇较高的产品。本发明的方法符合GMP标准，所得产物适用于作为药品、保健品及食品添加剂。按照本发明，虫草发酵产物可做成各种剂量和组合物。

由本发明生产的虫草发酵产物，例如Cs-4发酵产物，可作为一种天然食品添加剂，或一种药品在哺乳动物治疗或预防多种疾病，包括(但并不限于)高血脂症、心血管疾病、脑血管疾病、高血压、肺疾病、肾疾病、生殖功能紊乱和免疫功能紊乱。

用本发明的方法生产的产物还可用于改善或维持正常个体的最适健康，特别是对于老年人及病后恢复者。

图1示出了本发明的Cs-4菌株发酵过程。

本发明涉及虫草(Paecilomyces hepiali)发酵产物，特别是Cs-4菌株(Paecilomyces hepiali Chen et Dai)发酵产物的制备方法。本发明的发酵产物可用于药物组合物及食品组合物，这些组合物可用于治疗及预防多种疾病和功能失调，还可用于促进和维持正常个体(特别是老年人和病后恢复期)的最适健康。

本文所用的术语“虫草发酵产物”是指蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)的一种或多种菌株的菌丝体发酵过程的产物。此处所用的“Cs-4菌”、“Cs-4菌株”专一地指发酵前的蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌株(Paecilomyces hepiali Chen et Dai)，而“Cs-4产物”、“Cs-4发酵产物”及诸如此类的术语则指蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌株的菌丝体发酵产物。

本发明所用的真菌是从冬虫夏草(Codyceps sinensis)中分离得到的，属于蝙蝠蛾拟青霉种(Paecilomyces hepiali)。具体来说，蝙蝠蛾拟青霉的菌株中被证明对本发明特别有用的菌株是Cs-4菌株。Cs-4菌株已于1997年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0327。Cs-4菌株，即Paecilomyces hepiali Chen et Dai，最初系从我国青海省化隆县海拔3800米山上的天然虫草(Codyceps sinensis)中分离和选育所得。

现将Cs-4的形态叙述于下。当把Cs-4培养于马铃薯-葡萄糖-琼脂(PDA)培养基，于26℃培养约1个月，从疏松的棉絮状气生菌丝上形成单个或簇状孢梗束。孢梗束起初为白色，随时间慢慢变成黄色。气生菌丝为黄至橙色，有时呈深橙色。在显微镜下，菌丝透明而有中隔。菌丝直径为2毫微米-2.5毫微米，具有单生、对生或轮生的瓶状小梗。一些瓶状小梗(4.5-7毫微米×2-2.5毫微米)排列成刷状结构。瓶状小梗上的分生孢子形状接近圆形(2.4-2.5毫微米×2.2-2.6毫微米)，光滑，串状排列。在不断搅拌的液体培养时，分生孢子可以为圆形或椭圆形(5-6毫微米×2-2.2毫微米)。

虽然诚如下文就要解释的，本发明主要涉及的是Cs-4菌株，但蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)的其他株包括Cs-4的变种、突变种也可能产生生理学上有效的物质，因此在本发明中也包含了他们的应用。从文献可知，真菌(例如蝙蝠蛾拟青霉)的许多性质不是一成不变的。真菌可能发生变异，或经自然选择，也可按文献报道的方法进行人工选择。因此必须注意到，蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)的变种和突变株，可能产生与Cs-4发酵产物相似的生理学性质，因此本发明对之也适用。

本发明部分地根据以下发现，即蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)的发酵产物含有有效成分，其药理和营养作用与天然虫草(Codyceps sinensis)相似。

已发现天然虫草和本发明产生的虫草发酵产物至少含有七类基本的天然产物：1．蛋白质，多肽，氨基酸以及胺类；2．多糖及糖的衍生物；3．甾醇类；4．核苷类；5．脂肪酸及其他有机酸；6．维生素类；7．无机元素。

虫草发酵产物含有人体所需的所有必需氨基酸，还含有特殊的环二肽。例如，环-(甘-脯)肽，环-(亮-脯)肽，环-(缬-脯)肽，环-(丙-亮)肽，环-(丙-缬)肽以及环-(苏-亮)肽。

从虫草发酵产物中分离出来的甾醇包括麦角甾醇，Δ³-麦角甾醇，麦角甾醇过氧化物，β-谷甾醇，daucosterol和campasterol.在天然虫草和虫草发酵产物中已发现的核苷类化合物有十一种，Cs-4中主要为腺嘌呤核苷，腺嘌呤，尿嘧啶，尿嘧啶核苷，鸟嘌呤核苷，胸腺嘧啶核苷和脱氧尿嘧啶核苷。已分离出二十八种饱和及不饱和脂肪酸及其衍生物。虫草发酵产物中的极性化合物包括许多烃类、醇类和醛类化合物。

从天然虫草及虫草发酵产物中已鉴定出数种维生素，例如维生素B₁,B₂,B₁₂,E和K。也鉴定出许多无机元素，包括钾，钠，钙，镁，铁，铜，锰，锌，Pi，硒，铝，镍，锶，钛，铬，钒及锆。虫草发酵产物中硒含量约0.21ppm，较天然虫草的0.0049高得多。

D-甘露醇及腺嘌呤核苷被用来控制发酵产物质量的有生物活性的标志分子。

本发明的虫草发酵产物通常为一种浅棕至深棕色的粉末，稍带苦味，并有芳香的气味。所用的蝙蝠蛾拟青霉真菌的菌株不同、发酵过程的参数不同、步骤不同、批次不同都可能使发酵物的颜色和/或气味稍有差异。

本发明提供了制备虫草发酵产物的新方法，包括培养一种属于蝙蝠蛾拟青霉的真菌，然后从培养物中找出发酵产物中含有的生理活性物质。

根据本发明，蝙蝠蛾拟青霉菌的各种菌株(特别是Cs-4菌株)可用于上述的发酵过程。从冬虫夏草分离出来的真菌的菌丝体发酵的已知方法，已经用现代化发酵技术和设备进行了改进，从而能更精确地控制温度，酸碱度及其他发酵参数。本发明将发酵时间减少到2-20天(因发酵的规模而异)，并增加了产物的产量和效能。其结果得到的虫草发酵产物符合GMP标准，适用于作为药品、保健品及食品添加剂。

本发明的方法可以用固体或液体培养基进行。本发明方法所用培养基含有真菌能利用的碳源、氮源和无机盐，不含从昆虫得来的物质。此外本发明所用培养基可能含有动物脂质。大规模发酵采用液体培养基。用本发明方法发酵，宜在有氧条件下进行。

通常作为碳源的可用醣类(例如葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、以及甘露醇之类)，淀粉(例如麦芽、燕麦、黑麦、玉米淀粉、玉米粉)等；可以单用或合用作为营养性介质中可利用的碳源。培养基中所利用碳水化合物源的确切数量部分地取决于其中其他组分的量，但一般说来碳水化合物的量为培养基重量的0.5％-10％，可以用1％-5％，最好为4％左右。这些碳源可以单独应用，也可将几种这样的碳源在培养介质中合并应用。例如培养基可以含有1-4％的葡萄糖和蔗糖。

在发酵过程中，通常可用许多蛋白类物质作氮源。适用的氮源包括蛋白胨、酵母水解产物、粗酵母、大豆粉、豆饼、棉籽粉(饼)、乳酪水解物、玉米浆、酒糟、花生饼、鱼饼、米糠、肉羔、硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵或马铃薯块之类。一般说来，氮源的用量为培养基的0.5％-5％，可以用1％-3％，最好在2％左右。

常用盐类可加到培养基中作为营养性无机盐，这些常用盐类能够产生钠、钾、铵、钙、磷酸根、硫酸根、氯、碳酸根等离子，培养基中还加入微量元素如钴，钼，锰，铁和镁。营养性无机盐的非限制性例子有碳酸钙，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钠和氯化钙。

必须注意，此处所举的培养基仅为可采用的许多培养基的一个例子而并非限制性的。可视实际情况及从经济方面的考虑(如发酵规模及这些物品的当地供应情况)，根据文献对其作各种改变。

本发明发酵过程的温度范围约为20℃-37℃；但要得到最好结果，发酵过程的温度应控制在24℃-25℃。为适于培养物生长并产生生理学活性物质，培养基的酸碱度(pH)为5.0-7.0，可用6.3-6.5，最适为约6.4。

虽然表层发酵和深层发酵都可以得到发酵产物，但最好用深层发酵。在进行通气及搅拌发酵时可以应用消沫剂，如硅油、植物油(例如0.01％豆油)，及其他表面活性剂。搅拌速度约每分钟150转，通气量约每小时1.8立方米。

发酵过程最初在消毒的培养瓶内进行，可以包括一级或多级种子培养。各级种子培养基都不含昆虫物质，可以有合适比例的碳源，氮源；以及如上所述的，还可以有动物脂质。大规模发酵采用液体培养基。

小规模培养可如下进行：将菌种(例如蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌株)接种于适当的培养基，使之在约24℃-25℃的恒温下生长5-6天。属于蝙蝠蛾拟青霉的混合菌株可用于接种最初培养物。最初培养物用于接种一个或多个一级种子。一级种子培养物于24℃-25℃培养2-3天，或直到真菌生长良好为止。此时，一些或全部培养物用于接种二级种子或用于发酵培养。种子培养可以重复进行，直到有足够的菌量供大规模发酵。中间几级种子基本上用同上方法产生，上一级种子瓶培养物用于接种下一级种子。通常接种后的培养瓶于约24℃-25℃培养2-3天，培养结束时收集瓶内的培养物。

大规模培养最好在适当的容器内进行。可用(但并不限于)带搅拌的反应罐，它能维持恒温、消毒培养液及反应罐、及给培养液通气。按照此法，培养液可在反应罐中配制，加热到约120℃进行消毒。冷却后，在消毒好的培养液中接种已生长良好的真菌培养物(例如种子培养物)，经一定时间发酵(例如5-6天)。此时要不断给培养液通气，并维持温度在约24℃-25℃。

发酵过程继续到培养液内积累了大量虫草菌丝体，通常为在发酵后5-6天。可用质量检测办法监控发酵过程。发酵结束后，用几种方法适当配合将虫草发酵产物从培养液中分离出来。例如，将培养物加热(例如用高压蒸汽)灭菌，过滤除去发酵液，得到主要为菌丝体的固体物质，然后烘干、磨粉。此粉可直接用于本发明所述的各种配方。图1为Cs-4发酵过程的一个实例。

有时干菌粉可进一步加工，即用有机溶剂提取。例如(但并不限于)，加乙醇(75％)以除去淀粉及/或琼脂。除去溶剂、干燥后，提取物可用于本发明所述的各种配方。这样得到的虫草发酵产物还可进一步用水、热水、有机溶剂(如乙醚或乙酸乙酯)提取，或溶于极性大一点的溶剂(如丙酮或乙醇)，或用一种溶剂(如石油醚或己烷)去除杂质，或用活性炭或硅胶进行吸附层析，或用葡聚糖柱(Pharmacia的Sephadex)进行凝胶过滤，等等。有机溶剂可用常规的方法从产品中除去。

在本发明的各种具体应用中，虫草发酵产物(特别是Cs-4的产物)可用于如上所述的药品及食品的配方，以治疗及预防多种疾病和功能失调，还可用于促进和维持正常个体(特别是老年人和恢复期病人)的最适健康。

前已论及，本发明提供了生产虫草发酵产物的方法，而虫草发酵产物则可用于治疗哺乳动物的许多疾病、功能失调和/或许多症状。除了治病之外，本发明的虫草发酵产物还可用于易患此类疾病、功能失调和/或症状的哺乳动物，起预防作用。此处所指的哺乳动物包括(但并不限于)宠物、家畜、牧畜等，但主要指人。

虫草发酵产物可用于改进多种与健康不良有关的身体条件，包括内因性的(如近期患病和老化)，外因性的(如应激和过劳)。虫草发酵产物也可用于促进和维持最适健康，使正常机体特别是老年人和恢复期病人恢复精力。

本发明的虫草发酵产物毒性极低，无致突、致畸性。用Cs-4虫草发酵产物所作的急性毒性表明，小鼠的口服半数致死剂量小得测不出。用大鼠进行了三个月的亚急性毒性实验，剂量为每公斤每天1,2或3克(相当于人用量的20,40或60倍)。给药组大鼠的体重增长、血象、肝功、肾功与正常对照组相同，各主要脏器未发现明显的病理形态改变。

小鼠给予Cs-4产物口服每公斤每天3、5或10克，(人剂量的60,100或200倍)共30天，未发现任何明显的不良反应。给药30天后主要脏器的显微镜检查表明，除了少数几只最大剂量(200倍人用量)给药小鼠的肾脏稍有肿胀外，其他均无异常。以相当于人剂量的3倍给予狗3个月，未见对体重、器官重量、生长、血液学及临床活性指标有不良影响。

本文所用术语“治疗有效量”表示在治疗和预防疾病、或在改善某人的一般健康和自我感觉良好方面足以提供好处的剂量。一般说来，能达到此处所述条件的Cs-4产物的每日剂量约0.1-30克，一次服用或分剂服用。最适每日量约3-6克。可用含0.33克的胶囊，每次3个每天3次口服，以达到所需的量。一疗程至少一周至数周。本发明的虫草发酵产物的应用，包括治疗和预防高血脂疾病、心血管疾病、脑血管疾病、高血压(遗传性及非遗传性)、肺部疾病、肾疾病、生殖功能紊乱、免疫功能失调或这些情况的合并存在；包括给予哺乳动物有效量的虫草发酵产物或含有所述产物的组合物。

本文所用的心血管疾病例子包括心肌梗塞、冠心病、动脉粥样硬化、动脉硬化；脑血管疾病的例子包括中风及脑血栓。虫草发酵产物可用于治疗或预防哺乳动物(主要指人类)的高脂血疾病，例如高胆固醇血症及高甘油三酯血症。虫草发酵产物也可用于调节血清脂质和脂蛋白水平，如(但并不限于)胆固醇、甘油三酯及高密度脂蛋白，以使其水平维持在正常健康人范围。本发明的虫草发酵产物用于治疗哺乳动物的肺疾病，如慢性支气管炎及哮喘；也可用于缓解肺部疾病的有关症状和促进健康的肺功能，如减轻支气管通道的炎症、松弛支气管平滑肌、镇咳祛痰。在动物实验，Cs-4(每公斤体重6克，灌胃)促进气管分泌，有祛痰作用。促进分泌作用在给予Cs-4后第二小时达到高峰。Cs-4(每公斤体重5克，灌胃)在氨气引起的小鼠咳嗽模型有减少咳嗽次数的作用。Cs-4也减少组织胺引起的气管收缩。豚鼠腹腔注射Cs-4(1.74克/公斤)延缓了乙酰胆碱引起的气管收缩的发作。Cs-4也抑制肾上腺素引起的小鼠急性肺水肿，延长了存活时间。在松弛气管的持续性收缩方面，菌丝体产物的作用较野生的虫草为强。

虫草发酵产物也能改善人的肾功能，特别是在慢性肾炎，慢性肾功能衰竭及肾病综合征患者。

虫草发酵产物的另一个应用为治疗男、女性性功能低下。与男性性功能低下有关的症状包括阳萎、遗精、早泄及缺乏性欲；在女性包括月经不调、白带过多及性欲缺乏。

虫草发酵产物有降血糖作用，故有可能用于控制病人的血糖过高，治疗糖尿病。

虫草发酵产物也能用于促进哺乳动物的免疫系统，增强某亚类免疫细胞的活性及增加抗体的产生。

冬虫夏草及虫草菌丝体培养产物在实验室已被证明对免疫系统有影响。它增加小鼠的脾脏重量，对抗皮质类固醇及环磷酰胺引起的脾脏减轻(陈道明，等：中西医结合杂志，1985,5:42-45)。它明显增加巨噬细胞的吞噬作用和天然杀伤细胞的活性(张淑兰，等：中西医结合杂志，5:45-47)。在小鼠，冬虫夏草及其组分增加血清IgG水平，刺激B细胞和T细胞的有丝分裂活性。此外，它对一些淋巴细胞亚类表现为促进作用而对另一些亚类则为抑制。总的说来，它在体外的细胞毒性很低，体内毒性也很低；它不影响骨髓及脾脏产生红细胞。

虫草发酵产物也能用作辅助治疗，用于减轻肿瘤病人的放疗和化疗的副作用。

按照本发明的方法生产的虫草发酵产物能用作药品来治疗哺乳动物，特别是有气短、呼吸微弱、嗜睡、头晕、四肢发冷、耳鸣等症状的病人及老年体虚者。虫草发酵产物能用于食品添加剂以使病人及常人(特别是老年人及恢复期病人)增强和恢复体力、精力和元气。因此Cs-4产物给机体提供维持最适健康和身体情况的方法，仅管存在内部的(如年老或近期患过病)和外部的(如应激和过劳)有害因子。此食品添加剂也可预防或减轻上述疾病、症状和反应。

虫草发酵产物特别有利于体育运动员和积极从事体育活动的人增强体力、耐力和精力。

虽然虫草发酵产物的上述治疗作用及增进健康的效能究竟如何产生和为什么会产生难以用任何一种理论来说明，但它有可能是通过促进应激条件下更有效地利用氧气，增加组织的“稳态”能量水平和增加重要脏器的血流来实现的。因此它可使在少氧或无氧环境下动物存活时间较长。在动物实验，用异丙肾上腺素引起缺氧3-20分钟后给予Cs-4(腹腔注射每公斤5克或口服每公斤10克)，小鼠的氧消耗大大下降，存活时间延长。平均存活时间在腹腔注射组达67分钟，口服组达49分钟。缺氧环境下Cs-4引起的氧消耗减少及存活时间延长可以解释为对低氧环境的适应性增强。在另一个实验，皮下注射Cs-4(每公斤5-20克)使低温环境下小鼠存活时间延长到51.6-100.5分钟，且有剂量-效应关系。

一般说来，组织中外源性⁸⁶Rb量可反映其营养性血流量。小鼠皮下注射Cs-4(每公斤10-20克)明显增加心、脑的⁸⁶Rb量。给予大剂量Cs-4的小鼠，其心脏⁸⁶Rb平均增加114％，脑增加45.7％。

在预防和治疗疾病及维持老年人和病后恢复期者的最适健康时，虫草发酵产物(例如Cs-4产物或含有Cs-4产物的组合物)的剂量可因个人情况和疾病的严重性而异。剂量及用药次数也可因年龄、体重及病人的反应而有所不同。

总的说来，用液体制剂可以于此处所述各种情况时，Cs-4产物的每日剂量范围约为0.1克至约30克(一次或分次服用)。较合适的剂量范围是约1克至约20克，最好为3克至6克。例如，口服含有Cs-4产物0.33克的胶囊，每次3个，每天3次。一疗程至少1至数周。如文献报道，在某些情况下剂量可能会超出这些范围。作为食品添加剂应每天服，持续一段时间，在此基础上可长期服用。每天剂量可从约0.1克-10克；较合适的是约1克至约6克；最好为每天约2克至约4克。此外营养学家，饮食调理师，临床医生会根据个体的反应提出何时中断、调整或终止治疗。

虫草发酵产物或按照本发明由其提取得到的提取物可以用于药物组合物和食品组合物中。这些配方中可以含有制药上允许使用的载体或赋形剂，有时还可有其他组分。

有虫草发酵产物(包括Cs-4)的药物组合物或食品组合物中可以有的其他组分包括但不限于维生素、抗氧化剂、氨基酸、金属盐、矿物质、肉汁、蔬菜汁及增味剂。作为口服应用，含有虫草的组合物可以直接加到食物中，使得有效治疗量的虫草能在正常进餐时被摄取。将Cs-4加到天然的或已加工过的食品中可以采用文献报道的任何方法。

本发明提出的组合物作为口服用，可以是单一剂型的分散的固体如胶囊、药片、扁囊剂(cachet)，每一个中含一定量的虫草发酵产物粉或颗粒；或为一种溶液或水悬浮液；一种非水的液体；一种水包油的乳剂或一种油包水的乳剂。通常，这类组合物的制备可以是将活性组分和液态载体、或分得很细的固态载体、或此两种载体，一起均匀而完全地混合，然后有必要的话就将产品外形做成所要的形状。

这样的药物组合物或食品组合物可以另外加入粘合剂(如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)，填料(如乳糖、戊聚糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)，润滑剂(硬脂酸镁、滑石或硅粉)，崩解剂(马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)，湿润剂(如月桂酸硫酸钠)。药片或胶囊可按文献的方法褂衣。

口服的是溶液、糖浆或悬浮液；或制成干燥产品临服前加水或其他适当的媒质冲服。这类液体制剂可用通常的方法制备，可加药用添加剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非液体媒质(如杏仁油、油酯、乙醇或精制的植物油)；防腐剂(如甲基或丙基对羟苯甲酸或山梨酸)。这类制剂还可制成为人造食品，含有适量的缓冲盐，增味剂，着色剂以及甜味剂。

为给病人提供有效量的虫草发酵产物可以采用任何剂型。包括片剂、胶囊、散剂、悬浮剂、溶液等等。因为使用方便，片剂和胶囊是最好的服用剂型，此时采用上述的固体药用载体。除上述普通剂型外，本发明的产品也可采用控释方法。然而最适的固体口服制剂是胶囊。

片剂要用模压制备，还常加一种以上辅助性组分。制片时虫草产物为粉状或颗粒状，通常要加填料，润滑剂，惰性稀释剂，表面活性剂或分散剂，混合后用适当的机器压成型。最好做成胶囊，含约0.3克Cs-4粉。

本发明将参考下述实施例加以描述，实施例详细描述了研究虫草的效能和安全性的临床试验。显然，对材料和方法可以作许多改变，这些都包括在本发明的范围内。实施例1

本例提供了本发明的生产虫草发酵产物发酵方法的实例。此方法包括一系列按次序进行的培养和发酵，需时约16天。其后约需3天对发酵产物进行处理。一级种子培养如下进行：

1．培养基：在总量2升水中，加入如下物质：

    葡萄糖    40克

    蔗糖      40克

    蛋白胨    10克

    麦麸(注)  100克

    磷酸二氢钾    3.0克

    硫酸镁        1.5克

注：5％麦麸，水煮30分钟，用纱布过滤取滤液。

2．20个500毫升培养瓶，每个加100毫升培养基，灭菌，放冷至25℃，酸碱度为6.4。

用Cs-4斜面菌种接种于每个瓶中。

3．接种的培养物于25℃培养4天，摇床速度每分钟90转。二级种子培养如下进行：

1．培养基：在总量20升水中，加入物的比例同上述一级种子：

    葡萄糖       400克

    蔗糖         400克

    蛋白胨       100克

    麦麸         1000克

    磷酸二氢钾   30克

    硫酸镁       15克

2．20个5升培养瓶，每个加1.0升培养基，灭菌，放冷，将上述Cs-4一级种子逐个接种于每个瓶中。

3．接种的二级种子培养物于25℃培养4天，摇床速度每分钟90转。一级种子罐(300升)发酵如下进行：

1．发酵培养基：总量200升的水中加入：

    葡萄糖    2％4000克

    蔗糖      2％4000克

    豆饼粉     2％       4000克

    磷酸二氢钾 0.15％    300克

    硫酸镁     0.075％   150克

    大豆油     0.01％    20毫升

2．培养基灭菌，放冷至25℃，酸碱度6.4。

3．将20升Cs-4级种子加于发酵罐中。

4．于23℃发酵3天，搅拌速度每分钟150转，通气每小时1.8立升。大规模发酵(3吨发酵罐)如下进行：

1．发酵培养基：总量2000升水中，加入：

    葡萄糖    2％       40公斤

    蔗糖      2％       40公斤

    豆饼粉    2％       40公斤

    磷酸二氢钾0.15％    3公斤

    硫酸镁    0.075％   1.5公斤

    大豆油    0.01％    200毫升

2．培养基灭菌，放冷至25。

3．将200升一级种子罐的培养物加到发酵培养基中。

4．于23℃发酵，搅拌速度每分钟150转，通气每小时20立升。

5．第5天在显微镜下检查发酵物中的菌丝体含量。见到菌丝体有小气泡形成且有少量孢子，终止发酵，得到发酵物1.6吨。发酵物于每分钟2000转离心30分钟。

6．离心后得到的菌丝体于90℃干燥3天，磨粉，得到约50公斤Cs-4菌丝体粉。

7．对虫草发酵产物的分析表明，其腺苷含量为0.14％，甘露醇7.04％。

这样得到的虫草发酵产物可用于上述药物组合物和营养组合物。实施例2

本例描述Cs-4发酵产物用于治疗高血脂症病人的临床试验以观测其疗效。

273例高脂血症病人随机分为两组。一组服用Cs-4发酵产物，另一组服安慰剂作为对照。其中Cs-4发酵产物制成胶囊，每胶囊含Cs-4发酵产物0.33克。结果

临床试验结果见表1至表3。资料表明，服Cs-4发酵产物的高脂血病人与对照组病人相比，血清脂质有了好转。由表1可见，服Cs-4发酵产物的病人血清胆固醇低于对照组病人。表2表明，服Cs-4发酵产物的病人血清甘油三酯也较对照组低。表3说明，服Cs-4发酵产物组病人的血清高密度脂蛋白升高。

表1．Cs-4发酵产物对高脂血症病人血清胆固醇含量的影响

组别	例数	血清胆固醇含量	(毫克/100毫升)	p值
					对照组Cs-4发酵产物组	93122	治疗前258±42268±59	治疗后246±47231±50	＞0.05＜0.001

表2．Cs-4发酵产物对高脂血症病人血清甘油三酯含量的影响

组别	例数	血清甘油三酯含量	(毫克/100毫升)	p值
					对照组Cs-4发酵产物组	118127	治疗前263±104328±203	治疗后253±114280±182	＞0.05=0.05

表3．Cs-4发酵产物对高脂血症病人血清高密度脂蛋白含量的影响

组别	例数	血清高密度脂蛋白含量	(毫克/100毫升)	p值
					对照组Cs-4发酵产物组	2926	治疗前41±7.239±7.5	治疗后44±7.746±11.8	＞0.05＜0.01

上述结果说明，虫草发酵产物可用于调节人的血清脂质和脂蛋白(例如，胆固醇，甘油三酯和高密度脂蛋白)含量，使其维持在健康的水平。

虽然可以对本发明的上述公布材料进行修改，但根据在下述的专利要求可知，这种修改也属于本发明范围之内。

Claims (16)

1．一种生产虫草发酵产物的方法，包括在有氧条件下用一种不含昆虫物质的培养基使蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌株发酵，并从培养物中得到虫草菌丝体。

2．一种生产虫草发酵产物的方法，包括：

(1)在一种不含昆虫物质的培养基上，接种至少一种属于蝙蝠蛾拟青霉真菌菌株，并在约24℃的有氧条件下培养约2-5天；

(2)在不含昆虫物质的新鲜培养基、约24℃的有氧条件下培养此菌约2-5天；

(3)重复步骤(2)使能得到足够的菌量，以开始用发酵罐进行大规模的虫草发酵；

(4)在大规模的发酵罐中，从步骤(3)，用不含昆虫物质的新鲜培养基，在约24℃的有氧条件下培养此菌约5天；以及

(5)除去培养基，将虫草菌丝体干燥，得到虫草发酵产物。

3．根据权利要求2的方法，其中发酵是采用蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌株进行。

4．根据权利要求1或2的方法，其中发酵在酸碱度为约6.2至6.4时进行。

5．根据权利要求1或2的方法，其中培养基含有葡萄糖和蔗糖，其浓度各为约2％。

6．根据权利要求1或2的方法，其中发酵是在温度约24℃时进行。

7．根据权利要求1或2的方法，其中发酵是在约2天至20天时间内进行。

8．一种适于哺乳动物口服或胃肠外给予的药物组合物，包含有效量的由Cs-4发酵得来的虫草发酵产物及一种赋形剂。

9．一种适于哺乳动物口服或胃肠外给予的营养品组合物，包含有效量的由Cs-4发酵得的虫草发酵产物及一种赋形剂。

10．权利要求8或9的组合物，其中所述的组合物为适于作口服的胶囊剂、片剂或扁胶囊。

11．权利要求8或9的组合物，其中所述的组合物为适于作口服或胃肠外给予的悬浮液，溶液或其他适当的释放系统。

12．权利要求8或9的组合物，它还含有至少一种维生素或增味剂。

13．一种药品，它含有权利要求1或2的方法生产的虫草发酵产物约0.3克。

14．一种用作食品添加剂或药品的合成性虫草发酵产物，其中所述的发酵产物是用权利要求1或2的方法生产的。

15．蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌株，其于1997年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号为CGMCC NO.0327。

16．一种固体剂型，它含有约100毫克至600毫克的Cs-4发酵产物及一种药用赋形剂。